Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

ללא תא הביוכימי Fluorometric Assay אנזימטי למדידה תפוקה גבוהה של שומנים בדם Peroxidation של ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה

Published: October 12, 2017 doi: 10.3791/56325
Automatic Translation
1, 1, 2,3, 2, 1,4, 2,4, 1
1University of California, Los Angeles, 2Centre for Biomedical Research, Burnet Institute, 3School of Health and Biomedical Sciences, RMIT University, 4Department of Infectious Diseases, Monash University

Summary

נתאר כאן fluorometric assay ללא תא הביוכימי לקביעת ה-HDL-השומנים peroxidation. זה מהיר ולא לשחזור assay יכול לשמש כדי לקבוע פונקציה HDL במחקרים בקנה מידה גדול והוא יכול לתרום להבנת פונקציית ה-HDL מחלות אנושיות.

Abstract

רמות הכולסטרול (HDL-C) ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה נמוך הם אחד החזקים ביותר מנבאות שלילי עצמאית של מחלות לב וכלי דם טרשת עורקים (CVD). המבנה והתפקוד של HDL יותר מאשר ה-HDL-C אולי יותר לחזות במדויק טרשת עורקים. מספר ה-HDL חלבון ו ליפיד ההלחנה שינויים שפוגעים פונקציית ה-HDL להתרחש במצבים דלקתיים כגון טרשת עורקים. פונקציית ה-HDL נקבעת בדרך כלל לפי תא מבוסס מבחני כגון כולסטרול בזרימת assay אבל אלה מבחני יש חסרונות רבים, היעדר סטנדרטיזציה. מבחני ללא תא עשוי לתת באמצעים חזקים יותר של פונקציית ה-HDL לעומת מבחני מבוססת-תא. HDL חמצון פוגע פונקציית ה-HDL. HDL יש תפקיד מרכזי בהעברה חמצן השומנים, כמות גבוהה של שומנים בדם משתכים שטח ניקוי קשורה לתפקוד נורמלי של HDL. השומנים-בדיקה אינטראקציות להתייחס כאשר מבחני הנמצאות לפרש את התוצאות של זריחה אנזימטי למדידת מצב חמצון השומנים. זה הניע אותנו לפתח שיטה אנזימטי ללא תא ביוכימי כדי להעריך את ה-HDL חמצן תוכן שומני (HDLox) אשר תורם בתפקוד ה-HDL. שיטה זו מבוססת על peroxidase חזרת את האנזים (HRP) ו fluorochrome את אדום Amplex אשר יכולים לכמת (ללא כולסטרול אוקסידאז) את השומנים התוכן חמצן לכל מ"ג של ה-HDL-C. פרוטוקול זה קביעת describedfor peroxidation HDL-השומנים באמצעות הכימית fluorochrome. השתנות assay יכול להיות מופחת על ידי סטנדרטיזציה קפדנית של תנאי הניסוי. ערכים גבוהים יותר HDLox משויכות פונקציה מופחתת של נוגדי חמצון HDL. Readout assay זו משויכת המפרט של המאומת מבוססת תא מבחני, הפונדקאית אמצעים של מחלות לב וכלי דם, דלקת מערכתית, תפקוד המערכת החיסונית פנוטיפים סיכון קרדיו-וסקולריות ושל מטבולית המשויך. גישה טכנית זו היא שיטה חזקה כדי להעריך פונקציית ה-HDL מחלות אנושיות בו דלקת מערכתית, סטרס חמצוני ושומנים מחמצנים יש תפקיד מפתח (כגון טרשת עורקים).

Introduction

מחלות לב וכלי דם טרשת עורקים (CVD) הוא הגורם המוביל למוות ברחבי העולם1,2. מחקרים אפידמיולוגיים הראו כי רמות נמוכות של כולסטרול ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL) המשויכים בדרך כלל הפוך הסיכון להתפתחות טרשת עורקים1,2. למרות מספר מחקרים תומכים תפקיד atheroprotective עבור ה-HDL1,2, המנגנון שבאמצעותו HDL נחלש החניכה, ההתקדמות של טרשת עורקים הוא מורכב 3,4. לפיכך, הוצע כי מורכבות המבנה והתפקוד של HDL ולא רמה מוחלטת עלולה יותר לחזות במדויק טרשת עורקים 5,6,7,8. מספר ה-HDL חלבון ו ליפיד ההלחנה שינויים שפוגעים פונקציית ה-HDL להתרחש במצבים דלקתיים כגון טרשת עורקים. אלו i) להפחית את פוטנציאל בזרימת 9שלה כולסטרול, ii) ירידה אנטי דלקתיות, ולהגביר את ה-HDL-הקשורים חלבונים פרו דלקתיים 6,7, של רמות פקטור של ירידה iii) נוגד חמצון ופעילות ו HDLs היכולת לעכב את חמצון של ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDLox)10 ו- iv) להגדיל את השומנים hydroperoxide התוכן של חמצון-חיזור פעילות (HDLox)9,11. מבחני חזקים להעריך את הפונקציות pleotropic של ה-HDL (כגון כולסטרול בזרימת, נוגד חמצון פונקציה) ייתכן משלימים נחישות של HDL-HDL-C במרפאה.

פונקציית ה-HDL הוא בדרך כלל לאומדן מבוססת תא שיטות כגון כולסטרול בזרימת assay8,12,13,14. שיטות אלה יש מגבלות הגדולות כולל הטרוגניות משמעותי לגבי סוגים של תאים בשימוש, סוג הבדיקה דיווח, היעדר סטנדרטיזציה ואפקטים מבלבלים של טריגליצרידים 7,15. מחסרונות אלה מהווים קשיים על מחקרים קליניים גדולים16. מבחני ללא תא עשוי לתת באמצעים חזקים יותר של פונקציית ה-HDL לעומת מבחני מבוססת-תא. בזרימת כולסטרול הוא אחד התפקידים החשובים ביותר של ה-HDL, אך זה יכול להיקבע רק על ידי מבחני מבוססת-תא. גישות אחרות כדי לקבוע את פונקציית ה-HDL כגון פרוטאומיקס17,18,19,20,21,22,23, 24 , מונוציט מבוססת תא מבחני כימוטקסיס של HDL פונקציה 17,22,25 לא סטנדרטית ואין אפשרות להשתמש במחקרים בבני אדם בקנה מידה גדול.

HDL יש נוגד חמצון משמעותית atheroprotective אפקט5,6,7,8. הפונקציה נוגד חמצון של HDL נקבע בנוכחות LDL לתא הקודם חינם מבחני fluorometric 26. השיטות fluorometric הביוכימי של HDL נוגד חמצון פונקציה פותחו במקור מאת פרהיוט אבבה Navab, אלן פוגלמן, הקולגות שלהם26. למרות מחקרים בבני אדם רבים השתמשו בשיטות אלה כדי לקבוע את ה-HDL פונקציה 17,18,19,20,21,22,23 ,24, השומנים (HDL)-שומנים בדם (LDL) ואינטראקציות השומנים-fluorochrome עלולה להגביל הפארמצבטית של אלה תא חינם-אנזימטי הביוכימי מבחני של HDL פונקציה27,28.

הריבית האחרונות התמקדה ההשלכות פונקציונלי של חמצון ה-HDL, שהוא התוצאה של חמצון של שומנים וחלבונים בתוך ה-HDL 27,29,30. מחקרים קודמים הראו כי חמצון של HDL פוגע HDL פונקציה 27,29,30. HDL יש תפקיד מרכזי בהעברה חמצן השומנים, כמות גבוהה של שומנים בדם משתכים שטח ניקוי קשורה לתפקוד נורמלי של HDL. ובכך HDL השומנים חמצן תוכן שניתן להשתמש כדי לקבוע את ה-HDL פונקציה 9,17,20,31 ו נתן את המגבלות המוכרות של מבחני מוקדמת של HDL פונקציה7, 15,27,32, פיתחנו שיטה חלופית fluorometric זה מכמת HDL השומנים תוכן חמצן (HDLox) 32. שיטה זו מבוססת על peroxidase חזרת את האנזים (HRP) ו fluorochrome את אדום Amplex אשר יכולים לכמת (ללא כולסטרול אוקסידאז) את השומנים התוכן חמצן לכל מ"ג של ה-HDL-C 32. עקרון וזמינותו הביוכימי מוצג באיור1. אנחנו הראו כי גישה זו מבוססת על-ידי קרינה פלואורסצנטית אין המגבלות של27,מבחני תפקוד HDL מוקדמת28. יש כבר מעודן, סטנדרטית במעבדה שלנו כך זה יכול לשמש באופן אמין במחקרים בבני אדם בקנה מידה גדול, אפילו עם פלזמה cryopreserved 32,33,34, עוד יותר assay הזה 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. readout assay זו מזוהה עם המפרט של המאומת מבוססת תא מבחני, הפונדקאית מדדים של מחלות לב וכלי דם, דלקת מערכתית, תפקוד המערכת החיסונית, סיכון קרדיו-וסקולריות ושל מטבולית המשויך פנוטיפים 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39. כאן, אנו מתארים שיטה זו פשוטה, עדיין חזקים כדי למדוד את ה-HDL השומנים חמצן תוכן (HDLox). Assay הזה יכול לשמש ככלי לענות על שאלות מחקר חשוב לגבי התפקיד של פונקציית ה-HDL מחלות אנושיות בו דלקת מערכתית, סטרס חמצוני ושומנים מחמצנים יש תפקיד מפתח (כגון טרשת עורקים)32.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים באמצעות דגימות ביולוגיות האדם בוצעו עם אתיקה אישור מהאוניברסיטה של קליפורניה בלוס אנג'לס, לוס אנג'לס, ועדת האתיקה האנושית של החולים אלפרד, מלבורן.

הערה: ישנן וריאציות רבות של הפונקציה fluorochrome HDL Assay (ראה דיון) 32. להלן נתאר את פרוטוקול זה נותן תוצאות עקביות ביותר לשחזור. סקירה כללית של וזמינותו מוצגת באיור 2.

1. עיבוד הדגימה

  1. שימוש בסרום טריים, ללא hemolyzed (יכול להיות שנאספו סרום מפריד צינורות) או ציטראט פלזמה שהושג לאחר 12-14 שעות צום. אם באמצעות דגימות cryopreserved, לכלול הפקד המתאים כמתואר פרוטוקול זה.

2. יום 0-הכנה וזמינותו

  1. הכן פריסת עבודה של ניסוי עם הפקדים המתאימים, דוגמאות ושכפול של. להפעיל כל מדגם לפחות triplicates. פריסה טוב נציג 96 מוצג באיור 3.
  2. לחשב את כל אמצעי האחסון של ריאגנטים שישמש עבור וזמינותו מבוסס על מספר דוגמאות ומשוכפלת.
    הערה: כוללים אמצעי אחסון 10% נוספים במלאי כל עבודה ' כדי לוודא שאין מספיק נפח עבור כל ריאגנט לניסוי מסוים.
  3. תווית צינורות כל הנדרש עבור כל השלבים השונים של וזמינותו למשל לצורך הקמת מכשול ההפרדה של HDL, מדידה של ה-HDL-C (אופציונלי) את fluorochromeassay.

3. יום 1-הכנה של פקדים

  1. הכנת בקרה במאגר המחקר הספציפיים
    1. צור דגימת הבקרה פלזמה במאגר או סרום של לימוד כל הדגימות. אם פועל 20 דגימות בצלחת כל דולר, לשלב 10 µL מן כל מדגם פקד µL 200 איחדו. תן aliquot נפרדים של פקד במאגר זה למעבדה קלינית כדי לקבוע את הערך ה-HDL-C של פקד זה.
      הערה: השתמש בפקד במאגר זה כדי לתקנן וזמינותו ולהתחשב ידוע אפשרי (למשל סוג של מטריקס נסיוב נגד פלזמה, מחזורים ההקפאה-הפשרה, הקפאה קריוגנית) ו- confounders לא ידוע שעשויים להשפיע על השתנות ניסיוני 27 , 28.
  2. הכנה של בקרת איכות מעבדה ספציפי (QCs)
    1. להכין מלאי גדול של HDL במעבדה כל (לדוגמה HDL מבודד 5 מ ל פלסמה מתורמים בריאים 10), cryopreserve aliquots מספר על זה מניות כדי למזער מחזורים ההקפאה-הפשרה.
    2. שימוש לפחות 10 שונים משכפל מן המניה הזו כדי לקבוע את הערך הממוצע של HDLox. טווח מקובל HDLox נמדדו הערכים עבור כל דגימה QC כלולים כל assay נמצא במרחק < 15% של המקדם של וריאציה של ערך ממוצע זה.
    3. Aliquot נפרדים של פקד במאגר זה לתת המעבדה הקלינית כדי לקבוע את הערך ה-HDL-C של פקד זה (למשל 40 מ"ג/ד"ל).
      הערה: בגישה מפורט כיצד להשתמש דם בנקי דם כדי ליצור פקדים אלה קודם לכן כבר מתואר 27 , 28 , 32. השתמש QCs נוספים לפי הצורך (למשל אחד מתורם בריא ידוע תפקוד תקין של HDL ואחד מתורם ידוע פונקציית ה-HDL במידה רבה חריג.
  3. אופטימיזציה של האות רקע וערכים ריקים (אופציונלי)
    1. כדי למזער את הרקע, להוסיף את הכמות המתאימה של קטלאז (1-4 U/mL) המדיום הדגירה כדי להסיר במהירות את יצרו H 2 O 2 עקב חמצון אוויר ספונטני של מאגרי.
      הערה: מאז הערכים מן הבארות ריק (אין HDL) הם להיות מופחתים לפי הערכים של הדגימות HDL, התוצאות מתבצעת דיווח ביחס פקד במאגר (הכלול באותה צלחת טוב 96), מצאנו כי שלב זה עושה לא ממש affec t התוצאות. לפיכך, אופטימיזציה של האות רקע עם קטלאז יכול להיות מושמט, במידת הצורך.

4. יום 1-הפרדה של כולסטרול HDL באמצעות ה-HDL משקעים

הערה: השתמש זמינים מסחרית סטנדרטית כולסטרול HDL שיכלו ריאגנט כדי לבודד apoB דלה סרום לפי היצרן ' s הוראות. נוגדנים אלה נמצאים בשימוש נרחב מבחני ערכי צבע מוחלטים כדי לקבוע רמות הכולסטרול HDL-

  1. להשתמש טרי (או להפשיר) מדגם פלזמה או סרום.
  2. לערבב נפחים שווים (למשל µL 80) של פלאזמה ו- HDL כולסטרול מאיצים ריאגנט (20% w/v פוליאתילן גליקול במאגר גליצין ב- pH 10.0 (25 ° C)).
  3. לערבב היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה.
  4. צנטריפוגה 1000-2000 x g עבור 10 דקות
  5. וארוקן את תגובת שיקוע (HDL שבר).
  6. אידיאלי לשימוש באופן מיידי HDL מבודד fluorochromeassay של ה-HDL השומנים peroxidation. עם זאת, אם מספר דגימות מופעלים באותו יום השני צעדים כגון מדידת ריכוז כולסטרול HDL גם נעשים, אז לאחסן HDL מבודדים ב 4 ° C ולהשתמש בו למחרת עבור הפונקציה fluorochromeHDL Assay.

5. יום 1-קביעת ה-HDL-C ב- HDL המבודד

הערה: פעולה זו היא אופציונלית אם הערך של ה-HDL-C מן המעבדה הקלינית משמש לנרמל את HDLox לפי כמות ה-HDL-C.

  1. Quantify ה-HDL-כולסטרול מן פלזמה, באמצעות תקן ערכי צבע מוחלטים מבחני 27. מוסיפים 50 µL של כולסטרול ריאגנט מכל קידוח, לקבוע ריכוז הכולסטרול באמצעות קורא צלחת ערכי צבע מוחלטים כולסטרול הסטנדרטי שסופק בערכה לכל.

6. יום 2-הכנה של ריאגנטים

  1. פתרונות HRP להכין וכולסטרול בפתרון HRP 5 U/mL (טווח 1-10 U/mL).
  2. להכין 20 מ מ fluorochrome (למשל, Amplex אדום) פתרונות: הפשרת בקבוקון של ריאגנט fluorochrome, דימתיל סולפוקסיד לטמפרטורת החדר. לפני שימוש, להתמוסס ריאגנט fluorochrome (מ ג 1) ב- µL 200 של דימתיל סולפוקסיד. לאחסן פתרון מניות קפוא ב ≤-20 ° C, מוגן מפני אור.
  3. להכין פקדים חיובית ושלילית: שימוש 1 X ' התגובה מאגר ' ללא כולסטרול ו- 20 מ מ H 2 O 2 עובד פתרון פקד שליליים או חיוביים, בהתאמה.

7. יום 2-Fluorochrome Assay

  1. µL להוסיף 50 1 x תגובת מאגר כמו ריק (שליטה שלילי).
  2. אופציונלי: להוסיף 20 מ מ הפתרון עובד של 2 O H 2 כפקד חיובי בצלחת לכל.
  3. כדי למזער את השתנות ניסיוני ולהבטיח כי תוספת של ריאגנטים ודוגמאות נעשים באופן עקבי ולבצע מבעוד, כל התוספות של דגימות בצלחת נפרדת 96 טוב סיבוב למטה, ברור, פוליסטירן או פוליפרופילן (לוח 1). ואז להשתמש פיפטה רב-ערוצי להעביר אמצעי אחסון ספציפי לוחות 96-ובכן 3 (2-4 צלחות: פוליפרופילן, שטוח בוט. טום, שחור) (כי יש פריסה זהה) ( איור 2, איור 3).
    1. לדוגמה, להוסיף µL 160 של HDL מבודד לתוך כל טוב/מדגם של צלחת 1 ולאחר מכן עם השימוש של פיפטה רב-ערוצי להעביר 50 µL של HDL-כולסטרול מן כל טוב/מדגם לוחות שחורים 96-ובכן. לשנות טיפים בין כל שורה/עמודה ולהשתמש טיפים בלי פילטר של כל ההעברות.
  4. להשאיר דוגמאות הבארות. אל תמחק. ישנם שלבים שטיפת אין בין תוספת של ריאגנטים.
  5. µL להוסיף 50 בפתרון HRP 5 U/mL (0.25 U) כדי מכל קידוח.
    הערה: שימוש HRP לפני התוספת של הכימית fluorochrome.
  6. תקופת דגירה של 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס. אל תמחק קבצי דגימות לאחר דגירה (אין מדרגות שטיפת בין תוספות של ריאגנטים).
  7. להוסיף 50 µL של fluorochromereagent עבור ריכוז סופי של 300 מיקרומטר. בשלב זה, התגובה הכולל אחסון הוא 150 µL. לערבב היטב, להגן מפני אור.
  8. להעריך את המדידה פלורסנט (בחושך) כל דקה מעל 120 דקות ב 37 ° C עם קורא צלחת פלורסנט (530/590 nm מסננים).
    הערה: השתמש למרווח זמן קצר יותר 60 דקות עם דגימות טריות. מצאנו assay 120 דקות זה נותן יותר לשחזור נתונים עם השימוש של דגימות cryopreserved.
  9. להקליט נתונים באמצעות תוכנה מתאימה-

8. יום 3-נתונים ניתוח

  1. להקליט יחידות קרינה פלואורסצנטית (שרירותי יחידות) ב 120 דקות לאחר תוספת של fluorochrome מגיב על כל הדגימות לרבות בארות ריק וכל פקדי.
  2. לחשב את הערך הממוצע של יחידות קרינה פלואורסצנטית (בהתבסס על פחות triplicates) (HDL ox_sample). אל תקחו ליניאריים (> 2 מרחביות מהערך הממוצע) תוך התחשבות.
  3. להפחית קרינה פלואורסצנטית על רקע באמצעות המשוואה הבאה:
    Equation 1
  4. נורמליזציה עבור כמות כולסטרול ה-HDL (HDL-C): לנרמל את הערך peroxidation השומנים HDLox עבור כל דגימה (כולל את הפקד במאגר) על ידי ה-HDL-C) (מ"ג/ד"ל). לאורך כל המקטע תוצאות, מוצג HDL שור n (HDL-C) HDLox מידה כדי לשקף את ההתאמה עבור ה-HDL-C. להשתמש במשוואה הבאה:
    Equation 2
  5. לתקנן את הביטוי של HDLox שומנים בדם peroxidation ערך של כל מדגם נגד הערך של פקד במאגר. לנרמל את n (HDL-C) HDLox השומנים peroxidation ערך עבור כל דגימה (מותאם HDL-C) מאת n (HDL-C) HDLox השומנים peroxidation ערך הפקד במאגר. לאורך כל המקטע תוצאות, HDL שור מוצגת כאמצעי שור nHDL כדי לשקף את ההתאמה עבור השתנות ניסיוני ו- HDL-C. להשתמש במשוואה הבאה:
    Equation 3
    הערה: גישה זו דומה גישות אחרות ניסיוני הוקמה כדי להפחית את השתנות ניסיוני של מדידות כגון הבינלאומי מנורמל יחס (INR) 44 , 45. גישה זו אומתה ב מחקרים קליניים 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39.
  6. לבצע בקרת איכות של תוצאות הניסוי באמצעות דגימות תקן בקרת איכות. בכל מעבדה צריך ליצור פקדים איכות משלהם (QCs). אידיאלי יש QC עבור nHDLox מתוך מדגם עם HDL ידוע לא מתפקדת, QC עבור nHDLox מתוך מדגם מתורמים בריאים [למשל שימוש במאגר מדגם מבוגרים צעירים אשר תורמים הקים בנק הדם ויש לא ידוע תחלואה נלווית, גורמי סיכון מחלות לב וכלי דם כולל עישון]. הפקד האחרון המשקלל תוצאות בין מעבדות שונות. הערכים הממוצע של אלה QCs הן הוקמה על בסיס לפחות 5 משכפל (בדרך כלל אנו משתמשים משכפל 10 בשלב זה חשוב).
    1. הסימון אם QCs נמדד בכל assay יש ערכים בתוך טווח הערכים הצפויים. בהנחה של השתנות מקובל ניסיוני מרבי של 15%, כל הערכים ניסיוני נמדד אמור ליפול בתוך 15% ממוצע הערכים הידועים של QC הוקמה. להשתמש את המשוואות הבאות:
      Equation 4
      Equation 5
      הערה: אם באחת בקרת האיכות כלול דוגמאות ( רגיל לעומת HDL לא מתפקדת) נותן HDLox ערכים מחוץ לטווח הצפוי (שהוקמה בשנת בכל מעבדה) ולאחר מכן לחזור על הניסוי.
  7. לבצע בקרת איכות של תוצאות הניסוי באמצעות המקדם של וריאציה (CV) לכמת השתנות ניסיוני: חזור על כל הדגימות עם CV % > 15%. להשתמש במשוואה הבאה:
    Equation 6
    הערה: אופייניות אינטרה-assay (בתוך באותה הצלחת) ולשינויים ניסיוני assay אינטר (בין לוחות שונים) הוא < 15%-2) טיפוסי אינטרה-assay CV היא בין 1-7% interassay טיפוסי CV הוא בין 3-10%.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

50 µL של כל מדגם ה-HDL מתווספים כל טוב כמו שלב 7.3. µL 50 של פתרון HRP 5 U/mL (0.25 U) יתווספו לאחר מכן כל טוב כמו שלב 7.5. דוגמאות מודגרת למשך 30 דקות ב 37 ° C כמו שלב 7.6. µL 50 של ריאגנט fluorochrome יתווספו לאחר מכן כל טוב כמו שלב 7.7 (הריכוז הסופי של 300 מיקרומטר). המדידה פלורסנט (בחושך) ואז שקובעת כל דקה מעל 120 דקות ב 37 ° C עם קורא צלחת פלורסנט (530/590 nm מסננים). קרינה פלואורסצנטית נציג נתונים לשליטה ריק, במאגר, לדוגמה עם HDL לקוי ידוע ודגימת עם HDL נורמלי מוצגים באיור4. הנתונים הגולמיים נציג וניתוח צעד אחר צעד של תוצאות באמצעות המשוואות המתוארות בסעיף 8 של הפרוטוקול מוצגות באיור טבלה 1- בדוגמה זו, דגימות ה-HDL טריים שימשו, ערכים גבוהים יותר HDLox מתקבלים בדרך כלל עם HDL טריים. לדוגמה, ה-HDL ידוע להיות לקוי מבחני עצמאית על בסיס של פונקציית ה-HDL ו מאדם נגוע ב- HIV היה כ 2-fold גבוהים יחסית כמות השומנים על-חמצני בהשוואה ל- HDL במאגר ממשתתפים בריא. איור 5 מציג תוצאות נציג מחקר עם נושאים ידועים בעלי ליקויי HDL פונקציה28,32. אנשים נגועים ב- HIV היה כ-60% גבוה יותר מתכוון HDL-חמצן תוכן שומני (לכל מ ג של ה-HDL-C) לעומת אנשים נגוע. מחקרים שפורסמו שלנו מוקדמת עם cryopreserved HDL, שיטה זו הצליח להראות לפחות הבדלים יחסיים 10% HDLox בהשוואה ל- HDL של פקד קבוצות (ללא מחלת דלקת כרונית HIV למשל)36,37, 38.

Figure 1
איור 1: נחישות של HDL השומנים תוכן חמצן לכל כמות מסוימת של ה-HDL-C.
במצבים של דלקת מערכתית סטרס חמצוני HDL גדל השומנים משתכים שטח ניקוי (LOOH) (HDLox) המקושרים עם תפקוד לקוי של HDL. HRP מזרז החמצון של פלורסנט שאינן fluorochrome כדי פלורסנט resorufin אדום. חמצון הזה יכול להיות מונע על ידי אנדוגני משתכים שטח ניקוי נוכח התגובה (OH-) והן. משתכים שטח HDL-השומנים ניקוי (נולד ב- LOOH). ללא כולסטרול אוקסידאז, resorufin (עם HRP) יכולים לכמת את התוכן חמצן של השומנים HDL מהותי של כמות מסוימת של כולסטרול HDL. ייצור רקע של אה - כתוצאה אוויר חמצון של המאגר היא המופחת מדידה פלורסנט של כל טוב. Resorufin יש autofluorescence מינימלי בדגימות רוב. איור זה כבר שונה 32. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: סקירה של זרימת העבודה עבור fluorochromeassay של ה-HDL השומנים peroxidation.
יום 0: הכנה וזמינותו: A) עיצוב פריסות לוח טוב 96, הערכת עוצמת הקול של הצורך (פלזמה/סרום) ודוגמאות ריאגנטים (אנזים HRP, fluorochrome מגיב, מאגרים, פג מגיב), תווית צינורות
יום 1: הכנה assay ובידוד HDL: A) הכנה למשקעים ב) HDL פקדים (מחקר ספציפי-איחדו שליטה, פקדים איכות, פקדים חיוביים ושליליים) באמצעות פג מגיב.
יום 2: הכנה assay (אם לא נעשה היום 1) ואת וזמינותו fluorochrome: A) הכנה של פקדים (מחקר ספציפי-איחדו שליטה, פקדים איכות, פקדים חיוביים ושליליים) A) תוספת של דגימות ה-HDL: כדי למזער את השתנות ניסיוני, ודא כי תוספת של ריאגנטים ודוגמאות ייעשה באופן עקבי מבעוד מומלץ כי כל תוספות של דגימות (למשל µL 160) נעשים תחילה נפרד 96 פוליסטירן טוב סיבוב המדרגה, ברורה, או צלחת פוליפרופילן (לוח 1). ואז פיפטה רב-ערוצי יכול לשמש להעברת אמצעי אחסון ספציפיים (למשל 50 µL) 3 לוחות 96-ובכן (לוחות 2-4: פוליפרופילן, בתחתית שטוח, לוחיות שחור) (כי יש פריסה זהה). ב) תוספת של HRP: להוסיף 50 µL של 5 U/mL (0.25 U) כל טוב באמצעות פיפטה רב-ערוצי C) Incubate ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות D) µL להוסיף 50 מיקרומטר 300/טוב של fluorochrome מגיב כל טוב באמצעות פיפטה רב-ערוצי E) להעריך את המדידה פלורסנט (בחושך) כל דקה מעל 120 דקות ב 37 ° C עם קורא צלחת פלורסנט (530/590 nm מסננים).
יום 3: ניתוח נתונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: פריסה נציג של צלחות טוב 96 המשמשים בדרך כלל הפונקציה fluorochrome HDL וזמינותו.
הבדלים העיתוי של תוספת של HDL מדגמים לתוך בארות של צלחת יכול להוביל הבדלים חמצון ספונטני בין וולס שונים. כדי למזער את השתנות ניסיוני, למנוע חמצון ספונטני משתנה בין וולס שונים ולהבטיח כי תוספת של ריאגנטים ודוגמאות ייעשה באופן עקבי, והו, מומלץ כי כל תוספות של דגימות (למשל 160 µL) הם קודם נעשה נפרד 96 פוליסטירן טוב סיבוב המדרגה, ברורה, או צלחת פוליפרופילן (לוח 1). ואז פיפטה רב-ערוצי יכול לשמש להעברת אמצעי אחסון ספציפיים (למשל 50 µL) 3 לוחות 96-ובכן (לוחות 2-4: פוליפרופילן, בתחתית שטוח, לוחיות שחור) (כי יש פריסה זהה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: נציג נתונים של HDL השומנים peroxidation assay.
המדידה פלורסנט (בחושך) ואז שקובעת כל דקה מעל 120 דקות ב 37 ° C עם קורא צלחת פלורסנט (530/590 nm מסננים). נציג נתונים (יחידות שרירותיות) מוקרנים ריק (אין HDL; פקדים שלילי), בקרה חיובית (H2O2), שליטה HDL במאגר ו HDL החולה ידוע HDL לא מתפקדת (מבוסס על שני פונקציית ה-HDL עצמאית מבחני-כולסטרול בזרימת ואת וזמינותו כימוטקסיס מונוציט). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: השומנים חמצן וזמינותו של פונקציית ה-HDL יכול לזהות השומנים גבוה מי חמצן תוכן לכל כמות מסוימת של ה-HDL-C בתוך vivo.
HDL היה מבודד, HDLox נקבע כמפורט בפרוטוקול תוך לנסיינים בריאים 50 ו- 100 חולים עם הידבקות ב- HIV. אנשים נגועים ב- HIV היה גבוה יותר HDLox (1.59±0.53) לעומת הפקדים (1.01±0.31) (p < 0.001). איור זה כבר שונה 32. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן מציע כלי חזקים כדי לענות על שאלות מחקר חשוב לגבי התפקיד של פונקציית ה-HDL טרשת עורקים, מחלות אנושיות. וזמינותו מכמת את ה-HDL השומנים התוכן חמצן לכל מ"ג של ה-HDL-C באמצעות הגברה אנזימטי (HRP). גישה זו מונע המגבלות המוכרות של מבחני תפקוד HDL מוקדמת (למשל וזמינותו בזרימת כולסטרול) כולל הטרוגניות משמעותי לגבי סוגים של תאים בשימוש, סוג הבדיקה דיווח, היעדר סטנדרטיזציה ואפקטים מבלבלים טריגליצרידים7,15,32. קביעת הביוכימי במקום תכונות ביולוגיות (למשל בזרימת כולסטרול) של HDL עשוי להיות יותר לשחזור. ההשתנות הבין-assay ניסיוני של < 10% משווה לטובה עם מבחני מבוססת תא של פונקציית ה-HDL, איפה השתנות ניסיוני interassay לעתים קרובות > 15% (או לא דווחו). בנוסף, גישה זו עלולה להגביל הביוכימי האינטראקציות בין ליפידים, פלורסנט רגשים32. הנחישות של HDL חמצון רלוונטי בהקשר של מחלות לב וכלי דם נתון תפקיד מפתח של סטרס חמצוני בתוך קיר עורקי בפתוגנזה של atherogenesis 46. השתמשנו fluorochrome HDL פונקציה וזמינותו לגילוי תפקוד לקוי של HDL במצבי עקה כרוניים כגון טרשת עורקים, וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) זיהום32. שימוש assay הביוכימי של פונקציית ה-HDL, מספר מחקרים אישרו האגודה של HDLox עם השמנת יתר, מחלות לב וכלי דם 19,21,27,34,35 36, ,47. באופן משמעותי, במחקרים טייס אנושי הפגנו אגודות של HDLox עם מבחני מבוססת תא מאומת, אם פונדקאית מדדים של מחלות לב וכלי דם, דלקת מערכתית, תפקוד המערכת החיסונית, משויך סיכון קרדיו-וסקולריות ושל מטבולית פנוטיפים32,36. למרות assay הזה שימש במספר מחקרים כדי לפנות את התפקיד של פונקציית ה-HDL מחלות שונות כגון כרונית HIV זיהום32,38, טרשת עורקים 32 , ההשמנה36, זה נשאר. תוקף במחקרים בקנה מידה גדול עם נקודות הקצה קליניים הזמינים של CVD (למשל, התקפי לב).

התגובה של fluorochrome עם משתכים שטח ניקוי בנוכחות HRP כדי לייצר resorufin מאוד פלורסנט היא מבוססת היטב 48,49. HRP מזרז החמצון של פלורסנט שאינן fluorochrome resorufin ניאון אדום50,51. חמצון הזה יכול להיות מונע על ידי אנדוגני משתכים שטח ניקוי נוכח התגובה (OH-) והן. משתכים שטח HDL-השומנים ניקוי (נולד ב- LOOH). ללא כולסטרול אוקסידאז, resorufin (עם HRP) יכולים לכמת את התוכן חמצן של השומנים HDL מהותי של כמות מסוימת של כולסטרול HDL. ייצור רקע של אה - כתוצאה אוויר חמצון של המאגר היא המופחת מדידה פלורסנט של כל טוב. Resorufin יש autofluorescence מינימלי בדגימות רוב. תוספת של קטלאז (1-4 U/mL) במאגר התגובה במהירות יכול להחליש אנדוגני משתכים שטח ניקוי כך הגדלת המדידה פלורסנט לאורך זמן הוא מונע על ידי ה-HDL משתכים שטח ניקוי שומנים בדם. וזמינותו רב-תכליתי, ניתן להעריך את השומנים תוכן חמצן ב- HDL המקופלת לעומת48,32,כולסטרול HDL חינם49 .

ישנן וריאציות רבות של פונקציית ה-HDL fluorochrome Assay32. בקצרה, יש לפחות 3 גישות העיקריים:) להוסיף נפח מסוים של HDL (למשל 50 µL) לכל טוב, אחר כך לנרמל את הערך peroxidation השומנים HDL רמת ה-HDL-C כפי שנקבע במעבדה קלינית; b) לקבוע את הריכוז של ה-HDL-C בכל מדגם בהתבסס על מבחני כולסטרול ערכי צבע מוחלטים רגיל ולאחר מכן להוסיף כמות מסוימת של ה-HDL-C (למשל 1 µg) לכל טוב; ו- c) לנרמל את המדידה פונקציית ה-HDL HDL או apoA-אני חלבון התוכן32. ישנן גם גישות הגדולות לפחות 3 כיצד לבודד את ה-HDL עבור ה-HDL השומנים peroxidation מבחני: א) HDL כולסטרול משקעים למשל עם פוליאתילן גליקול; ב) לכידת Immunoaffinity; ו- c) אחרים בשיטות הרגילות לא תפוקה גבוהה HDL בידוד כגון µLtracentrifugation32. בנוסף, וזמינותו הוא תכליתי, ניתן להעריך את השומנים תוכן חמצן ב- HDL המקופלת נגד כולסטרול HDL חינם 32. ישנם מספר דרכים כדי לדווח על שהתוצאות, למשל קרינה פלואורסצנטית שרירותי יחידות, יחידות קרינה פלואורסצנטית resorufin סטנדרטית, מנורמל יחס שליטה במאגר32. במסמך זה נציג את הגישה ביותר לשחזור.

אם נעשה שימוש פלזמה חשוב להכין פלזמה צינורות בעלי סודיום ציטרט כמו קרישה 27,28. סולפט40 והפרין EDTA יכול להפריע חמצון תגובות 41,42. הפרין סולפאט יכולים להפריע מבחני הביוכימי של HDL פונקציה 27,28. למרות cryopreserved סרום ופלסמה שיוצרת לקביעת ליפידים, פונקציית ה-HDL ו- HDL השומנים peroxidation, דוגמאות cryopreserved יכולים לכמת היחסי הבדלים HDL השומנים peroxidation לכל מ ג של HDL. חשוב לעבד כל דוגמאות בתוך מחקר ספציפי בדיוק באותה דרך (מחזורים ההקפאה-להפשיר אותו למשל), כוללים פקד במאגר כל צלחת להביא בחשבון confounders פוטנציאליים הקשורים להבדלים בעיבוד לדוגמה בין מחקרים שונים. הקפאה קריוגנית לטווח ארוך יכול לסכן את התוצאות של מבחני תפקוד HDL43 אבל עדיין יכול להיות מוערך יחסית הבדלים HDL השומנים peroxidation בין דגימות במסגרת מחקר אחד אם פקד במאגר המתאים הוא בשימוש 27, 28.

חשוב לציין, מבחני מוקדמת של פונקציית ה-HDL לא מתוקננים. כאן נתאר גישה איפה והשימוש הפקדים המתאימים מבטיח האחדה של המדידה. יותר במיוחד קיימים מספר פרמטרים ידועים שעשויים להשפיע על המדידה של מבחני הביוכימי של HDL לתפקד כמו מטריקס אפקטים (שיטת לעומת סרום של פלזמה הכנה), נוכחות של אלבומין וחלבונים אחרים, הקפאה קריוגנית, ההקפאה-מפשיר 32-HDL הפונקציה fluorochrome assay יכול להיות מוגדר עם השימוש של ריאגנטים ניסיוני32ותקני זמינים מסחרית. עם זאת, ישנם גםמספר confounders לא ידוע (או לקוי מאופיין) בכל מחקר ואני בין אנשים שונים שעשויים להשפיע על קביעת ה-HDL לתפקד תוצאות. לכן כל צלחת אנחנו משתמשים בפקד ה-HDL במאגר המוכן דגימות ספציפית בטווח נתון מחקר (אשר עובדו באופן זהה) ממזערת חפצים, confounders32. השימוש ערכי HDL-C של המעבדה הקלינית ודוגמאות של בנק הדם פלזמה נוספת באפשרותך לתקנן את assay32.

אנחנו בעבר הראו כי שיטות שונות של בידוד ה-HDL יכול להשפיע באופן משמעותי על המדידה של מבחני הביוכימי של HDL פונקציה 27,28,32 אבל fluorochrome יכול למדוד בצורה אמינה HDLox הממאירות של הבידוד HDL 32. שיטות בידוד ה-HDL הן גורם המגביל העיקרי ללימודי תפוקה גבוהה של פונקציית ה-HDL. Ultracentrifugation נחשב כיום שיטת הפניה, אך נשאר זמן רב בשיטה52. אלקטרופורזה אינה מדויקת, לא סטנדרטית 53. HDL משקעים שיטות לערב את השימוש polyanions כגון פוליאתילן גליקול (PEG), כדי לזרז lipoproteins בצפיפות נמוכה עוזב את ה-HDL ב supernatant 54. למרות ששיטות אלה מוצגות חסרונות מסוימים, כגון תוצאות משתנה עם סרומים lipemic, הפרעות עם כולסטרול אנזימטי הליכים 55 שינויים קודמים על שימוש בהליך המקורי סטנדרטית זמינים מסחרית ריאגנטים תשואה של הליך פשוט, אמין ומדויק56. למרות המשקעים פג הוא נפוץ בשיטה לבודד את ה-HDL21,57 מסרום החולה, נושא מרכזי היא הנוכחות של חלבונים שאינם-HDL כגון אלבומין58. בידוד Immunoaffinity יכול לשמש כדי למזער את ההשפעה של אלבומין על פונקציית ה-HDL 32. למרות הבדלים יחסיים HDLox עבור שיטה ספציפית לכידת יכול להידרש, נוגדנים ספציפיים נגד HDL לא ללכוד באופן מלא מבנים מורכבים של HDL. באמצעות הפקדים המתאימים כמתואר פרוטוקול זה, יחסית ההבדלים HDLox בין דגימות ה-HDL (מבודד על ידי משקעים פג) יכול בצורה אמינה להיקבע.

זה וזמינותו, כמו כל מבחני אחרים של פונקציית ה-HDL, יש מגבלות מפתח. In vivo חמצון של HDL בדופן העורקים היא הטרוגנית ומורכבת למדי, תוכן חמצן השומנים עשוי לשקף באופן חלקי בלבד HDLox46. HDL מבנה ותפקוד ללא הרף שינויים ויוו , מדידה של פונקציית ה-HDL timepoint אחד אינן משקפות בהכרח את ההשפעה של HDL תפקוד איברים סוף המחלה לאורך זמן59. לא ידוע אם צריך אפשרות לנרמל את המדידה HDLox על ידי ה-HDL-C, או חלבון ה-HDL 22. מחקרים קליניים עתידיים צריכים לאמת את החשיבות של המדידה של וזמינותו (HDL השומנים חמצן תוכן לכל מ"ג של ה-HDL-C).

לסיכום, וזמינותו פונקציית ה-HDL fluorochrome היא שיטה אמינה על הנחישות של HDL השומנים התוכן חמצן לכל כמות מסוימת של HDL (HDLox). ערכים גבוהים יותר HDLox משויכות פונקציה מופחתת של נוגדי חמצון HDL. המדידה של assay זו מזוהה עם המאומת מבוססת תא מבחני, הפונדקאית מדדים של מחלות לב וכלי דם, דלקת מערכתית, תפקוד המערכת החיסונית, סיכון קרדיו-וסקולריות ושל מטבולית המשויך פנוטיפים 19, 21,27,32,34,35,36,37,38,39, 47. שיטה זו מציעה כלי נוח, אך חזקים לבחינת תפקידו של פונקציית ה-HDL מחלות אנושיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

זה הפרוטוקול ואת וזמינותו הרלוונטיים הפטנטים PCT/US2015/018147.

Acknowledgments

המחברים מאשר בתודה את העבודה של ד ר פרהיוט אבבה Navab, אלן פוגלמן Reddy סריניוואסה עבור שלהם תפקיד מפתח בפיתוח של חזרות קודמות של מודל זה. T.A.A. נתמך על ידי RMIT אוניברסיטת סגן-הנשיא של הבתר-דוקטורים. AJ AH נתמכים על ידי מענק פרוייקט NHMRC 1108792. TK נתמך על-ידי NIH מעניקה NIH K08AI08272, גרנט NIH/NCATS # µL1TR000124.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Experimental Reagents
HDL PEG (Polyethylene Glycol) Precipitating Reagent Pointe Scientific H7511
Amplex Red reagent. Life Technologies, Grand Island, NY A12216 Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
DMSO. Life Technologies, Grand Island, NY A12216 Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
Horse Radish Peroxidase (HRP) Life Technologies, Grand Island, NY A12216 Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
Cholesterol Esterase. Life Technologies, Grand Island, NY A12216 Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
Cholesterol Reference standard Life Technologies, Grand Island, NY A12216 Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
Resorufin fluorescense Reference standard Life Technologies, Grand Island, NY A12216 Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
5x Reaction Buffer. Life Technologies, Grand Island, NY A12216 Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
HDL Cholesterol Automated Reagent ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. TR39601
Name Company Catalog Number Comments
Plasticware
96-well plates (polypropylene, flat bottom, clear). Sigma Aldrich M0687
96-well plates (polypropylene, flat bottom, black). Sigma Aldrich M9936
1.5 mL Eppendorf tubes Eppendorf 0030 125.150
ClipTip 200, sterile ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. 14-488-058
Thermo Scientific Multichannel Pipettes, 8-channel, 125  ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.  14-387--955
Name Company Catalog Number Comments
Software
Gen5 2.01 software Biotek, Vermont, USA NA
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Gen5 Plate reader Biotek, Vermont, USA NA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gordon, D. J., Rifkind, B. M. High-density lipoprotein--the clinical implications of recent studies. N Engl J Med. 321, 1311-1316 (1989).
  2. Rubins, H. B., et al. Gemfibrozil for the secondary prevention of coronary heart disease in men with low levels of high-density lipoprotein cholesterol. Veterans Affairs High-Density Lipoprotein Cholesterol Intervention Trial Study Group. N Engl J Med. 341, 410-418 (1999).
  3. Voight, B. F., et al. Plasma HDL cholesterol and risk of myocardial infarction: a mendelian randomisation study. Lancet. 380, 572-580 (2012).
  4. Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Fogelman, A. M. HDL and cardiovascular disease: atherogenic and atheroprotective mechanisms. Nat.Rev Cardiol. 8, 222-232 (2011).
  5. Navab, M., et al. The double jeopardy of HDL. Ann Med. 37, 173-178 (2005).
  6. Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Anantharamaiah, G. M., Fogelman, A. M. The role of dysfunctional HDL in atherosclerosis. J Lipid Res. 50, Suppl . S145-S149 (2009).
  7. Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Fogelman, A. M. HDL and cardiovascular disease: atherogenic and atheroprotective mechanisms. Nat Rev Cardiol. 8, 222-232 (2011).
  8. Patel, S., et al. Reconstituted high-density lipoprotein increases plasma high-density lipoprotein anti-inflammatory properties and cholesterol efflux capacity in patients with type 2 diabetes. J Am Coll Cardiol. 53, 962-971 (2009).
  9. Navab, M., et al. HDL and the inflammatory response induced by LDL-derived oxidized phospholipids. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 21, 481-488 (2001).
  10. Hayek, T., Oiknine, J., Brook, J. G., Aviram, M. Role of HDL apolipoprotein E in cellular cholesterol efflux: studies in apo E knockout transgenic mice. Biochem Biophys Res Commun. 205, 1072-1078 (1994).
  11. Van Lenten, B. J., et al. Anti-inflammatory HDL becomes pro-inflammatory during the acute phase response. Loss of protective effect of HDL against LDL oxidation in aortic wall cell cocultures. J Clin Invest. 96, 2758-2767 (1995).
  12. Undurti, A., et al. Modification of high density lipoprotein by myeloperoxidase generates a pro-inflammatory particle. J Biol Chem. 284, 30825-30835 (2009).
  13. Van Lenten, B. J., et al. Lipoprotein inflammatory properties and serum amyloid A levels but not cholesterol levels predict lesion area in cholesterol-fed rabbits. J Lipid Res. 48, 2344-2353 (2007).
  14. Watson, C. E., et al. Treatment of patients with cardiovascular disease with L-4F, an apo-A1 mimetic, did not improve select biomarkers of HDL function. J Lipid Res. 52, 361-373 (2011).
  15. Annema, W., et al. Impaired HDL cholesterol efflux in metabolic syndrome is unrelated to glucose tolerance status: the CODAM study. Sci Rep. 6, 27367 (2016).
  16. Movva, R., Rader, D. J. Laboratory assessment of HDL heterogeneity and function. Clin Chem. 54, 788-800 (2008).
  17. Charles-Schoeman, C., et al. Abnormal function of high-density lipoprotein is associated with poor disease control and an altered protein cargo in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 60, 2870-2879 (2009).
  18. Imaizumi, S., et al. L-4F differentially alters plasma levels of oxidized fatty acids resulting in more anti-inflammatory HDL in mice. Drug Metab Lett. 4, 139-148 (2010).
  19. Khera, A. V., et al. Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis. N Engl J Med. 364, 127-135 (2011).
  20. Morgantini, C., et al. Anti-inflammatory and antioxidant properties of HDLs are impaired in type 2 diabetes. Diabetes. 60, 2617-2623 (2011).
  21. Patel, P. J., Khera, A. V., Jafri, K., Wilensky, R. L., Rader, D. J. The anti-oxidative capacity of high-density lipoprotein is reduced in acute coronary syndrome but not in stable coronary artery disease. J Am Coll Cardiol. 58, 2068-2075 (2011).
  22. Watanabe, J., et al. Proteomic profiling following immunoaffinity capture of high-density lipoprotein: association of acute-phase proteins and complement factors with proinflammatory high-density lipoprotein in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 64, 1828-1837 (2012).
  23. Watanabe, J., et al. Differential association of hemoglobin with proinflammatory high density lipoproteins in atherogenic/hyperlipidemic mice. A novel biomarker of atherosclerosis. J Biol Chem. 282, 23698-23707 (2007).
  24. Watanabe, J., et al. Hemoglobin and its scavenger protein haptoglobin associate with apoA-1-containing particles and influence the inflammatory properties and function of high density lipoprotein. J Biol Chem. 284, 18292-18301 (2009).
  25. Wang, X. S., et al. A sensitive and specific ELISA detects methionine sulfoxide-containing apolipoprotein A-I in HDL. J Lipid Res. 50, 586-594 (2009).
  26. Navab, M., et al. A cell-free assay for detecting HDL that is dysfunctional in preventing the formation of or inactivating oxidized phospholipids. J Lipid Res. 42, 1308-1317 (2001).
  27. Kelesidis, T., et al. A biochemical fluorometric method for assessing the oxidative properties of HDL. J Lipid Res. 52, 2341-2351 (2011).
  28. Kelesidis, T., et al. Effects of lipid-probe interactions in biochemical fluorometric methods that assess HDL redox activity. Lipids Health Dis. 11, 87 (2012).
  29. Navab, M., et al. Mechanisms of disease: proatherogenic HDL--an evolving field. Nat Clin Pract Endocrinol Metab. 2, 504-511 (2006).
  30. Navab, M., et al. The oxidation hypothesis of atherogenesis: the role of oxidized phospholipids and HDL. J Lipid Res. 45, 993-1007 (2004).
  31. Morgantini, C., et al. HDL lipid composition is profoundly altered in patients with type 2 diabetes and atherosclerotic vascular disease. Nutr Metab Cardiovasc Dis. 24, 594-599 (2014).
  32. Kelesidis, T., et al. A high throughput biochemical fluorometric method for measuring lipid peroxidation in HDL. PLoS One. 9, e111716 (2014).
  33. Kelesidis, T., Yang, O. O., Kendall, M. A., Hodis, H. N., Currier, J. S. Dysfunctional HDL and progression of atherosclerosis in HIV-1-infected and -uninfected adults. Lipids Health Dis. 12, 23 (2013).
  34. Zanni, M. V., et al. HDL redox activity is increased in HIV-infected men in association with macrophage activation and non-calcified coronary atherosclerotic plaque. Antivir Ther. 19, 805-811 (2014).
  35. Roberts, C. K., Katiraie, M., Croymans, D. M., Yang, O. O., Kelesidis, T. Untrained young men have dysfunctional HDL compared with strength-trained men irrespective of body weight status. J Appl Physiol (1985). , 1043-1049 (2013).
  36. Davidson, W. S., et al. Weight loss surgery in adolescents corrects high-density lipoprotein subspecies and their function. Int J Obes (Lond). 41, 83-89 (2017).
  37. Kelesidis, T., et al. Predictors of impaired HDL function in HIV-1 infected compared to uninfected individuals. J Acquir Immune Defic Syndr. , (2017).
  38. Kelesidis, T., et al. Oxidized lipoproteins are associated with markers of inflammation and immune activation in HIV-1 infection. AIDS. 30, 2625-2633 (2016).
  39. Kelesidis, T., et al. Changes in plasma levels of oxidized lipoproteins and lipoprotein subfractions with atazanavir-, raltegravir-, darunavir-based initial antiviral therapy and associations with common carotid artery intima-media thickness: ACTG 5260s. Antivir Ther. , (2016).
  40. Bhattacharyya, D. K., Adak, S., Bandyopadhyay, U., Banerjee, R. K. Mechanism of inhibition of horseradish peroxidase-catalysed iodide oxidation by EDTA. Biochem J. 295 (Pt 2), 281-288 (1994).
  41. Rees, M. D., Pattison, D. I., Davies, M. J. Oxidation of heparan sulphate by hypochlorite: role of N-chloro derivatives and dichloramine-dependent fragmentation. Biochem J. 391, 125-134 (2005).
  42. Mani, K., Cheng, F., Fransson, L. A. Heparan sulfate degradation products can associate with oxidized proteins and proteasomes. J Biol Chem. 282, 21934-21944 (2007).
  43. Finley, P. R., Schifman, R. B., Williams, R. J., Lichti, D. A. Cholesterol in high-density lipoprotein: use of Mg2+/dextran sulfate in its enzymic measurement. Clin Chem. 24, 931-933 (1978).
  44. von Schenck, H., Jacobsson, M. L. Prothrombin assay standardized with an international normalization ratio (INR): goal and reality. Clin Chem. 33, 342 (1987).
  45. de Kok, J. B., et al. Normalization of gene expression measurements in tumor tissues: comparison of 13 endogenous control genes. Lab Invest. 85, 154-159 (2005).
  46. Stocker, R., Keaney, J. F. Jr Role of oxidative modifications in atherosclerosis. Physiol Rev. 84, 1381-1478 (2004).
  47. Holzer, M., et al. Aging affects high-density lipoprotein composition and function. Biochim Biophys Acta. 1831, 1442-1448 (2013).
  48. Amundson, D. M., Zhou, M. Fluorometric method for the enzymatic determination of cholesterol. J Biochem Biophys Methods. 38, 43-52 (1999).
  49. Mishin, V., Gray, J. P., Heck, D. E., Laskin, D. L., Laskin, J. D. Application of the Amplex red/horseradish peroxidase assay to measure hydrogen peroxide generation by recombinant microsomal enzymes. Free Radic Biol Med. 48, 1485-1491 (2010).
  50. Lombardi, A., et al. UCP3 translocates lipid hydroperoxide and mediates lipid hydroperoxide-dependent mitochondrial uncoupling. J Biol Chem. 285, 16599-16605 (2010).
  51. Bhattacharya, A., et al. Denervation induces cytosolic phospholipase A2-mediated fatty acid hydroperoxide generation by muscle mitochondria. J Biol Chem. 284, 46-55 (2009).
  52. Havel, R. J., Eder, H. A., Bragdon, J. H. The distribution and chemical composition of µLtracentrifugally separated lipoproteins in human serum. J Clin Invest. 34, 1345-1353 (1955).
  53. Dyerberg, J. Comments on the quantitation of lipoproteins by agarose-gel electrophoresis. Clin Chim Acta. 61, 103-104 (1975).
  54. Warnick, G. R., Cheung, M. C., Albers, J. J. Comparison of current methods for high-density lipoprotein cholesterol quantitation. Clin Chem. 25, 596-604 (1979).
  55. Demacker, P. N., Hijmans, A. G., Vos-Janssen, H. E., van't Laar, A., Jansen, A. P. A study of the use of polyethylene glycol in estimating cholesterol in high-density lipoprotein. Clin Chem. 26, 1775-1779 (1980).
  56. Izzo, C., Grillo, F., Murador, E. Improved method for determination of high-density-lipoprotein cholesterol I. Isolation of high-density lipoproteins by use of polyethylene glycol 6000. Clin Chem. 27, 371-374 (1981).
  57. Patel, P. J., Khera, A. V., Wilensky, R. L., Rader, D. J. Anti-oxidative and cholesterol efflux capacities of high-density lipoprotein are reduced in ischaemic cardiomyopathy. Eur J Heart Fail. 15, 1215-1219 (2013).
  58. Roche, M., Rondeau, P., Singh, N. R., Tarnus, E., Bourdon, E. The antioxidant properties of serum albumin. FEBS Lett. 582, 1783-1787 (2008).
  59. Panzenbock, U., Kritharides, L., Raftery, M., Rye, K. A., Stocker, R. Oxidation of methionine residues to methionine sulfoxides does not decrease potential antiatherogenic properties of apolipoprotein A-I. J Biol Chem. 275, 19536-19544 (2000).

Tags

אימונולוגיה גיליון 128 פונקציית ה-HDL תחמוצת HDL השומנים peroxidation ללא תא assay שיטת fluorometric Amplex האדום
ללא תא הביוכימי Fluorometric Assay אנזימטי למדידה תפוקה גבוהה של שומנים בדם Peroxidation של ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sen Roy, S., Nguyen, H. C. X.,… More

Sen Roy, S., Nguyen, H. C. X., Angelovich, T. A., Hearps, A. C., Huynh, D., Jaworowski, A., Kelesidis, T. Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein. J. Vis. Exp. (128), e56325, doi:10.3791/56325 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter