Method Article

حقن الحوض الكلوي الهيدروديناميكي للتعبير غير الفيروسية من البروتينات في الكلي

DOI:

10.3791/56324

⸱

January 8th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Veterans Affairs, Tennessee Valley Healthcare System, 2Departments of Medicine and Pharmacology, Vanderbilt University Medical Center, 3Department of Medicine, Baylor University College of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويصف هذا البروتوكول طريقة لحقن بلازميد الحمض النووي الكلي الماوس عبر الحوض الكلوي لإنتاج التعبير التحوير على وجه التحديد في الكلي.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حقن هيدرودينامية يخلق بيئة محلية، والضغط ترانسفيكت الأنسجة المختلفة مع بلازميد الحمض النووي وغيرها من المواد. حقن الوريد هيدرودينامية الذيل، على سبيل المثال، هو أسلوب راسخة التي يمكن ترانسفيكتيد في الكبد. ويصف هذه المخطوطة تطبيق المبادئ هيدرودينامية بالحقن الكلي الماوس مباشرة مع بلازميد الحمض النووي للتعبير الجيني الخاصة بالكلى. تم تخديره من الفئران والكلى يتم كشفها بواسطة شق الجناح متبوعاً حقن سريعة بلازميد الحل التي تحتوي على الحمض النووي مباشرة في الحوض الكلوي. ويحتفظ الإبرة في مكان لمدة عشر ثوان وهو خياطة شق الموقع. يعيش في اليوم التالي، تصوير الحيوان أو لطخة غربية، أو immunohistochemistry قد تستعمل للاعتداء التعبير الجيني أو فحوصات أخرى مناسبة للتحوير لخيار تستخدم للكشف عن البروتين للفائدة. أساليب المنشورة لإطالة أمد التعبير الجيني تشمل المعاملة التكامل والسيكلوفوسفاميد التحوير بوساطة ينقول تكبح الاستجابة المناعية للتحوير.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقنية حقن الوريد ذيل هيدرودينامية أصبحت وسيلة شائعة لتحقيق مستويات عالية من التعبير الجيني في الماوس الكبد1،2. هي أيضا transfected الكلي بهذا الأسلوب على مستوى أقل بكثير، حوالي 100-fold أقل3. حقن الحوض الكلوي هيدرودينامية الموصوفة هنا يوفر طريقة بسيطة للتحكم في خصوصية التعبير الجهاز من خلال الوسائل المادية باستخدام نفس المبادئ هيدرودينامية التي وضعت سابقا في الكبد4،5 ، العضلات6و7،أجهزة أخرى8. هذا الأسلوب ترانسفيكتس الخلايا في الحيوانات الحية ف....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجان (إياكوكس) من كلية بايلور للطب والمركز الطبي بجامعة فاندربيلت.

1. إعداد الحل الحمض النووي لحقن

  1. حدد plasmid(s) للتعبير عن transgene(s) بعناية لتحقيق أقصى قدر من الخصائص المرغوبة لتحسين كفاءة تعداء والتعبير التحوير.
    ملاحظة: تم حقن الحوض الكلوي هيدرودينامية والبلازميدات للتعبير عن علامة نيون تدتوماتو وهرمون الاريثروبويتين (Epo) لوسيفراس اليراع هو موضح سابقا11. إذا لم يكن هناك مقايسة متطور لكفاءة تعداء للتحوير، إجراء تصوير الحيوانات الحية من لوسيفراس بإدخال 10 ميكروغرام من بلازميد معربا عن لوسيفراس مثل لوسيفراس اليراع المعززة للحمض المخف....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقنية الجراحة وحقن بسيطة لأداء يتقن مرة واحدة، تتطلب لا معدات رئيسية أو مواد مكلفة. يوم واحد من التدريب على الفئران عدة المقرر للقتل الرحيم إذا جديدة إلى جراحة الكلي شق الجناح، ينبغي أن يسمح فيها الفئران ليست الجراحة التالية تم استردادها لأن المحاولة الأولى في هذه العملية قد تستغرق وقتاً أطول من المعتاد. بدلاً من ذلك، قد يجد المحققون على دراية بتقنيات مشابهة بسيط جداً. اتبع بعناية في التوضيح في الشكل 1 والاتجاهات التصويرية في الشكل 2

