Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Ячейки бесплатно биохимических флуориметрический ферментативные Assay высок объём измерения перекисного окисления липидов в липопротеинов высокой плотности

Published: October 12, 2017 doi: 10.3791/56325
Automatic Translation
1, 1, 2,3, 2, 1,4, 2,4, 1
1University of California, Los Angeles, 2Centre for Biomedical Research, Burnet Institute, 3School of Health and Biomedical Sciences, RMIT University, 4Department of Infectious Diseases, Monash University

Summary

Здесь мы описываем флуориметрический свободных клеток биохимических assay для определения HDL-перекисного окисления липидов. Этот быстрый и воспроизводимые assay может использоваться для определения функции HDL в крупных исследований масштаба и может способствовать нашему пониманию функции HDL заболеваний человека.

Abstract

Холестерина низкой липопротеинов высокой плотности (HDL-C) являются одним из самых мощных независимых негативные предикторы атеросклеротической сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ). Структура и функции ЛПВП, вместо того, чтобы HDL-C может более точно предсказать атеросклероза. Несколько HDL белков и липидов композиционные которые ухудшить HDL функции происходят изменения в воспалительных заболеваниях, таких как атеросклероз. HDL функция определяется обычно ячейки на основе анализов, таких как холестерин измеряем пробирного но эти анализы имеют многочисленные недостатки отсутствием стандартизации. Ячейки бесплатные анализы могут дать более надежные меры HDL функции по сравнению с анализов на основе ячеек. HDL окисления повреждает функцию HDL. HDL имеет главную роль в липидной перекиси транспорта и высокое количество перекисей липидов связано с ненормальной функции HDL. Липидов зонд взаимодействия следует рассматривать при интерпретации результатов неферментативного флуоресценции assays для измерения окислительное состояние липидов. Это побудило нас к разработке свободных клеток биохимических ферментативного метода для оценки HDL перекиси содержание липидов (HDLox), способствующий HDL дисфункции. Этот метод основан на фермента пероксидазы (ПХ) и флюрохром красный Amplex, которые могут количественно охарактеризовать (без холестерина оксидаза) перекиси содержание липидов на мг HDL-C. Вот протокол describedfor определение HDL-перекисного окисления с помощью флюрохром реагента. Пробирного изменчивость может быть уменьшена строгой стандартизации экспериментальных условиях. Более высокие значения HDLox связаны с снижение HDL антиоксидантные функции. Индикация этот assay связан с отсчетов проверенных анализов на основе ячеек, суррогатных мер сердечно-сосудистых заболеваний, внутрирастительного воспаления, иммунной дисфункции и связанного с ними риска сердечно-сосудистой и метаболической фенотипов. Этот технический подход является надежный метод оценки функции HDL в человеческих заболеваний, где внутрирастительного воспаления, оксидативный стресс и окисленных липидов играют ключевую роль (например, атеросклероз).

Introduction

Атеросклеротические сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) является ведущей причиной смерти во всем мире1,2. Эпидемиологические исследования показали, что низкие уровни холестерина липопротеинов высокой плотности (HDL), как правило, обратно, связанные с риском развития атеросклероза1,2. Хотя некоторые исследования поддерживают atheroprotective роль для ЛПВП1,2, механизм, по которому HDL ослабляет посвящения и прогрессирования атеросклероза является комплекс 3,4. Таким образом было высказано предположение о том, что сложная структура и функции ЛПВП, а не абсолютный уровень может более точно предсказать атеросклероза 5,6,,78. Несколько HDL белков и липидов композиционные которые ухудшить HDL функции происходят изменения в воспалительных заболеваниях, таких как атеросклероз. Эти i) сократить ее уровень холестерина измеряем потенциальных 9, ii) уменьшить противовоспалительный и повышение ЛПВП связанные pro воспалительные белки 6,7, iii) снижение антиоксидантной фактор уровней и деятельности и HDL способностью ингибировать окисления липопротеидов низкой плотности (LDLox)10 и iv) увеличить липидов гидропероксид содержание и окислительно-восстановительной деятельности (HDLox)9,11. Надежные анализы, которые оценивают pleotropic функции HDL (например холестерин измеряем, Антиоксидантная функция) может дополнить определение HDL-HDL-C в клинике.

HDL функция обычно оценивается на основе ячеек методами, такими как холестерин измеряем пробирного8,12,,1314. Эти методы имеют основные ограничения, включая значительную гетерогенность в отношении типов клеток используется, тип индикации сообщили, отсутствие стандартизации и накладывающееся воздействие триглицеридов 7,15. Эти недостатки представляют трудности для крупных клинических исследований16. Ячейки бесплатные анализы могут дать более надежные меры HDL функции по сравнению с анализов на основе ячеек. Измеряем холестерина является одним из наиболее важных функций ЛПВП, но он только может определяться на основе ячеек анализов. Другие подходы для определения HDL функции, такие как протеомики17,18,19,20,21,,2223, 24 и хемотаксис анализов на основе ячеек Моноцит HDL функция 17,,2225 не были стандартизированы и не может использоваться в крупных масштабах человеческих исследований.

HDL имеет значительные антиоксидантными atheroprotective эффект5,6,,78. Антиоксидантная функция HDL определил присутствии ЛПНП в предыдущей ячейке бесплатно флуориметрический анализов 26. Эти биохимические методы флуориметрический HDL антиоксидантные функции были первоначально разработан Мохамад Наваб и Алан Фогельман и их коллег26. Хотя многие человеческие исследования использовали эти методы для определения HDL функция 17,18,19,20,21,22,23 ,24, липидов (HDL)-липидов (ЛПНП) и липидов флюрохром взаимодействия может ограничить воспроизводимость этих клеток бесплатно неферментативного биохимических анализов HDL функция27,28.

