Summary
Vi beskriver här en fluorometric cellfria biokemisk analys för bestämning av HDL-lipidperoxidation. Denna snabba och reproducerbara analys kan användas för att bestämma HDL funktion i storskaliga studier och kan bidra till vår förståelse av HDL funktion i mänskliga sjukdomar.
Abstract
Låg high-density lipoprotein kolesterol (HDL-C) nivåer är en av de mest kraftfulla oberoende negativa prediktorer av aterosklerotisk hjärt-kärlsjukdom (CVD). Struktur och funktion av HDL i stället för HDL-C kan mer exakt förutsäga åderförkalkning. Flera förändras HDL protein och lipid sammansättning som försämrar HDL funktionen i inflammatoriska stater som åderförkalkning. HDL funktion bestäms vanligtvis av cellbaserade analyser såsom kolesterol efflux assay men dessa analyser har många nackdelar brist på standardisering. Cellfria analyser kan ge mer robusta åtgärder av HDL funktion jämfört med cellbaserade analyser. HDL oxidation försämrar HDL funktion. HDL har en viktig roll i lipid peroxid transport och hög mängd lipid peroxider är relaterad till onormal HDL funktion. Lipid-probe interaktioner bör beaktas när tolkningen av resultaten av icke-enzymatiska fluorescens analyser för mätning av lipid oxidativ tillståndet. Detta motiverade oss att utveckla en cellfria biokemiska enzymatisk metod för att bedöma HDL peroxid fettinnehållet (HDLox) som bidrar till HDL dysfunktion. Denna metod är baserad på det enzym pepparrotsperoxidas (HRP) och fluorokrom Amplex röd som kan kvantifiera (utan kolesterol oxidas) peroxid fettinnehållet per mg HDL-C. Här är ett protokoll describedfor bestämning av HDL-lipidperoxidation använder fluorokrom reagensen. Assay variabilitet kan minskas genom strikta standardisering av experimentella förhållanden. Högre HDLox värden är associerade med reducerad HDL antioxidant funktion. Avläsningen av denna analys är associerad med avläsning av validerade cellbaserade analyser, surrogat åtgärder av kardiovaskulär sjukdom, systemisk inflammation, immun dysfunktion och associerade kardiovaskulära och metabola risk fenotyper. Detta tekniska tillvägagångssätt är en robust metod att bedöma HDL funktion i mänskliga sjukdomar där systemisk inflammation, oxidativ stress och oxiderade lipider har en nyckelroll (såsom åderförkalkning).
Introduction
Aterosklerotisk hjärt-kärlsjukdom (CVD) är den ledande orsaken till dödsfall i världen1,2. Epidemiologiska studier har visat att låga nivåer av high-density lipoprotein (HDL) kolesterol är i allmänhet omvänt samband med risk för utveckling av åderförkalkning1,2. Även om flera studier stöder en kärlskyddande roll för HDL1,2, är mekanismen genom vilken HDL dämpar initiering och progression av åderförkalkning komplexa 3,4. Det har därför föreslagits att komplexa struktur och funktion av HDL i stället för absoluta nivå mer exakt kan förutsäga åderförkalkning 5,6,7,8. Flera förändras HDL protein och lipid sammansättning som försämrar HDL funktionen i inflammatoriska stater som åderförkalkning. Dessa i) minska dess kolesterol efflux potentiella 9, (ii) minska antiinflammatoriska och ökar HDL-associerade pro-inflammatoriska proteiner 6,7, iii) minskning antioxidant faktor nivåer och aktivitet och HDLs förmåga att hämma oxidation av Low Density Lipoprotein (LDLox)10 och iv) öka lipid butylhydroperoxid innehåll och redox aktivitet (HDLox)9,11. Robusta analyser som utvärderar de pleotropic funktionerna av HDL (såsom kolesterol efflux, antioxidant funktion) kan komplettera bestämning av HDL-HDL-C i kliniken.
HDL funktion bedöms vanligtvis av cellbaserade metoder såsom kolesterol efflux assay8,12,13,14. Dessa metoder har stora begränsningar inklusive betydande heterogenitet när det gäller typer av celler används, typ av avläsning rapporterade, brist på standardisering och störande effekter av triglycerider 7,15. Dessa nackdelar innebära svårigheter för stora kliniska studier16. Cellfria analyser kan ge mer robusta åtgärder av HDL funktion jämfört med cellbaserade analyser. Av kolesterol utflödet är en av de viktigaste funktionerna av HDL, men det kan bara bestämmas av cellbaserade analyser. Andra metoder att bestämma HDL funktion såsom proteomik17,18,19,20,21,22,23, 24 och cellbaserade monocyt chemotaxis analyser av HDL funktion 17,22,25 har inte standardiserats och kan inte användas i stor skala humanstudier.
HDL har betydande antioxidant kärlskyddande effekt5,6,7,8. Den antioxidant funktionen av HDL har fastställts i närvaro av LDL i föregående cell gratis fluorometric analyser 26. Dessa biokemiska fluorometric metoder av HDL antioxidant funktion utvecklades ursprungligen av Mohamad Navab och Alan Fogelman och deras kollegor26. Även om många studier har använt dessa metoder för att bestämma HDL funktion 17,18,19,20,21,22,23 ,24, blodfetter (HDL)-lipid (LDL) och lipid-fluorokrom interaktioner kan begränsa reproducerbarhet av dessa cell gratis icke-enzymatiska biokemiska analyser av HDL funktion27,28.
Senaste intresse har fokuserat på de funktionella konsekvenserna av HDL oxidation som är resultatet av oxidation av både lipider och proteiner inom HDL 27,29,30. Tidigare studier har visat att oxidation av HDL försämrar HDL funktion 27,29,30. HDL har en viktig roll i lipid peroxid transport och hög mängd lipid peroxider är relaterad till onormal HDL funktion. Således kan HDL peroxid fettinnehållet användas för att bestämma HDL funktion 9,17,20,31 och gett kända begränsningar av tidigare analyser av HDL funktion7, 15,27,32, vi utvecklat en alternativ fluorometric metod som kvantifierar HDL lipid peroxidhalten (HDLox) 32. Denna metod är baserad på det enzym pepparrotsperoxidas (HRP) och fluorokrom Amplex röd som kan kvantifiera (utan kolesterol oxidas) peroxid fettinnehållet per mg HDL-C 32. Biokemiska principen av analysen visas i figur 1. Vi har visat att denna fluorescens-baserade strategi inte har begränsningarna i föregående HDL funktion analyser27,28. Denna analys har ytterligare förfinats och standardiserat i vårt laboratorium så att den på ett tillförlitligt sätt kan användas i storskaliga mänskliga studier även med frysförvarade plasma 32,33,34, 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. avläsningen av denna analys är associerad med avläsning av validerade cellbaserade analyser, surrogat åtgärder av kardiovaskulär sjukdom, systemisk inflammation, immun dysfunktion och associerade kardiovaskulära och metabola risk fenotyper 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39. här, vi beskriver denna enkla, men ändå robust metod för att mäta HDL peroxid fettinnehållet (HDLox). Denna analys kan användas som ett verktyg för att besvara viktiga forskningsfrågor om rollen av HDL funktion i mänskliga sjukdomar där systemisk inflammation, oxidativ stress och oxiderade lipider har en nyckelroll (såsom åderförkalkning)32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alla experiment med mänskliga biologiska prover utfördes med etik godkännande från universitetar av Kalifornien Los Angeles, Los Angeles och Alfred Hospital mänskliga etikkommittén, Melbourne.
Obs: det finns många varianter av funktionen fluorokrom HDL Assay (se diskussion) 32. Nedan kommer vi att beskriva det protokoll som ger de mest konsekventa och reproducerbara resultat. En översikt av analysen visas i figur 2.
1. preparatet bearbetning
- Använd färska, icke-hemolyserade serum (kan samlas i serum separator rör) eller citrat plasma erhålls efter 12-14 timmar fasta. Inkludera om använder nedfrysta prover lämpliga kontroll som beskrivs i detta protokoll.
2. Dag 0-förberedelse för analysen
- Förbered fungerande layout av experiment med lämpliga kontroller, prover och replikerar. Kör varje prov minst i exemplar. En representant 96 väl layout visas i figur 3.
- Beräkna alla volymer av reagenser som används för analysen baseras på antal prover och replikat.
Obs: Inkludera en ytterligare 10% volym i varje fungerande lager att se till att det finns tillräckligt med volym för varje reagens för specifika experimentet. - Märka alla nödvändiga rör för alla olika steg i analysen e.g. för separation av HDL, mätning av HDL-C (tillval) och fluorochromeassay.
3. Dag 1-beredning av kontroller
- beredning av studie-specifika poolade kontroll
- skapa ett urval från poolad plasma eller serum av alla studie prover. Om kör 20 prov i varje plåt i tre exemplar, kombinera 10 µL från varje prov till en 200 µL poolade kontroll. Ge en separat alikvot av poolade kontrollen till det kliniska laboratoriet för att fastställa HDL-C värdet för denna kontroll.
Obs: Använd den här sammanslagna kontrollen att standardisera analysen och redovisa alla möjliga kända (t.ex. typ av matris serum kontra plasma, frysning-tining cykler, frysförvaring) och okända confounders som kan påverka experimentell variation 27 , 28.
- skapa ett urval från poolad plasma eller serum av alla studie prover. Om kör 20 prov i varje plåt i tre exemplar, kombinera 10 µL från varje prov till en 200 µL poolade kontroll. Ge en separat alikvot av poolade kontrollen till det kliniska laboratoriet för att fastställa HDL-C värdet för denna kontroll.
- Beredning av laboratorium-specifika kvalitetskontroll (QCs)
- förbereda ett stort lager av HDL i varje laboratorium (till exempel HDL som isolerats från 5 mL plasma från 10 friska donatorer) och frysa flera portioner av detta lager att minimera frysning-tining cykler.
- Användning minst 10 olika replikerar från detta bestånd att avgöra det genomsnittliga värdet av HDLox. Ett godtagbart intervall av uppmätta HDLox värden för varje QC prov ingår i varje test är inom < 15% av variationskoefficienten detta medelvärdet.
- Ge en separat alikvot av poolade kontrollen till det kliniska laboratoriet för att fastställa HDL-C värdet för den här kontrollen (t.ex. 40 mg/dL).
Obs: En detaljerad strategi hur man använder blod från blodbanker för att skapa dessa kontroller har tidigare varit beskrivs 27 , 28 , 32. Använda ytterligare QCs som behövs (t.ex. en från en frisk givare som känt för att ha normala HDL funktion och en från en donator som känt för att ha i stort sett onormala HDL funktion.
- Optimering av bakgrund signal och tomma värden (valfritt)
- för att minimera bakgrund, lägga till lämplig mängd katalas (1-4 U/mL) i inkubation medium att ta snabbt bort den bildade H 2 O 2 på grund av spontan luft oxidation av buffertar.
Obs: Eftersom värdena från de tomma brunnarna (inga HDL) som subtraheras från värdena av HDL proverna och resultaten blir rapporterade i förhållande till en poolad kontroll (som ingår i samma 96 väl platta), vi har funnit att detta steg inte praktiskt gör jämförel t resultat. Således, optimering av bakgrunden signalen med katalas kan utelämnas, om det behövs.
- för att minimera bakgrund, lägga till lämplig mängd katalas (1-4 U/mL) i inkubation medium att ta snabbt bort den bildade H 2 O 2 på grund av spontan luft oxidation av buffertar.
4. Dag 1-separationen av HDL-kolesterol med HDL nederbörd
Obs: använder en kommersiellt tillgänglig standardiserade HDL-kolesterol utfällning reagens för att isolera apoB utarmat serum enligt tillverkaren ' s instruktioner. Reagenserna används allmänt i kolorimetriska analyser avgöra HDL-kolesterolnivåer.
- Använda färska (eller Tina) plasma eller serum prov.
- Blanda lika stora volymer (t.ex. 80 µL) plasma och HDL kolesterol utfällning reagens (20% w/v polyetylenglykol i glycin buffert med pH 10,0 (25 ° C)).
- Blanda väl genom pipettering upp och ner.
- Centrifugera vid 1000-2000 x g i 10 min.
- Aspirera supernatanten (HDL fraktion).
- Använd helst omedelbart isolerade HDL för fluorochromeassay av HDL lipidperoxidation. Men om flera prover körs i samma dag och andra steg som mätning av HDL-kolesterol koncentration är också gjort, sedan lagra den isolerade HDL vid 4 ° C och använda den nästa dag för funktionen fluorochromeHDL Assay.
5. Dag 1-bestämning av HDL-C i isolerade HDL
Obs: Detta är valfritt om värdet för HDL-C från kliniska laboratorium för att normalisera HDLox av HDL-C belopp.
- Kvantifiera HDL-kolesterol från plasma, med standard kolorimetriska analyser 27. Tillsätt 50 µL av kolesterol reagens i varje brunn och fastställ kolesterol koncentration med en kolorimetrisk Plattläsare och en kolesterol standard i varje kit.
6. Dag 2-beredning av reagens
- förbereda HRP och kolesterol lösningar HRP 5 U/mL lösning (intervallet 1-10 U/mL).
- Förbereda 20 mM fluorokrom (t.ex. Amplex röd) lösningar: Tina en injektionsflaska fluorokrom reagens och DMSO till rumstemperatur. Före användning, lös fluorokrom reagens (1 mg) i 200 µL av DMSO. Beståndet förvaras frysta vid ≤-20 ° C, skyddas från ljus.
- Förbereda positiva och negativa kontroller: Använd 1 X ' reaktion buffert ' utan kolesterol och 20 mM H 2 O 2 arbetar lösning som en negativ och positiv kontroll, respektive.
7. Dag 2-fluorokrom Assay
- Tillsätt 50 µL av 1 x reaktion buffert som tomma (negativ kontroll).
- Tillval: Lägg till 20 mM fungerande lösning av H 2 O 2 som positiv kontroll i varje platta.
- Att minimera experimentell variationer och säkerställa att tillägg av reagenser och prover görs konsekvent och i tid, utföra alla tillägg av prover i en separat 96 väl runda-botten, tydlig, polystyren eller polypropylen plåt (plattan 1). Använd sedan en flerkanalspipett för att överföra specifika volymer i 3 96 brunnar plattor (plattor 2-4: polypropylen, flat botTom, svart) (som har identisk layout) ( figur 2, figur 3).
- Exempelvis först tillsätt 160 µL av isolerade HDL i varje brunn/prov av plattan 1 och sedan med hjälp av multikanalspipett överföra 50 µL av HDL-kolesterol från varje brunn/prov 96 brunnar svarta plattorna. Ändra tips mellan varje rad/kolumn och Använd icke-filtrerad tips för alla överföringar.
- Lämna prover i brunnarna. Kasta inte. Det finns inga tvätta steg mellan tillsats av reagenser.
- Lägga till 50 µL av HRP lösning 5 U/mL (0,25 U) till varje brunn.
Obs: Använd HRP före tillsats av fluorokrom reagensen. - Inkubera i 30 minuter vid 37 ° C. Kasta inte prover efter inkubation (ingen tvätt steg mellan tillägg av reagenser).
- Lägga till 50 µL av fluorochromereagent för en slutlig koncentration på 300 µM. Vid denna punkt, totala reaktionsvolym är 150 µL. Blanda väl och ljuskänsligt.
- Bedöma den fluorescerande avläsningen (i mörker) varje minut över 120 min vid 37 ° C med en fluorescerande Plattläsare (530/590 nm filter).
Obs: Använd kortare 60 minuters intervall med färska prover. Vi har funnit att 120-minuters test ger mer reproducerbara data med användning av nedfrysta prover. - Spela in data med hjälp av lämplig programvara.
8. Dag 3-Data analys
- Registrera fluorescens enheter (godtyckliga enheter) på 120 minuter efter tillsats av en fluorokrom reagens för alla prover inklusive tomma brunnar och alla kontroller.
- Beräkna medelvärdet av fluorescens enheter (baserat på minst tripletter) (HDL ox_sample). Ta inte extremvärden (> 2 SDs från medelvärdet) hänsyn.
- Subtrahera bakgrunden fluorescensen med hjälp av följande ekvation:
- normalisering för HDL kolesterol (HDL-C): normalisera HDLox lipid peroxidation värdet för varje prov (inklusive poolade kontroll) av HDL-C) (mg/dl). Hela resultatavsnittet presenteras HDL oxe som n (HDL-C) HDLox åtgärd att återspegla justeringen för HDL-C. Använd följande ekvation:
- standardisera uttrycket av HDLox lipid peroxidation värdet av varje prov mot värdet av en poolad kontroll. Normalisera n (HDL-C) HDLox lipid peroxidation värde för varje prov (justerat för HDL-C) av n (HDL-C) HDLox lipid peroxidation värdet i kontrollen poolade. Hela resultatavsnittet presenteras HDL oxe som nHDL ox åtgärd att återspegla justeringen för experimentell variationer och HDL-C. Använd följande ekvation:
Obs: detta tillvägagångssätt är liknar andra etablerade experimentella metoder att minska experimentell variation av mätningar som International normalized ratio (INR) 44 , 45. Detta synsätt har bekräftats i kliniska studier 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39. - utföra kvalitetskontroll av experimentella resultat med hjälp av standard kvalitet kontrollprover. Varje laboratorium bör fastställa sina egna kvalitetskontroller (QCs). Idealiskt är en QC för nHDLox från ett prov med känd dysfunktionella HDL och en QC för nHDLox från ett prov från friska donatorer [t.ex. använda samlingsprov från unga vuxna som är etablerade Blodbanken givare och har ingen känd samsjuklighet och riskfaktorer för hjärt-kärlsjukdom inklusive rökning]. Den sistnämnda kontrollen standardiserar resultaten bland olika laboratorier. Genomsnittsvärdena för dessa QCs är fastställd utifrån minst 5 replikat (vanligtvis använder vi 10 replikat för detta viktiga steg).
