Summary
HDL 脂質過酸化反応の定量の蛍光細胞生化学アッセイをご紹介します。この迅速かつ再現可能な測定は大規模な研究で HDL 機能を決定するため使用することができ、ヒトの疾患における HDL の機能の私達の理解に貢献することができます。
Abstract
低高比重リポ蛋白コレステロール (HDL-C) は、動脈硬化性心血管疾患 (CVD) の最も強力な独立した否定的な予測因子の 1 つです。HDL-C よりもむしろ HDL の機能と構造は、アテローム性動脈硬化をより正確に予測可能性があります。いくつか HDL タンパク質と脂質組成変化 HDL の機能を損なうことは、動脈硬化症などの炎症性の状態で発生します。HDL 関数通常標準化の多数の欠点不足しているコレステロール排出分析がこれらのアッセイなどの試金に基づくセルによって決定されます。細胞アッセイは、HDL の機能細胞に基づく試金と比較してより強固な対策を与える可能性があります。HDL の酸化は、HDL の機能を損ないます。HDL は、脂質過酸化物の輸送の主要な役割と過酸化脂質の高い金額は HDL の機能異常に関係。脂質プローブの相互作用は、脂質の酸化状態を測定するため試金非酵素的蛍光の結果を解釈するときに考慮されなければなりません。これは内容を査定する HDL 脂質過酸化物 (HDLox) HDL の機能不全に貢献する細胞生化学的酵素法を開発する動機。この手法は酵素西洋わさびの過酸化酵素 (HRP) と螢光色素 (コレステロールオキシダーゼ) なし HDL-C の mg 当たり脂質過酸化物含有量を定量化できます Amplex 赤ここでプロトコルは螢光色素試薬を用いた HDL 脂質過酸化反応の describedfor 決定です。実験条件の厳格な標準化によって試金の変動を削減できます。高い HDLox 値は HDL の抗酸化機能の減少と関連付けられています。このアッセイの読み出しは、心血管疾患、全身性炎症、免疫機能障害、リスク心血管疾患や代謝表現型のサロゲート対策検証セルベースのアッセイのリードアウトに関連付けられます。この技術的なアプローチは、人間の病気、全身性炎症、酸化ストレスおよび酸化脂質 (動脈硬化) などの重要な役割がある HDL 機能を評価する手法です。
Introduction
動脈硬化性心血管疾患 (CVD) は、死の世界1,2の主要な原因です。疫学的研究は、反比例動脈硬化1,2の開発のリスクに関連付けられている一般的に高密度リポタンパク質 (HDL) コレステロールの低レベルを示しています。いくつかの研究は、HDL1,2のため抗動脈硬化の役割をサポートする HDL 減衰開始とアテローム性動脈硬化の進行メカニズムは複雑な3,4です。このように、複雑な構造と絶対レベルではなく、HDL の機能にはアテローム性動脈硬化5,6,7,8より正確に予測可能性が示唆されています。いくつか HDL タンパク質と脂質組成変化 HDL の機能を損なうことは、動脈硬化症などの炎症性の状態で発生します。これらは i) 減らす、コレステロール排出潜在的な9ii) 抗炎症作用と増加 HDL プロ炎症性蛋白6、7iii) 減少抗酸化因子レベルと活動と Hdl を減少させます。低密度リポタンパク質 (LDLox)10および iv の酸化を抑制する能力) 脂質ヒドロペルオキシド コンテンツおよび酸化還元活性 (HDLox)9,11を増やします。HDL の pleotropic 機能 (コレステロールの排出、抗酸化機能) などを評価する堅牢な試金が HDL-HDL-C クリニックでの定量を補完します。
HDL の機能通常、セルベースの方法コレステロール排出アッセイ8,12,13,14等により評価されます。これらのメソッドには、使用される電池の種類、報告の読み出しの種類、標準化の欠如とトリグリセリド7,15の交絡影響に関して重要な不均一性を含む主要な限界があります。これらの欠点は、大規模臨床研究16の困難をもたらします。細胞アッセイは、HDL の機能細胞に基づく試金と比較してより強固な対策を与える可能性があります。コレステロールの排出は HDL の最も重要な機能の 1 つが、細胞に基づく試金によってのみ決定できます。プロテオミクス17,18,19,20,21,22,など23、HDL の機能を確認する他の方法 24と HDL 機能17,22,25のセルベースの単球走化性アッセイの標準化されていない大規模な人間の研究では使用できません。