Последнее время интерес была сосредоточена на функциональных последствий HDL окисления, что является результатом окисления липидов и белков в пределах HDL 27,29,30. Предыдущие исследования показали, что окисление HDL ухудшает HDL функция 27,29,30. HDL имеет главную роль в липидной перекиси транспорта и высокое количество перекисей липидов связано с ненормальной функции HDL. Таким образом могут быть использованы для определения HDL функция 9,17,,2031 и учитывая известные ограничения предыдущих анализов HDL функция7, HDL липидной перекиси содержание 15,27,32, мы развитых флуориметрический альтернативный метод, который дает количественную оценку HDL липидной перекиси содержание (HDLox) 32. Этот метод основан на фермента пероксидазы (ПХ) и флюрохром красный Amplex, которые могут количественно охарактеризовать (без холестерина оксидаза) перекиси содержание липидов на мг HDL-C- 32. Биохимический принцип анализа показано на рисунке 1. Мы показали, что этот подход на основе флуоресценции не имеют ограничений предварительного HDL функция анализов27,28. Этот assay далее уточнены и стандартизированы в нашей лаборатории, так, чтобы он надежно может использоваться в крупных масштабах человеческой исследований, даже с криоконсервированных плазменный 32,33,34, 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. Индикация этот assay ассоциируется с отсчетов проверенных анализов на основе ячеек, суррогатных мер сердечно-сосудистых заболеваний, внутрирастительного воспаления, иммунной дисфункции и связанного с ними риска сердечно-сосудистой и метаболической фенотипов 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39. здесь мы опишем этот простой, но надежный метод для измерения HDL липидной перекиси содержания (HDLox). Этот assay может использоваться как инструмент, ответить на вопросы важных исследований относительно роли функции HDL заболеваний человека где внутрирастительного воспаления, оксидативный стресс и окисленных липидов имеют ключевую роль (например, атеросклероз)32.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

всех экспериментов с использованием человеческого биологические образцы были выполнены с одобрения этики из университета Калифорнии-Лос-Анджелес, Лос-Анджелес и Альфред больницы человеческой этики Комитета, Мельбурне.

Примечание: существует много вариантов флюрохром HDL функции анализа (см. обсуждение) 32. Ниже мы опишем протокол, который дает наиболее последовательной и воспроизводимые результаты. Обзор анализа показано на рисунке 2.

1. образец обработки

  1. использования свежий, не Опаковые сыворотки (могут быть собраны в сыворотке разделитель трубы) или цитрата плазмы, полученные после 12-14 часов голодания. Если с помощью криоконсервированных образцов, включают соответствующий элемент управления, как описано в настоящем Протоколе.

2. День 0-подготовка для assay

  1. подготовить рабочий макет эксперимента с соответствующие элементы управления, образцы и реплицирует. Запуск каждого образца по крайней мере в triplicates. Представитель 96 хорошо схема приведена на рис. 3.
  2. Вычисления всех томов реагентов, которые будут использоваться для assay основанный на количество образцов и реплицирует.
    Примечание: Включить дополнительные 10% объем в каждой рабочей акции, чтобы убедиться, что существует достаточный объем для каждого реагента для конкретного эксперимента.
  3. Этикетка все необходимые трубы для всех различных этапов анализа, например, для разделения ЛПВП, измерение HDL-C (опционально) и fluorochromeassay.

3. День 1-Подготовка элементов управления

    1. создать образец элемента управления из пула плазме или сыворотке Подготовка исследования конкретных Объединенного управления всех исследования образцов. Если работает 20 образцов в каждой пластины в трех экземплярах, объединить 10 мкл от каждого образца в элемент управления 200 мкл пуле. Дать отдельный Алиготе этого объединенного элемента управления клиническую лабораторию для определения HDL-C значение данного элемента управления.
      Примечание: Используйте этот объединенный элемент управления для стандартизации анализа и учета всех возможных известный (например, тип матрицы сыворотки против плазмы, циклов замораживания оттаивания, криоконсервация) и неизвестных вмешивающиеся факторы, которые могут повлиять на экспериментальной изменчивости 27 , 28.
  2. Подготовка специфичные для лаборатории контроля качества (бок)
    1. подготовить большой запас HDL в каждой лаборатории (например, ЛПВП, изолированных от 5 мл плазмы от 10 здоровых доноров) и криоконсервировать несколько аликвоты этого складе для сведения к минимуму циклов замораживания оттаивания.
    2. Использование по крайней мере 10 различных реплицирует из этого фонда, чтобы определить среднее значение HDLox. Допустимый диапазон измеряемых HDLox значения для каждого образца КК, включены в калибровочных находится в пределах < 15% коэффициента вариации этого среднего значения.
    3. Дать отдельный Алиготе этого объединенного элемента управления клиническую лабораторию для определения HDL-C значение этого элемента управления (например, 40 мг/дл).
      Примечание: Детальный подход как использовать кровь от крови банков для создания этих элементов управления ранее был описан 27 , 28 , 32. Используйте дополнительные бок по мере необходимости (например, один из здоровых доноров, известно, что нормальной функции HDL и одним из доноров, известно, что во многом ненормальное функции HDL.
  3. Оптимизация фонового сигнала и пустые значения (необязательно)
    1. к минимуму фон, добавить соответствующее количество каталазы (1-4 ед/мл) в средство инкубации быстро удалить сформированные H 2 O 2 из-за окисления спонтанное воздуха буферов.
      Примечание: Поскольку значения из пустых скважин (не HDL) вычитаются из значений образцов HDL и результаты в настоящее время сообщили относительно объединенного элемента управления (который включен в пластину же 96 хорошо), мы обнаружили, что этот шаг не практически не affec t результаты. Таким образом, оптимизация фонового сигнала с каталазой может быть опущен, если это необходимо.

4. День 1-разделение HDL холестерина HDL осадков с использованием

Примечание: использование коммерчески доступных стандартизированных ЛПВП реагента, чтобы изолировать сыворотки апов в исчерпаны согласно данным производителя ' s инструкции. Эти реагенты широко используются в колориметрические анализов для определения холестерина ЛПВП.

  1. Использовать свежие (или разморозить) плазме или сыворотке образца.
  2. Смесь равных объемов (например 80 мкл) плазмы и HDL холестерина осаждения реагента (20% w/v полиэтиленгликоль в buffer глицин, pH 10.0 (25 ° C)).
  3. Смесь в хорошо закупорить вверх и вниз.
  4. Центрифуг на 1000-2000 x g 10 мин
  5. Аспирационная супернатант (HDL фракция).
  6. Идеально немедленно использовать изолированные HDL для fluorochromeassay HDL перекисного окисления липидов. Однако, если несколько образцов выполняются в тот же день, и другие шаги, такие, как измерение концентрации HDL-холестерина также сделали, затем хранить изолированных ЛПВП при температуре 4 ° C и использовать его следующий день для функции fluorochromeHDL Assay.