- Kontrollera om uppmätta QCs i varje test har värden inom det förväntade intervallet av värden. Förutsatt att en acceptabel maximal experimentella variabilitet på 15%, bör alla uppmätta experimentella värden falla inom 15% av de kända genomsnittliga värdena av etablerade QC. Använd följande ekvationer:
Obs: om antingen av ingår kvalitetskontroll prover () normal jämfört med dysfunktionella HDL) ger HDLox värden utanför förväntade intervallet (etablerat i varje laboratorium) då upprepa experimentet.
- Kontrollera om uppmätta QCs i varje test har värden inom det förväntade intervallet av värden. Förutsatt att en acceptabel maximal experimentella variabilitet på 15%, bör alla uppmätta experimentella värden falla inom 15% av de kända genomsnittliga värdena av etablerade QC. Använd följande ekvationer:
- Utföra kvalitetskontroll av experimentella resultat använder variationskoefficienten (CV) för att kvantifiera experimentell variation: Upprepa alla prover med CV % > 15%. Använd följande ekvation:
Obs: en typisk inom analysen (inom samma platta) och mellan analyser (bland olika plattor) experimentella variabilitet är < 15%. 2) en typisk inom analysen CV är mellan 1-7% och en typisk interassay CV är mellan 3-10%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
50 µL av varje HDL-prov läggs in i varje brunn som i steg 7,3. 50 μl HRP lösning 5 U/mL (0,25 U) läggs sedan in i varje brunn som i steg 7,5. Prover inkuberas i 30 minuter vid 37 ° C som i steg 7,6. 50 µL fluorokrom reagens läggs sedan in i varje brunn som i steg 7,7 (slutlig koncentration på 300 µM). Den fluorescerande avläsningen (i mörker) bedöms sedan varje minut under 120 minuter vid 37 ° C med en fluorescerande Plattläsare (530/590 nm filter). Representativa fluorescens data för tom, poolade kontroll, prov med känd dysfunktionella HDL och prov med normala HDL visas i figur 4. Representativa rådata och steg analys av resultaten med hjälp av ekvationer som beskrivs i avsnitt 8 i protokollet visas i tabell 1. I det här exemplet färska HDL prover användes och högre HDLox värden erhålls vanligtvis med färska HDL. Till exempel hade HDL kända för att vara dysfunktionella utifrån oberoende analyser av HDL funktion och från HIV-smittad person cirka 2-faldig relativt högre mängd lipid peroxid jämfört med poolade HDL från friska deltagare. Figur 5 visar representativa resultat från en studie med ämnen som är kända för att ha försämrat HDL funktion28,32. De HIV-infekterade personerna hade cirka 60 procent högre medelvärde HDL-peroxid fettinnehållet (per mg av HDL-C) jämfört med de icke-infekterade personerna. I vår tidigare publicerade studier med frysförvarade HDL var denna metod kunna påvisa minst 10% relativa skillnader i HDLox jämfört med HDL från kontroll grupper (utan sjukdom t.ex. kronisk HIV-infektion)36,37, 38.
Figur 1: Bestämning av HDL lipid peroxidhalten per specifika mängden HDL-C.
Staterna i systemisk inflammation och oxidativ stress ökat HDL lipid peroxider (LOOH) (HDLox) som är associerade med nedsatt HDL. HRP katalyserar oxidationen av icke-fluorescerande fluorokrom till fluorescerande resorufin röd. Denna oxidation kan drivas av både endogena peroxider finns i reaktionen (OH-) och HDL-lipid peroxider (LOOH-). Utan kolesterol oxidas, kan resorufin (med HRP) kvantifiera inneboende HDL peroxid fettinnehållet av ett specifikt belopp av HDL-kolesterol. Bakgrunden produktion av OH - till följd av luft oxidation av bufferten subtraheras från den fluorescerande avläsningen av varje brunn. Resorufin har minimal autofluorescens i de flesta prover. Denna siffra har varit modifierade 32. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Översikt över arbetsflödet för fluorochromeassay av HDL lipidperoxidation.
Dag 0: Förberedelse för analysen: A) utforma 96 väl plattan layouter, uppskatta volymen av behövs prover (plasma/serum) och reagenser (HRP enzym, fluorokrom reagens, buffertar, PEG reagens), märk rören
Dag 1: Förberedelser för analys och HDL isolering: A) förberedelse av kontroller (studie specifika-poolade kontroll, kvalitetskontroller, positiva och negativa kontroller) B) HDL nederbörd med PEG reagens.
Dag 2: Förberedelser för analys (om inte gjort i dag 1) och fluorokrom assay: A) förberedelse av kontroller (studie specifika-poolade kontroll, kvalitetskontroller, positiva och negativa kontroller) A) tillägg av HDL prover: att minimera experimentella variabilitet och säkerställa att tillägg av reagenser och prover kommer att göras konsekvent och i tid är det rekommenderat att alla tillägg av prover (t.ex. 160 µL) görs först i en separat 96 väl runda-botten, tydliga, polystyren eller polypropylen plattan (plattan 1). Sedan en flerkanalspipett kan användas för att överföra specifika volymer (t.ex. 50 µL) till 3 96 brunnar (plattor 2-4: polypropylen, platt botten, svarta plattor) (som har samma layout). (B) tillägg av HRP: Tillsätt 50 µL 5 U/ml (0,25 U) till varje brunn med hjälp av en flerkanalspipett C) Inkubera vid 37 ° C i 30 min D) tillsätt 50 µL av 300 µM/väl av fluorokrom reagensmedel till varje brunn med hjälp av en flerkanalspipett E) bedöma den fluorescerande avläsningen (i mörker) varje minut över 120 minuter vid 37 ° C med en fluorescerande Plattläsare (530/590 nm filter).
Dag 3: Dataanalys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Representativa layout 96 plattor som vanligtvis används i funktionen fluorokrom HDL Assay.