HDL が重要な抗酸化抗動脈硬化効果5,6,7,8。HDL の抗酸化機能は、以前携帯無料蛍光アッセイ26で LDL の存在下で決定されています。HDL の抗酸化能をこれらの生化学蛍光メソッドその同僚26とアラン Fogelman モハマド Navab によって開発されました。HDL 機能17,18,19,20,21,22,23 を決定するのにこれらのメソッドを使用している多くの人間研究 ,24脂質 (HDL) ・脂質 (LDL) と脂質螢光相互作用はこれら携帯無料非酵素的生化学的アッセイ HDL 関数27,28の再現性を制限可能性があります。
最近の関心は、脂質および HDL 27,29,30内の蛋白質の酸化の結果である HDL 酸化の機能的な結果を重視しています。先行研究が示されている HDL の酸化 HDL 関数27,29,30を損ないます。HDL は、脂質過酸化物の輸送の主要な役割と過酸化脂質の高い金額は HDL の機能異常に関係。このように HDL 脂質過酸化物含有量を HDL 機能9,17,20,31を決定するために使用、HDL 関数7の前のアッセイの既知の制限を付与できます。 15,27,32, HDL 脂質過酸化物含有量 (HDLox) 32を定量化する代替蛍光法を開発しました。このメソッドは、酵素西洋わさびの過酸化酵素 (HRP) と螢光色素 (コレステロールオキシダーゼ) なしの HDL-C 32mg 当たり脂質過酸化物含有量を定量化できます Amplex 赤に基づいています。アッセイの生化学的原理を図 1に示します。私たちは、この蛍光ベースのアプローチに事前 HDL 機能試金27,28の制限がないことを示しています。この試金をさらに洗練され、凍結プラズマ32,33,34,とも大規模な人間の研究で確実に使えるように、当研究室で標準化35,36,37,38,39,40,41,42このアッセイの読み出しは心血管疾患、全身性炎症、免疫機能障害、心血管疾患や代謝リスク表現型のサロゲート対策検証セルベースのアッセイのリードアウトに関連付けられて。32,33,34,35,36,37,38,39します。 ここでは、HDL の脂質過酸化物含有量 (HDLox) を測定するこの単純な、まだ強力なメソッドについて述べる。この試金することができます、使用することツールとして人間の病気で HDL 機能の役割について重要な研究の質問に答えるため全身性炎症、酸化ストレスおよび酸化脂質32(動脈硬化) など重要な役割。
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Protocol
大学からカリフォルニア州ロサンゼルス、ロサンゼルス、メルボルン、アルフレッド病院倫理委員会の承諾を倫理、ひと生体試料を用いたすべての実験を行なった
。注: 螢光色素 HDL 機能アッセイ (見なさい議論) 32 の多くのバリエーションがあります。以下最も一貫性と再現性のある結果を与えるプロトコルについて述べる。アッセイの概要は、 図 2 に示すです
。1。 標本処理
(血清セパレーター チューブで収集できる)- 使用、非溶血されました新鮮な血清またはクエン酸血漿 12-14 時間の絶食後に得られます。凍結保存したサンプルを使用している場合に、このプロトコルで説明するよう適切なコントロールが含まれます。 。
2。試金のための日 0 準備
適切なコントロールと実験の- 準備作業レイアウト サンプルし、レプリケートします。少なくともトリプリケートで各サンプルを実行します。代表 96 よくレイアウトを 図 3 に示します 。
- 数のサンプルと複製に基づくアッセイに使用する試薬のすべてのボリュームを計算します
。 注: 特定の実験の各試薬の十分なボリュームがあるかどうかを確認する各作業入荷追加 10% ボリュームが含まれます 。
- 例えば HDL、HDL-C (オプション) の測定と、fluorochromeassay の分離のためのアッセイのすべての異なるステップに必要なすべてのチューブのラベルします 。
3。日 1 - コントロールの準備
- すべての研究の 研究特定プールされる制御の準備
- プールされた血しょうか血清からコントロールのサンプルを作成するサンプルです。3 通の各プレートで 20 個のサンプルを実行する場合は、プール 200 μ L コントロールに各サンプルから 10 μ L を組み合わせます。このコントロールの HDL-C 値を決定する検査にこのプールされる制御の別の因数を与える
。 注: このプールされる制御を使用して、試金を標準化し、すべての可能な既知のアカウント (例えば凍結, 凍結融解サイクル プラズマ対マトリックス血清型) と実験的変動に影響を与えるかもしれない未知の交絡因子 27 , 28 。
- プールされた血しょうか血清からコントロールのサンプルを作成するサンプルです。3 通の各プレートで 20 個のサンプルを実行する場合は、プール 200 μ L コントロールに各サンプルから 10 μ L を組み合わせます。このコントロールの HDL-C 値を決定する検査にこのプールされる制御の別の因数を与える
- 研究所固有の品質コントロール (QCs) の準備
- 各研究室 (たとえば 5 mL 10 健康なドナーからの血漿から分離された HDL) に HDL の大規模な在庫を準備し、このいくつかの因数を凍結凍結融解サイクルを最小化する株式 。
- 使用、少なくとも 10 の異なる HDLox の平均値を決定するこの在庫からレプリケートします。測定された HDLox の許容範囲の値はそれぞれの試金に含まれている各 QC サンプル アプリケーション内では < のこの平均値の変動係数の 15% です 。
- はこのコントロール (例えば 40 mg/dL) の HDL-C 値を決定する検査にこのプールされる制御の別の因数を与える
。 注: 詳細なアプローチ血液銀行からの血を使用してこれらのコントロールを作成する方法、以前されて説明 27 , 28 , 32。必要に応じて追加の QCs を使用 (例えば 1 つが HDL 正常と異常主 HDL 機能を持っている知られているドナーから知られている健康なドナーから 。
- バック グラウンド信号と空白値 (オプション) の最適化
- 急速に形成された H 2 O を削除する培養液でカタラーゼ (1-4 U/mL) の適切な量を追加、背景を最小限に抑える 2 バッファーの自発的な空気酸化による
。 注: 空白の井戸 (ない HDL) から値が HDL サンプルの値から引かれるので結果がされている (同じ 96 well プレートに含む) プールされる制御を基準にして報告を見出したこのステップは affec ではなく実質的にt 結果。必要な場合は、カタラーゼを持つバック グラウンド信号の最適化が省略できますしたがって、.
- 急速に形成された H 2 O を削除する培養液でカタラーゼ (1-4 U/mL) の適切な量を追加、背景を最小限に抑える 2 バッファーの自発的な空気酸化による
4。HDL コレステロール HDL の沈殿物を使用しての日 1 分離
注: 市販標準化された HDL コレステロールの沈殿試薬を使用して製造元によると枯渇 apoB 血清を分離 ' s指示に従います。これらの試薬は、HDL コレステロールのレベルを決定する比色試金で広きます
。- 血しょうか血清サンプルを新鮮なを使用して (または解凍).
- プラズマと HDL コレステロール降下剤 (20 %w/v ポリエチレング リコール グリシン pH 10.0 buffer 内 (25 ° C)) の等しいボリューム (例えば 80 μ L) をミックスします 。
- 上下ピペッティングで混ぜるします 。
- の遠心分離機 x g で 10 分間 1000-2000
- (Hdl) 上清を吸引します 。
- は、理想的にすぐに HDL 脂質過酸化反応の fluorochromeassay のための分離の HDL を使用します。ただし、いくつかのサンプルは、同じ日に実行される、HDL コレステロール濃度の測定も行われるなどの手順し 4 ° C で分離された HDL を格納、fluorochromeHDL 機能の試金のため翌日使用します 。
5。孤立した HDL で HDL-C の日 1 定量
注: これは HDL-C 量で HDLox を正規化する臨床検査から HDL-C の値を使用する場合は省略可能
。- プラズマから HDL コレステロール定量化するため、標準色を使用して 27 の試金します。各ウェル内のコレステロール試薬 50 μ L を追加し、比色板リーダーと各キットで提供されるコレステロールの標準を使用してコレステロール濃度を決定する 。
6。試薬調製日 2
- HRP 5 U/mL の溶液 (範囲 1-10 U/mL) の準備の HRP とコレステロール ソリューションです 。
- 準備 20 mM 螢光色素 (例えば、Amplex 赤) ソリューション: 部屋の温度に螢光色素試薬と DMSO のバイアルを解凍します。使用前に DMSO を 200 μ l 添加の螢光色素試薬 (1 mg) を解散します。保管時に凍結ストック ソリューション ≤-20 ° C、光から保護します 。
- 正と負のコントロールの準備: 1 X ' 反応バッファー ' 正と負のコントロールとして動作してソリューションをそれぞれコレステロールと 20 mM H 2 O 2 なし 。
7。日 2 蛍光アッセイ
- 追加 50 μ L 反応バッファーを空白 (マイナス コントロール) として x 1 の.
- オプション: 各板の肯定的な制御として H 2 O 2 の 20 mM 作業ソリューションを追加します 。 実験的変動を最小限に抑え、試薬とサンプルを加えている
- は、一貫して行われていて、タイムリーに別 96 も丸底クリア、ポリスチレンやポリプロピレン プレート (プレート 1) のサンプルのすべての追加を実行します。マルチ チャンネル ピペットを使用して、特定のボリュームを 3 の 96 ウェル プレートに変換 (2-4 のプレート: ポリプロピレン、フラットのボットトム、黒) (同一のレイアウトがある) ( 図 2、 図 3)。
- たとえば、最初プレート 1 の各井戸/サンプルに孤立した HDL の 160 μ L を追加しマルチ チャンネル ピペットの使用と HDL コレステロールの 50 μ L から転送ごとの井戸/サンプル黒 96 ウェルのプレートに。ヒント各の行/列の間を変更し、すべての転送のための非フィルターのヒントを使用します 。
- 井戸にサンプルを残します。捨てないでください。試薬の添加の間洗浄ステップがありません 。
- HRP 溶液 5 の追加の 50 μ L を各ウェル U/mL (0.25 U).
注: 使用螢光色素試薬の付加の前に HRP 。
- 37 ° C で 30 分間インキュベートします。インキュベーション (試薬の付加の間洗浄ステップがないため) 後サンプルを破棄しません 。 300 の最終的な集中のための fluorochromereagent の追加 50 μ
- μ M。この時点で、全反応量は 150 μ L よく混合し、光から保護します。 。
- 評価 (冷暗所) 蛍光読み出し蛍光プレート リーダー (530/590 nm フィルター) と 37 ° C で 120 分以上毎分
。 注: は、新鮮なサンプルと短い 60 分間隔を使用します。我々 はその 120 分のアッセイ、凍結サンプルを使用して再現性のあるデータを発見した 。
- 適切なソフトウェアを使用してデータを記録します 。
8。日 3 データ解析
- 空井戸を含むすべての試料の螢光色素試薬の付加の後 120 分で蛍光ユニット (任意の単位) を記録し、すべてのコントロール 。
- 蛍光ユニットの平均値を計算する (に基づいて少なくともトリプリケート) (HDL ox_sample)。外れ値を服用しないでください (> 2 平均値から SDs) を考慮します 。
- は、次の式を使用して、バック グラウンド蛍光を減算:
- HDL コレステロール量 (HDL-C) の正規化: HDL - c (プールされたコントロールを含む) の各サンプルに対して HDLox 脂質過酸化値を正規化) (mg/dl)。結果セクションで HDL 牛 は n HDL-C のため調整を反映する (HDL-C) HDLox メジャーとして表示します。次の式を使用します:
- HDLox 脂質過酸化値プールされる制御の値に対する各サンプルの発現を標準化します。プールされる制御の (HDL-C) HDLox 脂質過酸化値 n で n (HDL-C) HDLox 脂質過酸化 (HDL-C の調整) 各サンプルの値を正規化します。結果セクションで HDL ox は実験的変動と HDL-C のための調整を反映して nHDL ox 対策として提示します。次の式を使用します:
注: このなど測定の実験的変動を減らすために他の確立された実験アプローチに似ていますが国際標準化比 (INR) 44 , 45 です。このアプローチが検証された臨床研究 32 , 33 , 34 , 35 , 36, 37, 38, 39. - 標準の品質管理試料を用いた実験結果の品質管理を行います。各研究室では、独自の品質管理 (QCs) を確立しなければなりません。理想的には知られている機能不全 HDL とサンプルから nHDLox の QC および健常者 [例えば使用プールからサンプル確立された血液バンクのドナーは、知られている併存疾患とリスクファクターがある若者からのサンプルから nHDLox の QC心血管疾患喫煙を含む]。後者のコントロールは、異なる研究室の中で結果を標準化します。これらの QCs の平均値は、確立されたに基づいて少なくとも 5 複製 (通常我々 はこの重要なステップの 10 の複製を使用して) をされます。
- チェック値の予想の範囲内の値を各試金の測定の QCs が持っているかどうか。15% の許容最大実験的変動を仮定すると、すべての測定された実験値は確立された QC の既知の平均値の 15% 以内で落ちる必要があります。次の数式を使用して、:
注: 含まれている品質管理のいずれかのサンプル (場合機能不全 HDL 対通常) (各研究室に設立) 予想の範囲外の値が HDLox を与えます、それから、実験を繰り返します 。
- チェック値の予想の範囲内の値を各試金の測定の QCs が持っているかどうか。15% の許容最大実験的変動を仮定すると、すべての測定された実験値は確立された QC の既知の平均値の 15% 以内で落ちる必要があります。次の数式を使用して、:
- 実験可変性を定量化するための変動 (CV) 係数を用いた実験結果の品質管理: CV % 値のすべてのサンプルを繰り返し > 15%。次の式を使用します:
注: (別の版) の間で測定間実験的変動と測定 (同じ板) 内の典型的な内は < 15% 2) 典型的な。測定内 CV は 1-7% と CV は 3-10% の間の典型的な interassay 間 。
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Representative Results
各 HDL サンプルの 50 μ L は、各ステップ 7.3 同様に追加されます。5 U/mL (0.25 U) は、各ステップ 7.5 同様に追加される HRP 溶液 50 μ L。サンプルはステップ 7.6 のように 37 ° C で 30 分間培養しました。螢光色素試薬 50 μ L、各ステップ 7.7 (300 μ M の最終的な集中) 同様に追加されます。(暗い) の蛍光の読み出しを毎分 120 分以上蛍光プレート リーダー (530/590 nm フィルター) と 37 ° C で評価します。代表的な蛍光データ空白、プールされた制御のため、知られている機能不全 HDL とサンプルと標準 HDL でのサンプルは、図 4に示すが。生の代表的なデータやプロトコルのセクション 8 で説明した方程式を用いた結果のステップで分析が表示されます表 1.この例では、新鮮な HDL サンプルが使用され、HDLox 値が大きいほど、一般的に新鮮な HDL が得られます。たとえば、機能不全に基づく独立したアッセイ HDL 関数と HIV 感染者から知られている HDL は、健康的な参加者からプールされた HDL と比較して脂質過酸化物の約 2 倍の比較的高い量を持っていた。図 5は、HDL 関数28,32に障害があることが知られての科目と研究の代表的な結果を示します。HIV 感染者は、約 60% 高い感染していない人と比較して (HDL-C の mg) あたり HDL 脂質過酸化物含有量の意味を持っていた。少なくともコントロール (病など慢性的な HIV 感染) することがなくグループ36,37,から HDL と比較して 10 %hdlox の相対的な違いを示すこのメソッドができた凍結 HDL と私たちの事前の公開研究、38。
図 1: HDL-C の特定量あたり HDL 脂質過酸化物含有量の定量
全身性炎症と酸化ストレスの状態の HDL は HDL の機能障害に関連付けられている脂質の過酸化物 (LOOH) (HDLox) を増加しています。HRP は、赤い蛍光らに非蛍光性螢光色素の酸化反応を触媒します。この酸化は、内因性過酸化物 (オハイオ州-) 反応の存在と HDL 脂質過酸化物 (LOOH-) によって駆動することができます。コレステロール酸化酵素なし (HRP) らは、HDL コレステロールの特定量の本質的な HDL 脂質過酸化物含有量を定量化できます。バッファーの空気酸化の結果としてのオハイオ州 - 背景の生産は、各井戸の蛍光の読み出しから差し引かれます。らは、ほとんどのサンプルの蛍光が最小限です。この図は、変更された32をされています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: HDL 脂質過酸化反応の fluorochromeassay のワークフローの概要。
0 日目: 試金のため準備: A) 96 ウェル プレート レイアウト設計、必要 (血漿/血清) のサンプルおよび試薬 (HRP の酵素、蛍光試薬、バッファー、ペグ試薬)、ラベル チューブの容積を推定
日 1: 準備アッセイおよび HDL の分離: A) ペグ試薬を用いたコントロール (制御特定のプールに関する研究、品質管理、正と負のコントロール) HDL B) 沈殿物の準備。
(1 日目の行われていない) 場合は試金および螢光色素試験日 2: 準備: A) コントロール (制御特定のプールに関する研究、品質管理、正と負のコントロール) A の準備) HDL サンプル添加: 実験的変動を最小限に抑えるため、添加試薬とサンプルを一貫して行われる、タイムリーにお勧め (例えば 160 μ L) のサンプルのすべての追加が別 96 も丸底、明確なポリスチレンやポリプロピレン プレート (プレート 1) でまず行われることを確認します。3 96 ウェル プレートに特定のボリューム (例えば 50 μ L) を転送するマルチ チャンネル ピペットを使用ことができますし、(2-4 をプレート: ポリプロピレン、底が平らな、ブラック プレート) (同一のレイアウトがある)。B) 添加 HRP: まあ C マルチ チャンネル ピペットを使用してそれぞれに 5 U/mL (0.25 U) の追加 50 μ L) 30 分 D の 37 ° C に加温) 追加 50 μ L 300 μ m/よく E マルチ チャンネル ピペットを使用してそれぞれに螢光色素試薬の) 評価 (暗い) の蛍光読み出し毎分蛍光プレート リーダー (530/590 nm フィルター) と 37 ° C で 120 分以上。
3 日目: データ解析。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3:96 ウェル プレート螢光色素 HDL 機能試金で使用される通常の代表的なレイアウト。
HDL サンプル プレートのウェルに添加のタイミングの違いは、さまざまな坑井の間自然酸化の違いにつながることができます。実験的変動を最小限に抑えるため、さまざまな坑井との間の変数の自然酸化を避けるため、試薬およびサンプルの添加が行われることを確保する一貫してタイムリーに勧め試料 (例えば 160 μ L) のすべての追加が、最初別の 96 も丸底、明確なポリスチレンやポリプロピレン プレート (プレート 1) で行われます。3 96 ウェル プレートに特定のボリューム (例えば 50 μ L) を転送するマルチ チャンネル ピペットを使用ことができますし、(2-4 をプレート: ポリプロピレン、底が平らな、ブラック プレート) (同一のレイアウトがある)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: HDL 脂質過酸化反応アッセイの代表的なデータです。
(暗い) の蛍光の読み出しを毎分 120 分以上蛍光プレート リーダー (530/590 nm フィルター) と 37 ° C で評価します。空白 (ない HDL; ネガティブ コントロール)、肯定的な制御 (H2O2)、プールされた HDL コントロール、HDL の (2 つの独立した HDL 関数に基づく機能不全 HDL を持っている知られていた患者から代表的なデータ (任意の単位) が表示されます。アッセイ コレステロール排出および単球走化性試金)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: HDL 関数の脂質過酸化物測定は、高脂質過酸化 HDL-Cの生体内の特定の金額につきコンテンツを検出できます。
HDL は分離され、50, 健常者および HIV 感染症 100 プロトコルで説明されているように HDLox が決定しました。HIV 感染者がコントロール (1.01±0.31) に比べて高い HDLox (1.59±0.53) (p < 0.001)。この図は、変更された32をされています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
ここで説明したプロトコルでは、アテローム性動脈硬化およびひと疾患における HDL 機能の役割について重要な研究の質問に答えるための強力なツールを提供しています。アッセイは、酵素増幅 (HRP) を用いた HDL-C の mg 当たり HDL 脂質過酸化物含有量を定量化します。この方法は使用される電池の種類、報告の読み出しの種類、標準化の欠如と交絡効果に関して重要な不均一性を含む事前 HDL 機能試金 (例えばコレステロールの排出法) の既知の制限事項を回避できます。トリグリセリド7,15,32。HDL の生物学的特性 (例えばコレステロール排出) ではなく生化学的の定量より再現性のある可能性があります。実験的測定間変動 < interassay 実験的変動が多くの場合は HDL 関数の細胞に基づく試金と遜色ない 10% > 15% (または報告されていない)。さらに、このアプローチは、脂質の生化学的な相互作用を制限可能性があります、蛍光プローブ32。HDL の酸化の定量は粥状動脈硬化46の病因で動脈壁内酸化ストレスの重要な役割を与えられた心血管疾患のコンテキストで関連します。動脈硬化やひと免疫不全ウイルス感染症 (hiv 感染)32など慢性的な酸化ストレスの状態で HDL 機能障害を検出するための螢光色素 HDL 機能アッセイを使いました。HDL の機能の生化学的な試金を使用して、いくつかの研究が肥満や心血管疾患19,21,27,34,35 HDLox 協会を確認しています。 ,36,47。大幅に人間のパイロット研究では我々 は HDLox の検証された細胞に基づく試金、関連付け心血管疾患、全身性炎症、免疫機能不全の対策をサロゲートし、心血管疾患や代謝リスクを関連付けられているを実証表現型32,36。この試金は、慢性的な HIV 感染32,38, などさまざまな病気で HDL 機能の役割に対処するいくつかの研究で使用されていますがアテローム性動脈硬化の32と肥満の36、それはあることを残るCVD (心臓発作など) の利用可能な臨床的エンドポイントを持つ大規模な研究で検証。
高い蛍光らを生成する HRP の存在下で過酸化物と螢光色素の反応は十分に確立された48,49です。HRP は蛍光ら赤50,51非蛍光性螢光色素の酸化反応を触媒します。この酸化は、内因性過酸化物 (オハイオ州-) 反応の存在と HDL 脂質過酸化物 (LOOH-) によって駆動することができます。コレステロール酸化酵素なし (HRP) らは、HDL コレステロールの特定量の本質的な HDL 脂質過酸化物含有量を定量化できます。バッファーの空気酸化の結果としてのオハイオ州 - 背景の生産は、各井戸の蛍光の読み出しから差し引かれます。らは、ほとんどのサンプルの蛍光が最小限です。蛍光の読み出しの時間増は HDL 過酸化脂質によって駆動されるので、反応バッファー中のカタラーゼ (1-4 U/mL) の追加すぐに内因性過酸化物を減衰させることができます。試金は多目的、49 32,48,無料 HDL コレステロールと HDL コレステリルエステル類脂質過酸化物含有量を評価することができます。
螢光色素 HDL 機能アッセイ32の多くのバリエーションがあります。簡単に、少なくとも 3 の主要なアプローチがある:) ウェルあたり HDL (例えば 50 μ L) の特定のボリュームを追加し、後で HDL-C、臨床研究所の決定のレベルによって HDL 脂質過酸化値を正規化b) 標準的な比色コレステロール測定法に基づいて各サンプルの HDL-C の濃度を決定するし、よくあたり HDL-C (例えば 1 μ g) の具体的な金額を追加c) HDL または脊椎による HDL 機能読み出しを正規化-私タンパク質コンテンツ32。HDL 脂質過酸化反応アッセイの HDL を隔離する方法の少なくとも 3 の主要なアプローチがある: a) HDL コレステロール ポリエチレング リコール; と例えば沈殿物b) イムノアフィニティーカラム キャプチャ。c) µLtracentrifugation32などの HDL 分離その他標準ないハイスループット法。さらに、アッセイは多目的、無料 HDL コレステロール32対 HDL コレステリルエステル類脂質過酸化物含有量を評価することができます。結果任意蛍光ユニットなど、標準化されたら蛍光単位正規化プールされる制御32比率を報告するいくつかの方法があります。ここほとんど再現可能な手法を提案する.
プラズマを使用する場合抗凝固薬27,28としてクエン酸ナトリウムがあるチューブでプラズマを準備することが重要です。EDTA の40およびヘパリンの硫酸塩は酸化反応41,42と干渉することができます。ヘパリンの硫酸塩は、HDL 関数27,28の生化学的アッセイに干渉することができます。凍結保存血清と血漿が HDL 化 HDL 脂質過酸化脂質の定量に最適ではないが、凍結保存サンプルは HDL の脂質過酸化反応は、HDL の mg 当たりの相対的な違いを定量化できます。正確な同じ方法 (例えば同じ凍結融解サイクル) で特定研究内のすべてのサンプルを処理し、さまざまな研究の中でサンプル処理の違いに関連する潜在的な交絡因子を考慮して各プレートにプールされたコントロールを含めることが重要です。長期凍結保存法は HDL 機能試金43の結果を妥協できるが、場合は、適切なプールされる制御は使用される27、1 つの調査内のサンプルの間で HDL 脂質過酸化反応の相対的な違いが査定されるかもしれない 28。
重要なは、事前の HDL 機能アッセイは標準化されていません。ここで、適切なコントロールの使用により、読み出しの標準化アプローチについて述べる。特に HDL の生化学的アッセイの読み出しに影響を与える可能性がありますいくつかの既知のパラメーターがある以上はマトリックスの影響 (血漿血清対法)、アルブミンおよび他の蛋白質の存在など機能凍結、凍結融解32. 市販と実験試薬32の使用と、HDL 関数螢光色素試験を標準化できます。しかしもあります。それぞれにいくつか不明な (または悪い特徴) 交絡因子研究し、HDL の測定に影響を与える可能性があります異なる者の間で結果に機能します。したがって、各プレート (つまり同じ処理されている) 与えられた研究成果物と交絡因子32を最小限に抑えるに関心の特定の試料から調製したプールされた HDL コントロールを使用します。血漿の輸血と検査から HDL-C 値の使用はさらにアッセイ32を標準化できます。
我々 は以前に HDL 分離のさまざまな方法、HDL 関数27,28,32の生化学的アッセイの読み出しに大きく影響が、螢光色素が関係なく HDLox を確実に測定することができます。HDL 分離32。HDL の分離メソッドは、HDL の機能の高スループット研究の主な制限要因です。遠心は今日、参照法と言えますが、時間がかかる方法52のまま。電気泳動法が正確でないと53が標準化されていません。HDL 沈でん法は、ポリエチレング リコール (PEG) を沈殿させた上澄み54HDL を残して低密度リポタンパク質などのポリの使用を含みます。これらのメソッドに lipemic 血清と変数結果、コレステ手順55事前変更の干渉などいくつかの欠点を表示、元の手順を使用して標準化市販試薬は、単純な信頼性の高い、正確な手順56を生成します。PEG 沈殿物は HDL21,57患者血清から分離する一般的に使用されるメソッドが、非 HDL 蛋白質アルブミン58などの存在である主要な問題。イムノアフィニティーカラム分離は、HDL 関数32にアルブミンの影響を最小限に抑えるために使用できます。特定のキャプチャ方法の HDLox の相対的な違いを評価することができますが HDL などに対する特異抗体が HDL の複雑な構造を完全にキャプチャすることはできません。このプロトコルで説明されているように適切なコントロールを使用して、HDL 標本 (PEG 沈殿によって分離) の間で HDLox の相対的な違い確実に判断できます。
このアッセイは、HDL 関数の他のすべてのアッセイのようなキーの制限があります。生体内酸化 HDL の動脈壁はかなり複雑で異種と脂質過酸化物含有量は部分的にしか HDLox46を反映可能性があります。HDL の構造と機能は連続的に生体内で変化し、1 つの timepoint で HDL 機能の測定時間59上エンドの臓器疾患における HDL の機能不全の影響を表さない場合があります。それは知られていないかどうか HDLox 読み出しは HDL-C、または HDL タンパク質22によって正規化する必要があります。将来臨床アッセイ (HDL-C の mg 当たり HDL 脂質過酸化物含有量) の読み出しの重要性を検証します。
結論としては、螢光色素 HDL 機能アッセイは HDL (HDLox) の特定の量あたりの HDL の脂質過酸化物含有量の定量のための信頼性の高い方法です。高い HDLox 値は HDL の抗酸化機能の減少と関連付けられています。このアッセイの読み出しは検証済み細胞に基づく試金、心血管疾患、全身性炎症、免疫機能障害、心血管疾患や代謝リスク表現型19,のサロゲート対策に関連付けられている21,27,32,34,35,36,37,38,39, 47. このメソッドは、ヒトの疾患における HDL の機能の役割を調べるための便利なかつ堅牢なツールを提供しています。
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Disclosures
このプロトコルとアッセイ特許 PCT/US2015/018147 に関連しています。
Acknowledgments
作者は感謝してこのモデルの以前のイテレーションの開発の重要な役割の Dr モハマド Navab、アラン Fogelman、シュリニヴァーサ ・ レディの仕事を認めます。T.A.A. は、RMIT 大学副-一等書記官のポスドク研究員プログラムによってサポートされます。AJ と AH は、NHMRC プロジェクト助成金 1108792 でサポートされます。TK に支えられて NIH 助成金 NIH K08AI08272、NIH/NCATS グラント # µL1TR000124。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Experimental Reagents | |||
| HDL PEG (Polyethylene Glycol) Precipitating Reagent | Pointe Scientific | H7511 | |
| Amplex Red reagent. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| DMSO. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Horse Radish Peroxidase (HRP) | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Cholesterol Esterase. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Cholesterol Reference standard | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Resorufin fluorescense Reference standard | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| 5x Reaction Buffer. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| HDL Cholesterol Automated Reagent | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | TR39601 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasticware | |||
| 96-well plates (polypropylene, flat bottom, clear). | Sigma Aldrich | M0687 | |
| 96-well plates (polypropylene, flat bottom, black). | Sigma Aldrich | M9936 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| ClipTip 200, sterile | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | 14-488-058 | |
| Thermo Scientific Multichannel Pipettes, 8-channel, 125 | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | 14-387--955 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Gen5 2.01 software | Biotek, Vermont, USA | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Gen5 Plate reader | Biotek, Vermont, USA | NA |
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