5. День 1-определение HDL-C в изолированных HDL

Примечание: это не является обязательным, если используется значение HDL-C от клинической лаборатории для нормализации HDLox величину HDL-C.

  1. Quantify HDL-холестерина из плазмы, используя стандартные колориметрические assays 27. Добавьте 50 мкл Реагента холестерина в каждой скважине и определения концентрации холестерина с помощью колориметрических пластины читателя и стандартный уровень холестерина, в каждый комплект.

6. День 2-Подготовка реагентов

  1. подготовить HRP и холестерина решения HRP 5 ед/мл раствора (диапазон 1-10 ед/мл).
  2. Подготовить 20 мм флюрохром (например, Amplex красный) решения: оттепель флакон флюрохром реагента и ДМСО до комнатной температуры. Перед использованием растворяют флюрохром реагента (1 мг) в 200 мкл ДМСО. Хранить замороженные в раствор ≤-20 ° C, защищать от света.
  3. Подготовить положительной и отрицательной контроля: использование 1 X ' буфер реакции ' без холестерина и 20 мм H 2 O 2 рабочего раствора как положительные и отрицательные управления, соответственно.

7. День 2-флюрохром Assay

  1. добавьте 50 мкл 1 x буфер реакции как пустой (отрицательный контроль).
  2. Дополнительно: добавить рабочий раствор 20 мм H 2 O 2 как положительный контроль в каждой пластинке.
  3. К минимуму экспериментальной изменчивости и обеспечить это добавление реагенты и образцы выполняются последовательно и своевременно, выполняют все дополнения образцов в отдельной 96 хорошо раунд снизу, ясно, из полистирола или полипропиленовые пластины (пластина 1). Затем использовать многоканальные пипетки для передачи определенных томов в 3 96-луночных пластины (плиты 2-4: полипропилен, плоские Скрипттом, черный) (которые имеют идентичные макет) ( рис. 2, рис. 3).
    1. Например, сначала мкл 160 изолированных HDL в каждый образец хорошо, плиты 1, а затем с использованием многоканальных дозаторов перевести 50 мкл HDL-холестерина из каждой скважины/образца на черный 96-луночных пластины. Изменение советы между каждым столбцом и использование нефильтрованной советы для всех переводов.
  4. Оставить образцы в скважинах. Не выбрасывайте. Существует не мыть шаги между добавлением реагентов.
  5. Добавьте 50 мкл раствора HRP 5 ед/мл (0,25 U) в каждой скважине.
    Примечание: Использование HRP перед добавлением реагента флюрохром.
  6. Инкубируйте 30 мин при температуре 37 ° C. Не выбрасывайте образцы после инкубации (не мыть шагов между дополнения реагентов).
  7. Добавьте 50 мкл fluorochromereagent для окончательного концентрации 300 мкм. На данный момент общая реакция объем составляет 150 мкл. хорошо перемешайте и защищать от света.
  8. Оценить флуоресцентные индикация (в темноте) каждую минуту более 120 минут при 37 ° C с читателем флуоресцентные пластины (530/590 нм фильтры).
    Примечание: Используйте короткие 60-минутный интервал с свежих образцов. Мы обнаружили, что 120-минутный пробирного дает больше воспроизводимость данных с использованием криоконсервированных образцов.
  9. Запись данных с использованием соответствующего программного обеспечения.

8. День 3-данных анализа

  1. запись флуоресценции единиц (произвольные единиц) на 120 минут после добавления флюрохром реактива для всех образцов, включая пустые скважин и всех элементов управления.
  2. Вычислите среднее значение флуоресценции единиц (на основе по крайней мере triplicates) (ox_sample HDL). Не принимайте промахов (> 2 ПБ от среднего значения) во внимание.
  3. Вычитание фона флуоресценции, используя следующее уравнение:
    Equation 1
  4. нормализации сумму HDL холестерина (HDL-C): нормализовать значение перекисного окисления липидов HDLox для каждого образца (в том числе Объединенный элемент управления), HDL-C) (мг/дл). Во всем разделе результаты HDL быка представлен как n (HDL-C) HDLox меры для отражения коррективов для HDL-C. Используйте следующее уравнение:
    Equation 2
  5. стандартизировать выражение значение перекисного окисления липидов HDLox каждого образца против значение объединенного элемента управления. Нормализовать n (HDL-C) HDLox липидной пероксидации значение для каждого образца (с поправкой на HDL-C), n (HDL-C) HDLox липидной пероксидации значение объединенного элемента управления. Во всем разделе результаты HDL быка представлен как nHDL быка меры для отражения коррективов для экспериментальной изменчивости и HDL-C. Используйте следующее уравнение:
    Equation 3
    Примечание: этот подход похож на другие установленные экспериментальные подходы к сокращению экспериментальных вариативности измерений такие как международный нормализованный соотношение (INR) 44 , 45. Этот подход был одобрен в клинических исследованиях 32 , 33 , 34 , , 35 36 , 37 , 38 , 39.
  6. выполнять контроль качества экспериментальных результатов с использованием стандартного контроля качества образцов. Каждая лаборатория должна создать свои собственные элементы управления качества (бок). В идеале есть КК для nHDLox из образца с известными неблагополучных HDL и КК для nHDLox из образца от здоровых доноров [например использование пула образца от молодых людей, установленных банком крови доноров и имеют не известны сопутствующие заболевания и факторы риска сердечно-сосудистые заболевания, включая Курение]. Последний элемент управления стандартизирует результаты между различными лабораториями. Средние значения этих бок, созданной на основе по крайней мере 5 реплицирует (обычно мы используем 10 реплицирует для этого важного шага).
    1. Проверить, имеют ли измеренные бок в калибровочных значений в ожидаемый диапазон значений. Предполагая, приемлемый максимальный экспериментальный изменчивость 15%, всех экспериментальных измерений должны подпадать 15% известных средних значений установленных КК. Используйте следующие уравнения:
      Equation 4
      Equation 5
      Примечание: если либо включены контроля качества образцов () нормальный против неблагополучных HDL) дает HDLox значения за пределами ожидаемого диапазона (создан в каждой лаборатории), а затем повторить эксперимент.
  7. Выполнять контроль качества экспериментальных результатов, используя коэффициент вариации (кв) для количественной оценки экспериментальных изменчивости: повторить все образцы с ООПС > 15%. Используйте следующее уравнение:
    Equation 6
    Примечание: типичный интра пробирного (в рамках же пластины) и между анализами (среди различных пластин) изменчивости и экспериментальной < 15%. 2) типичный внутри пробирного CV находится между 1-7% и типичные interassay CV, составляет 3-10%.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В каждом также шаг 7.3 добавляются 50 мкл каждого образца HDL. 50 мкл раствора HRP, 5 ед/мл (0,25 U) затем добавляются в каждой скважине как шаг 7.5. Образцы инкубируют 30 минут при 37 ° C как шаг 7,6. 50 мкл Реагента флюрохром затем добавляются в каждой скважине как шаг 7.7 (конечная концентрация 300 мкм). Флуоресцентный индикация (в темноте) затем оценивается каждую минуту в течение 120 минут при 37 ° C с читателем флуоресцентные пластины (530/590 нм фильтры). Представитель флуоресценции данных для пустых, совместного управления, примеры с известными неблагополучных HDL и с нормальной ЛПВП показано на рисунке 4. Сырые репрезентативных данных и шаг за шагом анализа результатов с помощью уравнений, описанные в разделе 8 Протокола указаны в Таблица 1. В этом примере были использованы свежие образцы HDL и выше HDLox значений обычно получаются с свежими HDL. К примеру ЛПВП, заведомо неблагополучной на основе независимых анализов HDL функции и от ВИЧ инфицированный человек имел приблизительно в 2 раза относительно большее количество липидной перекиси, по сравнению с пуле HDL от здоровых участников. Рисунок 5 показывает представитель результаты исследования с предметами, знаны, что имеют нарушения HDL функция28,32. ВИЧ-инфицированных были примерно на 60% выше означает перекиси содержание HDL-липидов (на мг HDL-C), по сравнению с неинфицированным лицам. В нашем ранее опубликованных исследований с криоконсервированных HDL этот метод был в состоянии проявить по меньшей мере 10% относительные различия в HDLox по сравнению с ЛПВП от управления группами (без болезни например хронической инфекции ВИЧ)36,37, 38.