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويرد في هذا البروتوكول وسيلة قوية لتحقيق التعبير الجيني استنساخه على وجه التحديد في الكلي. في أيدي جراح معتدلة من ذوي الخبرة وجدنا النسبة المئوية للفئران ترانسفيكتيد بهذا الأسلوب في نطاق 50-100 ٪، تبعاً للعمر الماوس وحساسية قراءات للتحوير. مستوى التعبير الجيني لوسيفراس فوق الخلفية لعدة أشهر في الفئران تلقي ترانسبوزونات بيجيباك والمحافظة تماما لعدة أسابيع في الفئران المناعة تلقي ترانسبوزونات نفسه11. بينما العديد من الخلايا الملون الزاهية للتحوير في المناطق القريبة من موقع الحقن، كفاءة تعدا.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفين لا علاقة تكشف وتعلن عدم تضارب المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جائزة تطوير المهنة من إدارة شؤون قدامى المحاربين [BX002797] دعم L.E.W. والمعاهد الوطنية للصحة [R01-DK095867] و "جمعية القلب الأمريكية" [15GRNT25700209] دعم كيركراده المعاهد الوطنية للصحة [DK093660]، وإدارة شؤون قدامى المحاربين في [BX002190]، ومركز فاندربيلت "أمراض الكلي" الدعم M.H.W. هذه المواد هو نتيجة للعمل مدعومة بالموارد واستخدام المرافق في "نظام الرعاية الصحية وادي تينيسي خامسا".

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AnaSed XylazinePatterson Veterinary07-808-1947مخدر - مادة غير خاضعة للرقابة
حقنة الأنسولين 0.5 مل 29 جم 1/2 بوصةصحة الكاردينال309306المحاقن المطلوبة
Buprenexصيدلي / طبيبتسكين - مادة خاضعة للرقابة
Dynarex ثنى منشفة يمكن التخلصمنها Thermo Fisher Scientific19-310-671ضع فوق وسادة الحرارة
EndoFree Plasmid Maxi KitQiagen12362استخدم فقط البلازميد الخالي من السموم
الداخلية Endosafe Gel-Clot LAL التحكم الإيجابي السريعتشارلز ريفرPC200تحكم إيجابي لاختبار السموم
الداخلية Endosafe Gel-Clot LAL قارورة اختبار فردي سريعتشارلز ريفرR13500اختبار السموم
الداخلية مقص تشريح دقيق فائق الدقةRoboz Surgical أداةRS-5882أداة جراحية
Fisherbrand حقيبة تعقيم الختم الفوري - 9 "Thermo Fisher Scientific01-812-51للتعقيم بالكهرباء للأدوات الجراحية
Gaymar Heat PumpParagon MedicalTP-700حرارية متداولة بالمياه
500Roboz Surgical InstrumentDS-401لإعادة استخدام الأدوات الجراحية أثناء الجراحة
Graefe الملقطRoboz الأداة الجراحيةRS-5136أداة جراحية
Graefe الأنسجة ملقطRoboz الأداة الجراحيةRS-5153أداة جراحية
Halsey Needle Holder ، 5 "طولRoboz الأداة الجراحيةRS-7841
أداة جراحية وسادات حرارية - 15 × 21 " - تحتاج إلى 3Paragon MedicalTP22Gعلى الأقل للاستخدام مع مضخة
حرارية GaymarIsoFlo (Isoflurane ، USP)Abbott Animal Health5260-04-05للتصوير والقتل الرحيم
Isotec Isoflurane Delivery System VaporizorSmiths MedicalVCT3K2للتصوير والقتل الرحيم
صيدلي الكيتامين/ طبيبمخدر - مادة خاضعة للرقابة
KimwipesKimberly-Clark Professional34120مناديل
برنامج الصور الحيةالفرجار علومالحياة للتصوير الحي للحيوانات
الحية لوسيفيرينبيركين إلمر122796للتصوير الحي للحيوانات
الحية Nanodrop 2000Thermo ScientificND-2000-US-CANمقياس الطيف الضوئي لقياس الحمض النووي
مسحات PrevanticsThermo Fisher Scientific23-100-110لجراحة الجلد الإعدادية
Prolene 5-0 خيوط جراحية تفتق 30 بوصةThermo Fisher ScientificNC0256891خيوط غير قابلة للامتصاص للبشرة
Puralube العلامة التجارية مرهم بصريباترسون بيطري07-888-2572للحفاظ على رطوبة العينين أثناء الجراحة
Trans IT - حل التوصيل الهيدروديناميكي QRMirus BioMIR-5240عازلة التوصيل الهيدروديناميكية لتخفيف الحمض النووي
Vicryl 5-0 خيوط J303HThermo Fisher ScientificNC9816710خيوط قابلة للامتصاص لطبقة العضلات
Wahl Mini Arco ClipperMed-Vet International8787-1550ماكينة حلاقة لإعداد الجلد
Xenogen IVIS 200Caliper Life Sciencesللتصوير الحيواني الحي
BD بيطري مضخة بيطري المختبر

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6 (7), 1258-1266 (1999).
  2. Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High levels of foreign gene expression in ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hydrodynamic InjectionRenal PelvisKidney TransfectionPlasmid DNALive Animal ImagingWestern BlotImmunohistochemistryFlank IncisionSurgical ProcedureGene Expression

Related Articles