Skillnader i tidpunkten för tillägg av HDL prover i brunnar i en platta kan leda till skillnader i spontana oxidation mellan olika brunnar. För att minimera experimentella variabilitet, undvika rörliga spontana oxidation mellan olika brunnar och se till att tillägg av reagenser och prover kommer att göras rekommenderas konsekvent och i tid, det att alla tillägg av prover (t.ex. 160 µL) är Först görs i ett separat 96 väl runda-botten, tydliga, polystyren eller polypropylen plattan (plattan 1). Sedan en flerkanalspipett kan användas för att överföra specifika volymer (t.ex. 50 µL) till 3 96 brunnar (plattor 2-4: polypropylen, platt botten, svarta plattor) (som har samma layout). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Representativa uppgifter om HDL lipid peroxidation-analysen.
Den fluorescerande avläsningen (i mörker) bedöms sedan varje minut under 120 minuter vid 37 ° C med en fluorescerande Plattläsare (530/590 nm filter). Representativa uppgifter (godtyckliga enheter) visas för tom (ingen HDL; negativa kontroller), positiv kontroll (H2O2), poolade HDL kontroll och HDL från patienten känt för att ha dysfunktionella HDL (baserat på två oberoende HDL funktion analyser-kolesterol efflux och monocyt chemotaxis assay). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Lipid peroxid analysen av HDL funktion kan upptäcka hög lipid peroxid innehåll per specifika mängden HDL-C i vivo.
HDL isolerades och HDLox bestämdes enligt beskrivningen i protokollet hos 50 friska och 100 patienter med HIV-infektion. De HIV-infekterade personerna hade högre HDLox (1.59±0.53) jämfört med kontroller (1.01±0.31) (p < 0,001). Denna siffra har varit modifierade 32. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet beskrivs här erbjuder ett robust verktyg för att besvara viktiga forskningsfrågor om rollen av HDL funktion i åderförkalkning och mänskliga sjukdomar. Analysens kvantifierar HDL peroxid fettinnehållet per mg HDL-C med hjälp av enzymatisk amplifiering (HRP). Detta tillvägagångssätt undviker kända begränsningar av tidigare HDL funktion analyser (t.ex. kolesterol efflux analysen) inklusive betydande heterogenitet när det gäller typer av celler används, typ av avläsning rapporterade, brist på standardisering och störande effekter av triglycerider7,15,32. Bestämning av biokemiska snarare än biologiska egenskaper (t.ex. kolesterol efflux) av HDL kan vara mer reproducerbar. Mellan analyser experimentell variationer i < 10% jämför positivt med de cellbaserade analyserna av HDL funktion, där interanalysens experimentella variabilitet är ofta > 15% (eller inte rapporterat). Dessutom, detta tillvägagångssätt kan begränsa biokemiska interaktioner mellan lipider och fluorescerande sonder32. Bestämning av HDL oxidation är relevant i samband med hjärt-och kärlsjukdomar ges oxidativ stress inom kärlväggen spelar en central roll i patogenesen av aterogenes 46. Vi har använt fluorokrom HDL funktion analysen för att upptäcka nedsatt HDL i påstår av kroniska oxidativa stress såsom åderförkalkning och humant immunbristvirus (HIV) infektion32. Använder biokemisk analys av HDL funktion, har flera studier bekräftat sammanslutningen av HDLox med fetma och hjärt-kärlsjukdom 19,21,27,34,35 ,36,47. Betydligt, i mänskliga pilotstudier vi visat sammanslutningar av HDLox med validerade cellbaserade analyser, surrogat åtgärder av kardiovaskulär sjukdom, systemisk inflammation, immun dysfunktion och associerade kardiovaskulära och metabola risk fenotyper32,36. Även om denna analys har använts i flera studier för att roll i HDL funktion i olika sjukdomar såsom kronisk HIV infektion32,38, åderförkalkning 32 och fetma36, det återstår att valideras i storskaliga studier med tillgängliga kliniska effektmått av Hjärtkärlsjukdom (t.ex. hjärtinfarkt).
Fluorokrom med peroxider i närvaro av HRP att producera mycket fluorescerande resorufin reaktion är väl etablerad 48,49. HRP katalyserar oxidationen av icke-fluorescerande fluorokrom till fluorescerande resorufin röd50,51. Denna oxidation kan drivas av både endogena peroxider finns i reaktionen (OH-) och HDL-lipid peroxider (LOOH-). Utan kolesterol oxidas, kan resorufin (med HRP) kvantifiera inneboende HDL peroxid fettinnehållet av ett specifikt belopp av HDL-kolesterol. Bakgrunden produktion av OH - till följd av luft oxidation av bufferten subtraheras från den fluorescerande avläsningen av varje brunn. Resorufin har minimal autofluorescens i de flesta prover. Tillägg av katalas (1-4 U/mL) i reaktion bufferten kan snabbt dämpa endogena peroxider så att ökningen av fluorescerande utslaget över tid är driven av HDL lipid peroxider. Analysen är mångsidig och kan bedöma peroxid fettinnehållet i HDL kolesterylestrar kontra gratis HDL kolesterol32,48,49 .
Det finns många varianter av funktionen fluorokrom HDL Assay32. Kort finns det minst 3 stora tillvägagångssätt: en) lägga till en viss volym av HDL (t.ex. 50 µL) per brunn och senare normalisera HDL lipid peroxidation värdet av nivån på HDL-C som bestämts i kliniska laboratorium; (b) fastställa koncentrationen av HDL-C i varje prov baserat på standard kolorimetriska kolesterol analyser och Lägg sedan till ett specifikt belopp av HDL-C (t.ex. 1 µg) per väl; och c) normalisera HDL funktion utläsningen av HDL eller apoA-jag protein innehåll32. Det finns också minst 3 stora strategier om hur man isolera HDL för HDL lipid peroxidation analyser: a) HDL-kolesterol nederbörd e.g. med polyetylenglykol; (b) Immunoaffinity capture; och c) andra inte hög genomströmning standardmetoder för HDL isolering såsom µLtracentrifugation32. Dessutom analysen är mångsidig och kan bedöma peroxid fettinnehållet i HDL kolesterylestrar kontra gratis HDL kolesterol 32. I området i närheten finns det flera sätt att rapportera resultaten t.ex. godtyckliga fluorescens enheter, standardiserade resorufin fluorescens enheter, normaliserade kvoten till en poolad kontroll32. Här presenterar vi det mest reproducerbara tillvägagångssättet.
Om plasma används är det viktigt att förbereda plasma i rören som har natriumcitrat som de antikoagulerande 27,28. EDTA40 och heparin sulfat kan störa oxidation reaktioner 41,42. Heparin sulfat kan störa biokemiska analyser av HDL funktion 27,28. Även om nedfrysta serum och plasma är suboptimal för bestämning av lipider, HDL funktion och HDL lipidperoxidation, kan nedfrysta prover kvantifiera relativa skillnader i HDL lipidperoxidation per mg av HDL. Det är viktigt att behandla alla prover inom en specifik studie på exakt samma sätt (t.ex. samma frysning-tining cykler) och inkludera en poolad kontroll i varje platta för potentiella confounders avseende skillnader i provet behandling bland olika studier. Långsiktiga frysförvaring kan äventyra resultatet av HDL funktion analyser43 men relativa skillnader i HDL lipidperoxidation bland prover inom en studie kan fortfarande bedömas om en lämplig poolade kontroll är begagnade 27, 28.
Ännu viktigare, är tidigare HDL funktion analyser inte standardiserade. Här beskriver vi ett tillvägagångssätt där användning av lämpliga kontroller säkerställer standardisering av utslaget. Mer specifikt finns det flera kända parametrar som kan påverka avläsningen av biokemiska analyser av HDL fungera såsom matriseffekter (serum vs framställningsmetod plasma), förekomst av albumin och andra proteiner, frysförvaring, frysa-upptining 32. the HDL funktion fluorokrom assay kan normaliseras med hjälp av kommersiellt tillgängliga standarder och experimentella reagenser32. Men finns det ocksåflera okända (eller dåligt karakteriserade) confounders i varje studie och bland olika personer som kan påverka fastställandet av HDL fungerar resultat. Således i varje platta använder vi en poolad HDL kontroll beredd från specifika exemplaren av intresse inom en given studie (som har bearbetats identiskt) som minimerar artefakter och confounders32. Användning av Blodbanken plasmaprover och HDL-C värden från det kliniska laboratoriet kan ytterligare standardisera den assay32.
Vi har tidigare visat att olika metoder av HDL isolering kan väsentligt påverka avläsningen av biokemiska analyser av HDL funktion 27,28,32 men fluorokrom kan tillförlitligt mäta HDLox oavsett av den HDL isolering 32. HDL isoleringsmetoder är en viktig begränsande faktor för hög genomströmning studier av HDL funktion. Ultracentrifugering anses referensmetod idag, men är fortfarande en tidskrävande metod52. Elektrofores är otydliga och standardiserade inte 53. HDL nederbörd metoder innebär användning av polyanions såsom polyetylenglykol (PEG) utfällning låg densitet lipoproteiner lämnar HDL i supernatanten 54. Även om dessa metoder visas vissa nackdelar som variabel resultat med lipemiska serum och störningar med enzymatisk kolesterol förfaranden 55 tidigare ändringar på standardiserade den ursprungliga förfarandet med kommersiellt tillgängliga reagenser ge en enkel, pålitlig och noggrann procedur56. Även om PEG nederbörd är vanligaste metod att isolera HDL21,57 från patientens serum, är en viktig fråga förekomsten av icke-HDL proteiner såsom albumin58. Immunoaffinity isolering kan användas för att minimera effekten av albumin på HDL funktion 32. Även om relativa skillnader i HDLox för en specifik fånga metod kan bedömas, kan specifika antikroppar mot HDL fångar inte fullt ut komplexa HDL strukturer. Användning av lämpliga kontroller som beskrivs i detta protokoll, kan relativa skillnader i HDLox mellan HDL exemplar (isolerad av PEG nederbörd) bestämmas med tillförlitlighet.
Denna analys, som alla andra analyser av HDL funktion, har viktiga begränsningar. In vivo oxidation av HDL i kärlväggen är ganska komplex och heterogen och peroxid fettinnehållet kan endast delvis återspegla HDLox46. HDL struktur och funktion ändras kontinuerligt i vivo och mätning av HDL funktion vid en tidpunkt kanske inte återspeglar effekten av HDL dysfunktion i slutet orgel sjukdom över tid59. Det är inte känt huruvida HDLox utslaget bör normaliseras av HDL-C, eller HDL protein 22. Framtida studier bör validera vikten av avläsningen av analysen (HDL peroxid fettinnehållet per mg HDL-C).
Sammanfattningsvis är fluorokrom HDL funktion analysen en pålitlig metod för bestämning av HDL peroxid fettinnehållet per specifika mängden HDL (HDLox). Högre HDLox värden är associerade med reducerad HDL antioxidant funktion. Avläsningen av denna analys är associerad med validerade cellbaserade analyser, surrogat åtgärder av kardiovaskulär sjukdom, systemisk inflammation, immun dysfunktion och associerade kardiovaskulära och metabola risk fenotyper 19, 21,27,32,34,35,36,37,38,39, 47. denna metod erbjuder ett bekvämt, men robusta verktyg för att undersöka vilken roll HDL funktion i mänskliga sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Detta protokoll och analys är relevanta för de patent PCT/US2015/018147.
Acknowledgments
Författarna erkänner tacksamt arbete Dr Mohamad Navab, Alan Fogelman och Srinivasa Reddy för sin nyckelroll i utvecklingen av tidigare iterationer av denna modell. T.A.A. stöds av en RMIT University rektors postdoktorsstipendium. AJ och AH stöds av NHMRC projektbidrag 1108792. TK stöds av NIH beviljar NIH K08AI08272, NIH/NCATS bidrag nr µL1TR000124.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Experimental Reagents | |||
| HDL PEG (Polyethylene Glycol) Precipitating Reagent | Pointe Scientific | H7511 | |
| Amplex Red reagent. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| DMSO. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Horse Radish Peroxidase (HRP) | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Cholesterol Esterase. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Cholesterol Reference standard | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Resorufin fluorescense Reference standard | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| 5x Reaction Buffer. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| HDL Cholesterol Automated Reagent | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | TR39601 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasticware | |||
| 96-well plates (polypropylene, flat bottom, clear). | Sigma Aldrich | M0687 | |
| 96-well plates (polypropylene, flat bottom, black). | Sigma Aldrich | M9936 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| ClipTip 200, sterile | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | 14-488-058 | |
| Thermo Scientific Multichannel Pipettes, 8-channel, 125 | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | 14-387--955 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Gen5 2.01 software | Biotek, Vermont, USA | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Gen5 Plate reader | Biotek, Vermont, USA | NA |
References
- Gordon, D. J., Rifkind, B. M. High-density lipoprotein--the clinical implications of recent studies. N Engl J Med. 321, 1311-1316 (1989).
- Rubins, H. B., et al. Gemfibrozil for the secondary prevention of coronary heart disease in men with low levels of high-density lipoprotein cholesterol. Veterans Affairs High-Density Lipoprotein Cholesterol Intervention Trial Study Group. N Engl J Med. 341, 410-418 (1999).
- Voight, B. F., et al. Plasma HDL cholesterol and risk of myocardial infarction: a mendelian randomisation study. Lancet. 380, 572-580 (2012).
- Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Fogelman, A. M. HDL and cardiovascular disease: atherogenic and atheroprotective mechanisms. Nat.Rev Cardiol. 8, 222-232 (2011).
- Navab, M., et al. The double jeopardy of HDL. Ann Med. 37, 173-178 (2005).
- Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Anantharamaiah, G. M., Fogelman, A. M. The role of dysfunctional HDL in atherosclerosis. J Lipid Res. 50, Suppl . S145-S149 (2009).
- Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Fogelman, A. M. HDL and cardiovascular disease: atherogenic and atheroprotective mechanisms. Nat Rev Cardiol. 8, 222-232 (2011).
- Patel, S., et al. Reconstituted high-density lipoprotein increases plasma high-density lipoprotein anti-inflammatory properties and cholesterol efflux capacity in patients with type 2 diabetes. J Am Coll Cardiol. 53, 962-971 (2009).
- Navab, M., et al. HDL and the inflammatory response induced by LDL-derived oxidized phospholipids. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 21, 481-488 (2001).
- Hayek, T., Oiknine, J., Brook, J. G., Aviram, M. Role of HDL apolipoprotein E in cellular cholesterol efflux: studies in apo E knockout transgenic mice. Biochem Biophys Res Commun. 205, 1072-1078 (1994).
- Van Lenten, B. J., et al. Anti-inflammatory HDL becomes pro-inflammatory during the acute phase response. Loss of protective effect of HDL against LDL oxidation in aortic wall cell cocultures. J Clin Invest. 96, 2758-2767 (1995).
- Undurti, A., et al. Modification of high density lipoprotein by myeloperoxidase generates a pro-inflammatory particle. J Biol Chem. 284, 30825-30835 (2009).
- Van Lenten, B. J., et al. Lipoprotein inflammatory properties and serum amyloid A levels but not cholesterol levels predict lesion area in cholesterol-fed rabbits. J Lipid Res. 48, 2344-2353 (2007).
- Watson, C. E., et al. Treatment of patients with cardiovascular disease with L-4F, an apo-A1 mimetic, did not improve select biomarkers of HDL function. J Lipid Res. 52, 361-373 (2011).
- Annema, W., et al. Impaired HDL cholesterol efflux in metabolic syndrome is unrelated to glucose tolerance status: the CODAM study. Sci Rep. 6, 27367 (2016).
- Movva, R., Rader, D. J. Laboratory assessment of HDL heterogeneity and function. Clin Chem. 54, 788-800 (2008).
- Charles-Schoeman, C., et al. Abnormal function of high-density lipoprotein is associated with poor disease control and an altered protein cargo in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 60, 2870-2879 (2009).
- Imaizumi, S., et al. L-4F differentially alters plasma levels of oxidized fatty acids resulting in more anti-inflammatory HDL in mice. Drug Metab Lett. 4, 139-148 (2010).
- Khera, A. V., et al. Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis. N Engl J Med. 364, 127-135 (2011).
- Morgantini, C., et al. Anti-inflammatory and antioxidant properties of HDLs are impaired in type 2 diabetes. Diabetes. 60, 2617-2623 (2011).
- Patel, P. J., Khera, A. V., Jafri, K., Wilensky, R. L., Rader, D. J. The anti-oxidative capacity of high-density lipoprotein is reduced in acute coronary syndrome but not in stable coronary artery disease. J Am Coll Cardiol. 58, 2068-2075 (2011).
- Watanabe, J., et al. Proteomic profiling following immunoaffinity capture of high-density lipoprotein: association of acute-phase proteins and complement factors with proinflammatory high-density lipoprotein in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 64, 1828-1837 (2012).
- Watanabe, J., et al. Differential association of hemoglobin with proinflammatory high density lipoproteins in atherogenic/hyperlipidemic mice. A novel biomarker of atherosclerosis. J Biol Chem. 282, 23698-23707 (2007).
- Watanabe, J., et al. Hemoglobin and its scavenger protein haptoglobin associate with apoA-1-containing particles and influence the inflammatory properties and function of high density lipoprotein. J Biol Chem. 284, 18292-18301 (2009).
- Wang, X. S., et al. A sensitive and specific ELISA detects methionine sulfoxide-containing apolipoprotein A-I in HDL. J Lipid Res. 50, 586-594 (2009).
- Navab, M., et al. A cell-free assay for detecting HDL that is dysfunctional in preventing the formation of or inactivating oxidized phospholipids. J Lipid Res. 42, 1308-1317 (2001).
- Kelesidis, T., et al. A biochemical fluorometric method for assessing the oxidative properties of HDL. J Lipid Res. 52, 2341-2351 (2011).
- Kelesidis, T., et al. Effects of lipid-probe interactions in biochemical fluorometric methods that assess HDL redox activity. Lipids Health Dis. 11, 87 (2012).
- Navab, M., et al. Mechanisms of disease: proatherogenic HDL--an evolving field. Nat Clin Pract Endocrinol Metab. 2, 504-511 (2006).
- Navab, M., et al. The oxidation hypothesis of atherogenesis: the role of oxidized phospholipids and HDL. J Lipid Res. 45, 993-1007 (2004).
- Morgantini, C., et al. HDL lipid composition is profoundly altered in patients with type 2 diabetes and atherosclerotic vascular disease. Nutr Metab Cardiovasc Dis. 24, 594-599 (2014).
- Kelesidis, T., et al. A high throughput biochemical fluorometric method for measuring lipid peroxidation in HDL. PLoS One. 9, e111716 (2014).
- Kelesidis, T., Yang, O. O., Kendall, M. A., Hodis, H. N., Currier, J. S. Dysfunctional HDL and progression of atherosclerosis in HIV-1-infected and -uninfected adults. Lipids Health Dis. 12, 23 (2013).
- Zanni, M. V., et al. HDL redox activity is increased in HIV-infected men in association with macrophage activation and non-calcified coronary atherosclerotic plaque. Antivir Ther. 19, 805-811 (2014).
- Roberts, C. K., Katiraie, M., Croymans, D. M., Yang, O. O., Kelesidis, T. Untrained young men have dysfunctional HDL compared with strength-trained men irrespective of body weight status. J Appl Physiol (1985). , 1043-1049 (2013).
- Davidson, W. S., et al. Weight loss surgery in adolescents corrects high-density lipoprotein subspecies and their function. Int J Obes (Lond). 41, 83-89 (2017).
- Kelesidis, T., et al. Predictors of impaired HDL function in HIV-1 infected compared to uninfected individuals. J Acquir Immune Defic Syndr. , (2017).
- Kelesidis, T., et al. Oxidized lipoproteins are associated with markers of inflammation and immune activation in HIV-1 infection. AIDS. 30, 2625-2633 (2016).
- Kelesidis, T., et al. Changes in plasma levels of oxidized lipoproteins and lipoprotein subfractions with atazanavir-, raltegravir-, darunavir-based initial antiviral therapy and associations with common carotid artery intima-media thickness: ACTG 5260s. Antivir Ther. , (2016).
- Bhattacharyya, D. K., Adak, S., Bandyopadhyay, U., Banerjee, R. K. Mechanism of inhibition of horseradish peroxidase-catalysed iodide oxidation by EDTA. Biochem J. 295 (Pt 2), 281-288 (1994).
- Rees, M. D., Pattison, D. I., Davies, M. J. Oxidation of heparan sulphate by hypochlorite: role of N-chloro derivatives and dichloramine-dependent fragmentation. Biochem J. 391, 125-134 (2005).
- Mani, K., Cheng, F., Fransson, L. A. Heparan sulfate degradation products can associate with oxidized proteins and proteasomes. J Biol Chem. 282, 21934-21944 (2007).
- Finley, P. R., Schifman, R. B., Williams, R. J., Lichti, D. A. Cholesterol in high-density lipoprotein: use of Mg2+/dextran sulfate in its enzymic measurement. Clin Chem. 24, 931-933 (1978).
- von Schenck, H., Jacobsson, M. L. Prothrombin assay standardized with an international normalization ratio (INR): goal and reality. Clin Chem. 33, 342 (1987).
- de Kok, J. B., et al. Normalization of gene expression measurements in tumor tissues: comparison of 13 endogenous control genes. Lab Invest. 85, 154-159 (2005).
- Stocker, R., Keaney, J. F. Jr Role of oxidative modifications in atherosclerosis. Physiol Rev. 84, 1381-1478 (2004).
- Holzer, M., et al. Aging affects high-density lipoprotein composition and function. Biochim Biophys Acta. 1831, 1442-1448 (2013).
- Amundson, D. M., Zhou, M. Fluorometric method for the enzymatic determination of cholesterol. J Biochem Biophys Methods. 38, 43-52 (1999).
- Mishin, V., Gray, J. P., Heck, D. E., Laskin, D. L., Laskin, J. D. Application of the Amplex red/horseradish peroxidase assay to measure hydrogen peroxide generation by recombinant microsomal enzymes. Free Radic Biol Med. 48, 1485-1491 (2010).
- Lombardi, A., et al. UCP3 translocates lipid hydroperoxide and mediates lipid hydroperoxide-dependent mitochondrial uncoupling. J Biol Chem. 285, 16599-16605 (2010).
- Bhattacharya, A., et al. Denervation induces cytosolic phospholipase A2-mediated fatty acid hydroperoxide generation by muscle mitochondria. J Biol Chem. 284, 46-55 (2009).
- Havel, R. J., Eder, H. A., Bragdon, J. H. The distribution and chemical composition of µLtracentrifugally separated lipoproteins in human serum. J Clin Invest. 34, 1345-1353 (1955).
- Dyerberg, J. Comments on the quantitation of lipoproteins by agarose-gel electrophoresis. Clin Chim Acta. 61, 103-104 (1975).
- Warnick, G. R., Cheung, M. C., Albers, J. J. Comparison of current methods for high-density lipoprotein cholesterol quantitation. Clin Chem. 25, 596-604 (1979).
- Demacker, P. N., Hijmans, A. G., Vos-Janssen, H. E., van't Laar, A., Jansen, A. P. A study of the use of polyethylene glycol in estimating cholesterol in high-density lipoprotein. Clin Chem. 26, 1775-1779 (1980).
- Izzo, C., Grillo, F., Murador, E. Improved method for determination of high-density-lipoprotein cholesterol I. Isolation of high-density lipoproteins by use of polyethylene glycol 6000. Clin Chem. 27, 371-374 (1981).
- Patel, P. J., Khera, A. V., Wilensky, R. L., Rader, D. J. Anti-oxidative and cholesterol efflux capacities of high-density lipoprotein are reduced in ischaemic cardiomyopathy. Eur J Heart Fail. 15, 1215-1219 (2013).
- Roche, M., Rondeau, P., Singh, N. R., Tarnus, E., Bourdon, E. The antioxidant properties of serum albumin. FEBS Lett. 582, 1783-1787 (2008).
- Panzenbock, U., Kritharides, L., Raftery, M., Rye, K. A., Stocker, R. Oxidation of methionine residues to methionine sulfoxides does not decrease potential antiatherogenic properties of apolipoprotein A-I. J Biol Chem. 275, 19536-19544 (2000).