Figure 1
Рисунок 1: Определение HDL липидной перекиси содержания за определенное количество HDL-C.
В Штатах системного воспаления и окислительного стресса HDL увеличилась перекисей липидов (LOOH) (HDLox), которые связаны с нарушениями функции HDL. HRP катализирует окисление не люминесцентных флюрохром для люминесцентных resorufin красный. Эта окисления может управляться эндогенного пероксидов в реакции (OH-) и HDL-липидных пероксидов (LOOH-). Без холестерина оксидазы resorufin (с ПХ) могут количественно охарактеризовать внутреннюю HDL перекиси содержания липидов определенное количество холестерина ЛПВП. OH - в результате окисления кислородом воздуха буфера фона производства вычитается из флуоресцентных индикация каждой скважины. Resorufin имеет минимальный аутофлюоресценция в большинстве проб. Эта цифра была модифицированных 32. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: Обзор рабочего процесса для fluorochromeassay HDL перекисного окисления липидов.
День 0: Подготовка для assay: A) дизайн 96 хорошо пластины макетов, оценить объем необходимых образцов (плазмы/сыворотка) и реагенты (энзимом HRP, флюрохром реагент, буферы, PEG реагент), этикетке трубки
День 1: Подготовка для пробы и ЛПВП изоляции: A) подготовка контроля (исследование пул конкретного контроля, контроля качества, положительной и отрицательной контроля) B) HDL осадков с использованием PEG реагента.
День 2: Подготовка к assay (если не сделано в 1 день) и флюрохром пробирного: A) подготовка контроля (исследование пул конкретного контроля, контроля качества, положительной и отрицательной контроля) A) Добавление образцов HDL: для сведения к минимуму экспериментальной изменчивости и Убедитесь, что реагенты и образцы будут осуществляться последовательно и своевременно рекомендуется, что все дополнения образцов (например, 160 мкл) впервые сделано в отдельный 96 хорошо раунд снизу, ясно, полистироловые или полипропиленовые пластины (пластина 1). Многоканальные пипетки может использоваться для передачи определенных томов (например 50 мкл) в 3 96-луночных пластины (плиты 2-4: полипропилен, Пологое дно, черные плиты) (которые имеют идентичные макета). B) дополнение HRP: Добавьте 50 мкл 5 ед/мл (0,25 U) для каждой хорошо с помощью многоканальных дозаторов C) инкубировать при 37 ° C за 30 мин D) добавьте 50 мкл 300 мкм/хорошо флюрохром реагент для каждой хорошо с помощью многоканальных дозаторов E) оценить каждую минуту флуоресцентные индикация (в темноте) более чем в 120 минут при 37 ° C с читателем флуоресцентные пластины (530/590 нм фильтры).
День 3: Анализ данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: Представитель макет 96 хорошо пластин, которые обычно используются в функции флюрохром HDL Assay.
Различия в сроках добавления образцов HDL в скважины пластины может привести к различия в спонтанной окисления между различными скважин. Для сведения к минимуму экспериментальной изменчивости, избежать переменной спонтанное окисления между различными скважин и обеспечить добавлением реагенты и образцы будут осуществляться последовательно и своевременно, рекомендуется, что все дополнения образцов (например, 160 мкл) впервые сделано в отдельный 96 хорошо раунд снизу, ясно, полистироловые или полипропиленовые пластины (пластина 1). Многоканальные пипетки может использоваться для передачи определенных томов (например 50 мкл) в 3 96-луночных пластины (плиты 2-4: полипропилен, Пологое дно, черные плиты) (которые имеют идентичные макета). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: Репрезентативных данных HDL пробирного перекисного окисления липидов.
Флуоресцентный индикация (в темноте) затем оценивается каждую минуту в течение 120 минут при 37 ° C с читателем флуоресцентные пластины (530/590 нм фильтры). Репрезентативных данных (условные единицы) отображаются пустые (не HDL; негативный контроль), положительный контроль (H2O2), Объединенный HDL контроля и ЛПВП от пациента, известно, что неблагополучные HDL (на основе двух независимых HDL функции измеряем анализов холестерина и Моноцит хемотаксис assay). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: Липидной перекиси assay HDL функции может обнаружить жирами пероксид контента за определенное количество HDL-C в естественных условиях.
HDL был изолирован и HDLox было установлено, как описано в протоколе в 50 здоровых испытуемых и 100 пациентов с ВИЧ-инфекцией. ВИЧ-инфицированных были выше HDLox (1.59±0.53) по сравнению с элементов управления (1.01±0.31) (p < 0,001). Эта цифра была модифицированных 32. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Протокол, описанные здесь предлагает надежный инструмент ответить вопросы важных исследований относительно роли функции HDL в атеросклероза и заболеваний человека. Assay количественно перекиси содержание ЛПВП липидов на мг HDL-C помощью ферментационная амплификация (ПХ). Этот подход позволяет избежать известных ограничений предварительного HDL функция анализов (например assay измеряем холестерина) включая значительная неоднородность, что касается типов клеток, используется, тип индикации сообщили, отсутствие стандартизации и накладывающееся воздействие Триглицериды7,15,32. Определение биохимических вместо того, чтобы биологические свойства (например, измеряем холестерина) HDL может быть более воспроизводимые. Между анализами экспериментальной изменчивость < 10% выгодно анализов на основе ячеек HDL функции, где interassay экспериментальной изменчивость часто > 15% (или не сообщается). Кроме того такой подход может ограничивать биохимические взаимодействия между липидов и флуоресцентных зондов32. Определение HDL окисления является актуальным в контексте сердечно-сосудистых заболеваний, учитывая ключевую роль окислительного стресса в течение артериальной стенки в патогенезе атерогенеза 46. Мы использовали флюрохром HDL функция анализа для выявления нарушениями функции HDL в государствах хронического оксидативного стресса, таких как атеросклероз и вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) инфекции32. С помощью биохимического анализа HDL функции, несколько исследований подтвердили ассоциации HDLox ожирение и сердечно-сосудистых заболеваний 19,21,27,34,35 ,,3647. Значительно в человека экспериментальных исследований мы продемонстрировали ассоциации HDLox с проверенного анализов на основе ячеек, суррогатного меры внутрирастительного воспаления, иммунной дисфункции и сердечно-сосудистых заболеваний и связанных с ними сердечно-сосудистые и метаболические риска фенотипов32,36. Хотя в ряде исследований был использован этот assay для решения роль ЛПВП функции в различных заболеваний, как хронический ВИЧ инфекции32,38, остается атеросклероз 32 и ожирение36, проверяются в крупных исследований масштаба с имеющиеся клинические конечные CVD (например, сердечные приступы).

Реакция флюрохром с пероксидами присутствии HRP производить высоко флуоресцентный resorufin является хорошо установленным 48,49. HRP катализирует окисление флюрохром не люминесцентные флуоресцентный resorufin красный50,51. Эта окисления может управляться эндогенного пероксидов в реакции (OH-) и HDL-липидных пероксидов (LOOH-). Без холестерина оксидазы resorufin (с ПХ) могут количественно охарактеризовать внутреннюю HDL перекиси содержания липидов определенное количество холестерина ЛПВП. OH - в результате окисления кислородом воздуха буфера фона производства вычитается из флуоресцентных индикация каждой скважины. Resorufin имеет минимальный аутофлюоресценция в большинстве проб. Добавление каталазы (1-4 ед/мл) в буфере реакции быстро можно смягчить эндогенного пероксидов так, что увеличение флуоресцентные индикация с течением времени управляется HDL перекисей липидов. Является универсальным и может оценить перекиси содержание липидов в cholesteryl эфиры HDL против свободного HDL холестерина32,48,49 .

Есть много вариантов флюрохром HDL функции Assay32. Кратко существует по крайней мере 3 основных подхода:) добавить определенного объема ЛПВП (например 50 мкл) в колодец и позднее нормализовать значение перекисного окисления липидов HDL уровень HDL-C, как определено в клинической лаборатории; b) определить концентрацию каждого образца, на основе анализов Стандартные колориметрические холестерина HDL-C, а затем добавить определенное количество HDL-C (например 1 мкг) в колодец; и c) нормализует функции индикации HDL HDL или АПД-я содержание белка32. Существуют также по крайней мере 3 основных подхода как изолировать HDL для ЛПВП липидной пероксидации анализов:) HDL холестерина осадков, например с полиэтиленгликоля; b) Immunoaffinity захвата; и c) другие стандартные методы не высок объём для ЛПВП изоляции таких µLtracentrifugation32. Кроме того универсален и может оценить перекиси содержание липидов в cholesteryl эфиры HDL против свободного холестерина HDL 32. Есть несколько способов, чтобы сообщить результаты например произвольных флуоресценции единиц, стандартизированных resorufin флуоресценции единиц, нормализуется соотношение для совместного управления32. Здесь мы представляем наиболее воспроизводимый подход.

Если используется плазменная важно подготовить плазмы в трубах, которые имеют цитрат натрия как антикоагулянт 27,28. 40 и гепарин сульфат ЭДТА может мешать реакции окисления 41,42. Гепарин сульфат может мешать биохимических анализов HDL функция 27,28. Хотя криоконсервированных сыворотки и плазмы субоптимальные для определения липиды, функция HDL и ЛПВП перекисного окисления липидов, криоконсервированных образцов можно количественно относительные различия в HDL перекисного окисления липидов на мг ЛПВП. Это важно для обработки всех образцов в пределах конкретного исследования в точно так же (например же циклов замораживания оттаивания) и включают в себя элемент пула в каждой пластины для учета потенциальных вмешивающиеся факторы, связанные с различиями в пример обработки среди различных исследований. Долгосрочный криоконсервирования может поставить под угрозу результаты анализов функции HDL43 , но относительные различия в HDL перекисного среди образцов в рамках одного исследования все еще может быть произведена, если соответствующего объединенного элемента управления является используется 27, 28.

Важно отметить, что ранее HDL функция анализов не стандартизированы. Здесь мы опишем подход, где использование надлежащего контроля обеспечивает стандартизацию индикация. Более конкретно, существует несколько известных параметров, которые могут повлиять на значение индикации биохимических анализов ЛПВП функционировать как матрица эффектов (Сыворотка против метод подготовки плазмы), наличие альбумин и другие белки, криоконсервация, замораживания оттаивания 32. HDL функция флюрохром assay может быть стандартизирована с использование коммерчески доступных стандартов и экспериментальной реагентов32. Однако есть такженесколько неизвестных (или плохо характеризуется) вмешивающиеся факторы в каждом изучать и среди различных лиц, которые могут повлиять на определение HDL функции результаты. Таким образом в каждой пластинке мы используем элемент пула HDL готовится из конкретных образцов интерес в рамках данного исследования, (которые были обработаны одинаково), который минимизирует артефакты и вмешивающиеся факторы32. Использование плазмы крови Банк образцов и HDL-C значений из клинической лаборатории далее можно стандартизировать пробирного32.

Ранее мы показали, что различные методы изоляции HDL может существенно повлиять на индикации биохимических анализов HDL функция 27,28,32 , но флюрохром можно надежно измерить HDLox независимо от HDL изоляции 32. HDL изоляции методы являются основным ограничивающим фактором для высок объём исследований HDL функции. Ultracentrifugation считается эталонным методом сегодня, но по-прежнему много времени метод52. Электрофорез неточными и не стандартизированы 53. HDL осадков методы включают использование полианионами например полиэтиленгликоля (PEG) чтобы осадить липопротеинов низкой плотности, оставляя HDL в супернатанта 54. Хотя эти методы отображаются определенные недостатки, такие как различные результаты с lipemic сывороток и взаимодействиями с ферментативные холестерина процедуры 55 предыдущих модификаций на оригинальной процедуры с использованием стандартизированных коммерчески доступных реагенты дают простой, надежной и точной процедуре56. Хотя PEG осадки часто используемый метод для изоляции HDL21,57 от пациента сыворотки, серьезной проблемой является наличие non-HDL белков, таких как альбумин58. Immunoaffinity изоляции может использоваться для минимизации влияния альбумина на HDL функция 32. Хотя можно оценить относительные различия в HDLox для захвата конкретного метода, специфических антител против HDL не может полностью захватить сложные структуры HDL. С помощью соответствующих элементов управления, как описано в настоящем Протоколе, относительные различия в HDLox среди образцов HDL (изолированные высыпанием PEG) может быть достоверно определена.

Этот assay, как все другие анализы HDL функции, имеет ключевые ограничения. В естественных условиях окисления HDL в стенке артерий является довольно сложной и неоднородной и липидной перекиси содержание может лишь частично отражают HDLox46. HDL структуры и функции непрерывно меняется в естественных условиях и измерение HDL функции в одном timepoint могут не отражать влияние HDL дисфункции в конце орган болезни течение времени59. Не известно ли HDLox индикация должна быть нормализована HDL-C, или HDL белок 22. Будущих клинических исследований следует проверить значение индикации пробирного (HDL липидной перекиси содержание на мг HDL-C).

В заключение флюрохром HDL функции анализа является надежным методом для определения содержания ЛПВП липидной перекиси за определенное количество ЛПВП (HDLox). Более высокие значения HDLox связаны с снижение HDL антиоксидантные функции. Индикация этот assay ассоциируется с проверенного анализов на основе ячеек, суррогатных мер сердечно-сосудистых заболеваний, внутрирастительного воспаления, иммунной дисфункции и связанных с ними рисков сердечно-сосудистой и метаболической фенотипов 19, 21,27,32,34,,3536,37,,3839, 47. Этот метод предлагает удобное, но надежный инструмент для изучения роли функции HDL заболеваний человека.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Этот протокол и пробирного имеют отношение к патентной PCT/US2015/018147.

Acknowledgments

Авторы с благодарностью отмечаем работу Наваб Мохамад доктор, Алан Фогельман и Редди Сриниваса за их ключевую роль в развитии более ранних итераций этой модели. T.A.A. поддерживается КМТИ университета вице-канцлера докторантура стипендий. AJ и AH поддерживаются NHMRC Грант проекта 1108792. TK поддерживается NIH предоставляет низ K08AI08272, гранта NIH/NCATS # µL1TR000124.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Experimental Reagents
HDL PEG (Polyethylene Glycol) Precipitating Reagent Pointe Scientific H7511
Amplex Red reagent. Life Technologies, Grand Island, NY A12216 Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
DMSO. Life Technologies, Grand Island, NY A12216 Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
Horse Radish Peroxidase (HRP) Life Technologies, Grand Island, NY A12216 Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
Cholesterol Esterase. Life Technologies, Grand Island, NY A12216 Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
Cholesterol Reference standard Life Technologies, Grand Island, NY A12216 Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
Resorufin fluorescense Reference standard Life Technologies, Grand Island, NY A12216 Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
5x Reaction Buffer. Life Technologies, Grand Island, NY A12216 Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
HDL Cholesterol Automated Reagent ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. TR39601
Name Company Catalog Number Comments
Plasticware
96-well plates (polypropylene, flat bottom, clear). Sigma Aldrich M0687
96-well plates (polypropylene, flat bottom, black). Sigma Aldrich M9936
1.5 mL Eppendorf tubes Eppendorf 0030 125.150
ClipTip 200, sterile ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. 14-488-058
Thermo Scientific Multichannel Pipettes, 8-channel, 125  ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.  14-387--955
Name Company Catalog Number Comments
Software
Gen5 2.01 software Biotek, Vermont, USA NA
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Gen5 Plate reader Biotek, Vermont, USA NA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gordon, D. J., Rifkind, B. M. High-density lipoprotein--the clinical implications of recent studies. N Engl J Med. 321, 1311-1316 (1989).
  2. Rubins, H. B., et al. Gemfibrozil for the secondary prevention of coronary heart disease in men with low levels of high-density lipoprotein cholesterol. Veterans Affairs High-Density Lipoprotein Cholesterol Intervention Trial Study Group. N Engl J Med. 341, 410-418 (1999).
  3. Voight, B. F., et al. Plasma HDL cholesterol and risk of myocardial infarction: a mendelian randomisation study. Lancet. 380, 572-580 (2012).
  4. Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Fogelman, A. M. HDL and cardiovascular disease: atherogenic and atheroprotective mechanisms. Nat.Rev Cardiol. 8, 222-232 (2011).
  5. Navab, M., et al. The double jeopardy of HDL. Ann Med. 37, 173-178 (2005).
  6. Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Anantharamaiah, G. M., Fogelman, A. M. The role of dysfunctional HDL in atherosclerosis. J Lipid Res. 50, Suppl . S145-S149 (2009).
  7. Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Fogelman, A. M. HDL and cardiovascular disease: atherogenic and atheroprotective mechanisms. Nat Rev Cardiol. 8, 222-232 (2011).
  8. Patel, S., et al. Reconstituted high-density lipoprotein increases plasma high-density lipoprotein anti-inflammatory properties and cholesterol efflux capacity in patients with type 2 diabetes. J Am Coll Cardiol. 53, 962-971 (2009).
  9. Navab, M., et al. HDL and the inflammatory response induced by LDL-derived oxidized phospholipids. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 21, 481-488 (2001).
  10. Hayek, T., Oiknine, J., Brook, J. G., Aviram, M. Role of HDL apolipoprotein E in cellular cholesterol efflux: studies in apo E knockout transgenic mice. Biochem Biophys Res Commun. 205, 1072-1078 (1994).
  11. Van Lenten, B. J., et al. Anti-inflammatory HDL becomes pro-inflammatory during the acute phase response. Loss of protective effect of HDL against LDL oxidation in aortic wall cell cocultures. J Clin Invest. 96, 2758-2767 (1995).
  12. Undurti, A., et al. Modification of high density lipoprotein by myeloperoxidase generates a pro-inflammatory particle. J Biol Chem. 284, 30825-30835 (2009).
  13. Van Lenten, B. J., et al. Lipoprotein inflammatory properties and serum amyloid A levels but not cholesterol levels predict lesion area in cholesterol-fed rabbits. J Lipid Res. 48, 2344-2353 (2007).
  14. Watson, C. E., et al. Treatment of patients with cardiovascular disease with L-4F, an apo-A1 mimetic, did not improve select biomarkers of HDL function. J Lipid Res. 52, 361-373 (2011).
  15. Annema, W., et al. Impaired HDL cholesterol efflux in metabolic syndrome is unrelated to glucose tolerance status: the CODAM study. Sci Rep. 6, 27367 (2016).
  16. Movva, R., Rader, D. J. Laboratory assessment of HDL heterogeneity and function. Clin Chem. 54, 788-800 (2008).
  17. Charles-Schoeman, C., et al. Abnormal function of high-density lipoprotein is associated with poor disease control and an altered protein cargo in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 60, 2870-2879 (2009).
  18. Imaizumi, S., et al. L-4F differentially alters plasma levels of oxidized fatty acids resulting in more anti-inflammatory HDL in mice. Drug Metab Lett. 4, 139-148 (2010).
  19. Khera, A. V., et al. Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis. N Engl J Med. 364, 127-135 (2011).
  20. Morgantini, C., et al. Anti-inflammatory and antioxidant properties of HDLs are impaired in type 2 diabetes. Diabetes. 60, 2617-2623 (2011).
  21. Patel, P. J., Khera, A. V., Jafri, K., Wilensky, R. L., Rader, D. J. The anti-oxidative capacity of high-density lipoprotein is reduced in acute coronary syndrome but not in stable coronary artery disease. J Am Coll Cardiol. 58, 2068-2075 (2011).
  22. Watanabe, J., et al. Proteomic profiling following immunoaffinity capture of high-density lipoprotein: association of acute-phase proteins and complement factors with proinflammatory high-density lipoprotein in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 64, 1828-1837 (2012).
  23. Watanabe, J., et al. Differential association of hemoglobin with proinflammatory high density lipoproteins in atherogenic/hyperlipidemic mice. A novel biomarker of atherosclerosis. J Biol Chem. 282, 23698-23707 (2007).
  24. Watanabe, J., et al. Hemoglobin and its scavenger protein haptoglobin associate with apoA-1-containing particles and influence the inflammatory properties and function of high density lipoprotein. J Biol Chem. 284, 18292-18301 (2009).
  25. Wang, X. S., et al. A sensitive and specific ELISA detects methionine sulfoxide-containing apolipoprotein A-I in HDL. J Lipid Res. 50, 586-594 (2009).
  26. Navab, M., et al. A cell-free assay for detecting HDL that is dysfunctional in preventing the formation of or inactivating oxidized phospholipids. J Lipid Res. 42, 1308-1317 (2001).
  27. Kelesidis, T., et al. A biochemical fluorometric method for assessing the oxidative properties of HDL. J Lipid Res. 52, 2341-2351 (2011).
  28. Kelesidis, T., et al. Effects of lipid-probe interactions in biochemical fluorometric methods that assess HDL redox activity. Lipids Health Dis. 11, 87 (2012).
  29. Navab, M., et al. Mechanisms of disease: proatherogenic HDL--an evolving field. Nat Clin Pract Endocrinol Metab. 2, 504-511 (2006).
  30. Navab, M., et al. The oxidation hypothesis of atherogenesis: the role of oxidized phospholipids and HDL. J Lipid Res. 45, 993-1007 (2004).
  31. Morgantini, C., et al. HDL lipid composition is profoundly altered in patients with type 2 diabetes and atherosclerotic vascular disease. Nutr Metab Cardiovasc Dis. 24, 594-599 (2014).
  32. Kelesidis, T., et al. A high throughput biochemical fluorometric method for measuring lipid peroxidation in HDL. PLoS One. 9, e111716 (2014).
  33. Kelesidis, T., Yang, O. O., Kendall, M. A., Hodis, H. N., Currier, J. S. Dysfunctional HDL and progression of atherosclerosis in HIV-1-infected and -uninfected adults. Lipids Health Dis. 12, 23 (2013).
  34. Zanni, M. V., et al. HDL redox activity is increased in HIV-infected men in association with macrophage activation and non-calcified coronary atherosclerotic plaque. Antivir Ther. 19, 805-811 (2014).
  35. Roberts, C. K., Katiraie, M., Croymans, D. M., Yang, O. O., Kelesidis, T. Untrained young men have dysfunctional HDL compared with strength-trained men irrespective of body weight status. J Appl Physiol (1985). , 1043-1049 (2013).
  36. Davidson, W. S., et al. Weight loss surgery in adolescents corrects high-density lipoprotein subspecies and their function. Int J Obes (Lond). 41, 83-89 (2017).
  37. Kelesidis, T., et al. Predictors of impaired HDL function in HIV-1 infected compared to uninfected individuals. J Acquir Immune Defic Syndr. , (2017).
  38. Kelesidis, T., et al. Oxidized lipoproteins are associated with markers of inflammation and immune activation in HIV-1 infection. AIDS. 30, 2625-2633 (2016).
  39. Kelesidis, T., et al. Changes in plasma levels of oxidized lipoproteins and lipoprotein subfractions with atazanavir-, raltegravir-, darunavir-based initial antiviral therapy and associations with common carotid artery intima-media thickness: ACTG 5260s. Antivir Ther. , (2016).
  40. Bhattacharyya, D. K., Adak, S., Bandyopadhyay, U., Banerjee, R. K. Mechanism of inhibition of horseradish peroxidase-catalysed iodide oxidation by EDTA. Biochem J. 295 (Pt 2), 281-288 (1994).
  41. Rees, M. D., Pattison, D. I., Davies, M. J. Oxidation of heparan sulphate by hypochlorite: role of N-chloro derivatives and dichloramine-dependent fragmentation. Biochem J. 391, 125-134 (2005).
  42. Mani, K., Cheng, F., Fransson, L. A. Heparan sulfate degradation products can associate with oxidized proteins and proteasomes. J Biol Chem. 282, 21934-21944 (2007).
  43. Finley, P. R., Schifman, R. B., Williams, R. J., Lichti, D. A. Cholesterol in high-density lipoprotein: use of Mg2+/dextran sulfate in its enzymic measurement. Clin Chem. 24, 931-933 (1978).
  44. von Schenck, H., Jacobsson, M. L. Prothrombin assay standardized with an international normalization ratio (INR): goal and reality. Clin Chem. 33, 342 (1987).
  45. de Kok, J. B., et al. Normalization of gene expression measurements in tumor tissues: comparison of 13 endogenous control genes. Lab Invest. 85, 154-159 (2005).
  46. Stocker, R., Keaney, J. F. Jr Role of oxidative modifications in atherosclerosis. Physiol Rev. 84, 1381-1478 (2004).
  47. Holzer, M., et al. Aging affects high-density lipoprotein composition and function. Biochim Biophys Acta. 1831, 1442-1448 (2013).
  48. Amundson, D. M., Zhou, M. Fluorometric method for the enzymatic determination of cholesterol. J Biochem Biophys Methods. 38, 43-52 (1999).
  49. Mishin, V., Gray, J. P., Heck, D. E., Laskin, D. L., Laskin, J. D. Application of the Amplex red/horseradish peroxidase assay to measure hydrogen peroxide generation by recombinant microsomal enzymes. Free Radic Biol Med. 48, 1485-1491 (2010).
  50. Lombardi, A., et al. UCP3 translocates lipid hydroperoxide and mediates lipid hydroperoxide-dependent mitochondrial uncoupling. J Biol Chem. 285, 16599-16605 (2010).
  51. Bhattacharya, A., et al. Denervation induces cytosolic phospholipase A2-mediated fatty acid hydroperoxide generation by muscle mitochondria. J Biol Chem. 284, 46-55 (2009).
  52. Havel, R. J., Eder, H. A., Bragdon, J. H. The distribution and chemical composition of µLtracentrifugally separated lipoproteins in human serum. J Clin Invest. 34, 1345-1353 (1955).
  53. Dyerberg, J. Comments on the quantitation of lipoproteins by agarose-gel electrophoresis. Clin Chim Acta. 61, 103-104 (1975).
  54. Warnick, G. R., Cheung, M. C., Albers, J. J. Comparison of current methods for high-density lipoprotein cholesterol quantitation. Clin Chem. 25, 596-604 (1979).
  55. Demacker, P. N., Hijmans, A. G., Vos-Janssen, H. E., van't Laar, A., Jansen, A. P. A study of the use of polyethylene glycol in estimating cholesterol in high-density lipoprotein. Clin Chem. 26, 1775-1779 (1980).
  56. Izzo, C., Grillo, F., Murador, E. Improved method for determination of high-density-lipoprotein cholesterol I. Isolation of high-density lipoproteins by use of polyethylene glycol 6000. Clin Chem. 27, 371-374 (1981).
  57. Patel, P. J., Khera, A. V., Wilensky, R. L., Rader, D. J. Anti-oxidative and cholesterol efflux capacities of high-density lipoprotein are reduced in ischaemic cardiomyopathy. Eur J Heart Fail. 15, 1215-1219 (2013).
  58. Roche, M., Rondeau, P., Singh, N. R., Tarnus, E., Bourdon, E. The antioxidant properties of serum albumin. FEBS Lett. 582, 1783-1787 (2008).
  59. Panzenbock, U., Kritharides, L., Raftery, M., Rye, K. A., Stocker, R. Oxidation of methionine residues to methionine sulfoxides does not decrease potential antiatherogenic properties of apolipoprotein A-I. J Biol Chem. 275, 19536-19544 (2000).

Tags

Иммунология выпуск 128 функция ЛПВП окисленные HDL перекисное окисление липидов клеток Бесплатная проба флуориметрический метод красный Amplex
Ячейки бесплатно биохимических флуориметрический ферментативные Assay высок объём измерения перекисного окисления липидов в липопротеинов высокой плотности
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sen Roy, S., Nguyen, H. C. X.,… More

Sen Roy, S., Nguyen, H. C. X., Angelovich, T. A., Hearps, A. C., Huynh, D., Jaworowski, A., Kelesidis, T. Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein. J. Vis. Exp. (128), e56325, doi:10.3791/56325 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter