Summary
Organoides intestinal culturas são estabelecidas de criptas toda e não permitem a análise de auto-renovação e diferenciação em uma célula específica de moda. Este protocolo descreve a reconstituição da haste classificada (Lgr5+) e células (Paneth), que dão origem a organoids permitindo sua prévia modificação genética e bioquímica e análise funcional de nicho.
Abstract
O epitélio intestinal é caracterizado por uma taxa extremamente rápida de volume de negócios. Nos mamíferos, o forro epithelial todo se renova dentro de 4-5 dias. Células-tronco adultas intestinais residem no fundo das criptas de Lieberkühn, são afectadas pela expressão do gene Lgr5 e preservar a homeostase através de sua característica alta taxa proliferativa1. Ao longo do intestino delgado, Lgr5+ células-tronco são entremeadas com células secretoras especializadas, chamadas células de Paneth. Células de Paneth secretam compostos antibacterianos (i.e., lisozima e cryptdins/defensinas) e exercem um papel de controlo sobre a flora intestinal. Mais recentemente, foi descoberta uma nova função para as células de Paneth, ou seja, sua capacidade para fornecer suporte de nicho de células-tronco Lgr5+ através de vários ligantes chaves como Wnt3, EGF e Dll12.
Quando isolada ex vivo e cultivados na presença de fatores de crescimento específicos e componentes da matriz extracelular, criptas intestinais todo dão origem a long-lived e auto renovar estruturas 3D chamado organoids que muito se assemelham a cripta-vilosidades arquitetura epitelial do intestino delgado adulto3. Organoides culturas, quando estabelecida de toda criptas, permitem o estudo de auto-renovação e diferenciação de nicho de células-tronco intestinal, embora sem abordar a contribuição dos seus componentes individuais, ou seja a Lgr5+ e Células de Paneth.
Aqui, descrevemos uma nova abordagem para o ensaio de organoides que aproveita a capacidade de Paneth e células de Lgr5+ para associar e formar organoids quando cultivadas co. Esta abordagem, aqui referida como "ensaio de reconstituição de organoides" (ORA), permite a modificação genética e bioquímica de Paneth ou Lgr5+ células-tronco, seguidas por reconstituição em organoids. Como tal, permite a análise funcional dos dois principais componentes do nicho de células-tronco intestinal.
Introduction
O epitélio intestinal é o tecido mais rapidamente auto renovadora no corpo dos mamíferos e, como tal, tem sido objeto de uma infinidade de estudos vista a identificação e caracterização funcional das células-tronco adultas que residem no fundo da cripta de Lieberkühn, afectada pela expressão do gene Lgr5 e dependente de sinais de Wnt canônico1. Nomeadamente, Lgr5+ células-tronco são flanqueadas e suportadas por células especializadas de nicho, ou seja, células de Paneth, que também dependem de sinalização de Wnt para sua maturação2. Juntos, esses tipos de duas células subjacentes a auto-renovação do revestimento epitelial intestinal e preservar o equilíbrio homeostático diário: Lgr5+ células-tronco rapidamente dividir e dar origem a progenitora e mais especializada intestinal epitelial células; Células de Paneth fornecem factores essenciais de nicho (por exemplo, Dll1, Wnt3, EGF) para Lgr5+ tronco células2. A capacidade das criptas intestinais quando chapeado ex vivo para formar estruturas organizadas e auto renovadora chamado organoids, ou "minicoragem", tem sido explorada como uma ferramenta experimental para fornecer informações sobre processos de auto-renovação e diferenciação em condições normais e patológicas, incluindo câncer4. Organoides culturas se estabeleceram de vários tecidos, incluindo o intestino, pâncreas, fígado e rim, de rato e humanos amostras4. O método de extração e os fatores de crescimento, empregados para desenvolver essas culturas organoides são tecido-específica e projetadas para dirigir a diferenciação da linhagem multi e imitar tão perto quanto possível do original nicho de células-tronco in vivo. Organoids pode ter aplicações potenciais, incluindo o tratamento de doenças genéticas, a avaliação da eficácia terapêutica em câncer, a análise de toxicidade da droga ou o estudo da organogênese em vitro5.
Em geral, a principal limitação das culturas organoides quando estabelecido a partir de amostras de tecido é uma falta de especificidade celular. Por exemplo, organoids intestinais estabelecidas de criptas toda intestinais não permitem a análise de componentes celulares individuais englobadas dentro da fonte de tecido (por exemplo, toda criptas contêm Lgr5+, Paneth, e células progenitoras).
Aqui, descrevemos um método novo, referido como ORA, que combina as vantagens das culturas de organoides intestinal com a análise funcional dos seus componentes mais fundamentais, ou seja, tronco (Lgr5+) e células de nicho (Paneth). Isto é conseguido através da capacidade única de Paneth e células de Lgr5+ para associar fisicamente uns com os outros quando co incubados e dar origem a organoids2,6,10. Nós aproveitou-se desse recurso e pre-tratados os tipos de duas células individualmente antes de permitir-lhes reconstituir o organoids. Ao fazer isso, cada componente da célula pode ser exposto a determinada droga, fator de crescimento, inibidor de bioquímica, modificação genética ou tratamento químico antes da reconstituição e formação de organoides. Portanto, usando o ensaio ORA permitirá a determinação de se um tratamento medicamentoso específico ou modificação genética tem um efeito específico sobre as células-tronco ou sua contraparte de nicho.
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Protocol
Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes e leis de bem-estar animal local.
1. preparação dos instrumentos, meios de cultura e pratos
- Conjunto de autoclave 1 de intestinal tesoura, tesoura normal e fórceps em recipiente estéril.
- Coloque um prato de 96 poços (fundo plano) em uma incubadora a 37 ° C.
- Prepare-se 10 mL de meio de cultura completo com os reagentes listados na tabela de materiais.
- Incube o meio completo a 37 ° C em banho-maria.
- Degelo reconstituído a membrana basal, colocando-o em um balde de gelo. A membrana basal reconstituída se tornará líquida a 4 ° C.
- Encha 4 placas de Petri com frio tampão fosfato-salino ou abreviado PBS (4 ° C).
2. isolamento de pequenas criptas intestinais
- Sacrifica-se por inalação de CO2 - eGFP-IRES-CreERt2 Lgr5mouse sobre um fundo C57BL6/J. Disse o peritônio longitudinalmente com uma tesoura.
- Segure o estômago com a pinça e cortar transversalmente no meio.
- Usando a tesoura intestinal de agora em diante, puxe para fora o intestino e colocá-lo em uma placa de Petri contendo PBS.
Nota: Tesoura Intestinal tem uma acentuada e uma ponta romba. Destina-se a ponta romba dessas tesouras para não danificar a arquitetura da cripta-vilosidades durante a abertura do intestino. - Comece colocando a ponta romba para o estômago e empurre suavemente através do piloro. Continue cortando com a tesoura e puxar com a pinça.
- Uma vez que o intestino delgado inteiro é aberto longitudinalmente, lavá-lo em PBS frio, segurando-o com a pinça e enxaguá-lo suavemente na solução de PBS com movimentos em forma de U.
- Uma vez que todos os restos de fezes são limpas, proceda a achatar o intestino em uma placa de corte, luminal para cima. O lado luminal é facilmente reconhecível pela ausência de vasos sanguíneos e por sua aparência pálida em comparação com a parte externa.
- Com uma lâmina de vidro, retire com cuidado as vilosidades raspando o intestino achatado. Execute esta etapa duas vezes ao longo de todo o comprimento do tecido.
- Corte o intestino com uma lâmina cirúrgica estéril em pedaços de 2 a 5 mm.
- Coloque os pequenos fragmentos intestinais em um tubo de 50 mL contendo 10 mL de PBS frio gelo.
- Limpe os fragmentos de tecido, removendo as impurezas restantes pipetando-los acima e para baixo na PBS. Descartar o sobrenadante e repita este passo até o PBS é completamente claro.
- Adicione 15 mL PBS frio, para trazer o volume total final de PBS para 25 mL. Adicionar 2 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e incube por 45 min em um rolo em 4 ° C.
- Descarte o PBS/EDTA.
- Adicionar 10 mL de PBS e separe as criptas pipetando duramente os fragmentos de tecido acima e para baixo (pelo menos três vezes). Recolha o sobrenadante.
- Repita a etapa 2.13 quatro vezes. Adicione o meio de cultura para alcançar um volume final de 50 mL.
- Granule as células por centrifugação (300 x g por 5 min).
- Resuspenda o pellet em 10 mL de meio de cultura e as criptas de pelotas por centrifugação (80 x g durante 3 minutos).
3. única célula preparação
- Descartar o sobrenadante de criptas peletizadas e Resuspenda-los em 1ml tripsina como-enzimas juntamente com 50 µ l DNAse (50 µ g/mL).
- Incube as células em um banho de água a 32 ° C por 2 min.
- Adicione 10 mL de meio de cultura. Dissocia as criptas em única células pipetando severamente acima e para baixo pelo menos 5 vezes.
- Filtrar a solução através de um filtro de 40 µm (para eliminar grumos e outras impurezas) e as células única a 300 x g por 5 min de Pelotas.
4. chapeamento e citometria de fluxo
- Prepare-se 50 mL de solução salina tamponada de 1 x Hank ou HBSS/2% solução de soro (FCS) de vaca fetal e resuspenda o pellet em 1 mL para cada 106 células
- Adicione à suspensão de células Lin BV421– (CD31, CD45, TER119) na concentração de 1: 100 e CD24-APC e CD117-PE os dois em uma concentração de 1: 250 anticorpos durante 30 min.
- Tipo Lgr5+ células-tronco e células de Paneth em baixa separada ligam os tubos. Para obter detalhes sobre a classificação de protocolos para Lgr5+ e células de Paneth, consulte Roth et al . 7 e. Schewe et al 6
- Centrifugar as células classificadas a 300 x g durante 5 min. Ressuspender as células em meio de 100 µ l com os componentes descritos como em 1.3 (consulte a Tabela de materiais).
- (Por exemplo, por modificação genética ou química) tratar as células de Paneth (n = 2000) ou as células-tronco Lgr5+ (n = 2000).
- Para tratar as células, usar 5 µ l de reagente de transfeccao lipossoma-mediada em um volume total de 100 µ l meio de cultura e RNA de interferência pequeno (siRNA) na concentração de 100 nM. Incube durante 30 min a 37 ° C para siRNA ou durante o tempo necessário para a modificação escolhida.
- Lave as células duas vezes em meio de cultura 500 µ l.
- Centrifugar a 300 x g por 5 min e ressuspender as células em meio de cultura 10 µ l.
- Os dois componentes celulares da piscina (Paneth ou Lgr5+ células) em um 20 µ l volume total e centrifugar 300 x g por 5 min à RT
- Co Incubar o Paneth e células de Lgr5+ por 10 min a RT
- Remover 10 µ l do sobrenadante e deixar um menisco do líquido para ter certeza de não aspirar o centrifugado.
- Adicionar 30 µ l de leite reconstituído da membrana basal das células para um volume total de 40 µ l, Ressuspender as células e a placa em uma placa bem 96 previamente aquecido. Depois de 10 min, adicionar 200 µ l de meio completo (veja a Tabela de materiais). Médio de mudança cada 48 h.
- Multiplicidade de organoides contagem no dia 5.
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Representative Results
O ensaio de reconstituição de organoides permite a análise funcional separada dos componentes essenciais da ameia e células-tronco do epitélio intestinal, aqui demonstrado pelo RNA de interferência pequeno (siRNA) do gene Apc .
Para atingir este objectivo, primeiro utilizamos o fluorescente ativado celular classificação (FACS) para separar puras camundongos C57BL6/J 8000 Lgr5+ de células e 6000 células de Paneth. Na Figura 1a, um fluxograma do ensaio ORA é retratado. Capacidade de reconstituição de organoides foi avaliada pela incubação de células Lgr5+ com siRNA oligonucleotides dirigidos contra o mRNA do Apc ou abrangendo uma sequência codificada (SCR) como um controle. Após o tratamento, as mesmas células de Lgr5+ siRNA-tratados foram ou diretamente banhadas em organoides médio/reconstituído da membrana basal, ou incubadas com igual número de células de Paneth não tratadas e posteriormente chapeadas para fora. Como um controle, não tratado Lgr5+ de células foram chapeadas sozinho (ou seja, sem células de Paneth) para determinar o número de organoids, derivado de células de Lgr5+ não tratadas. Além disso, como um controle adicional, células de Paneth sozinhos foram chapeadas para verificar se o plano de fundo da formação de organoides derivado da contaminação de parelhas de célula de Paneth-Lgr5 classificados no portão de células de Paneth. Como esperado, siRNA mediada por nocaute do gene Apc murino em células-tronco Lgr5+ (e a ativação resultante da via de sinalização Wnt/β-catenina canônica) positivamente afetados organoides multiplicidade quando comparado com contrapartes não tratadas ou mexido controle (figura 1B). A ativação constitutiva do Wnt também resgatou a exigência para as células de Paneth, como relatado anteriormente1. Além disso, estes organoids apareceu esferas tão ocas (esferoides), um fenótipo bem descrito para a Apc-mutante ou Wnt-estimulada organoids (Figura 1, painel 1), quando comparado com a morfologia do que aqueles obtidos de células de Paneth-Lgr5 parelhas (Figura 1 C, painel 2)8,9. Coletivamente, estes resultados demonstram que reconstituir células de Paneth e Lgr5+ células podem dar uma visão sobre mecanismos específicos de célula dentro destes tipos de duas células; análise morfológica da organoids pela microscopia pode ser valioso neste sentido desde a morfologia da organoids reflete sua composição celular (p. ex., esferoides são constituídos por Lgr5+ células apenas). Outro parâmetro importante a ser levado em conta é a complexidade dos organoides (por exemplo, o número de eventos de brotamento cripta).
Figura 1. Efeito de siRNA mediada por nocaute da Apc em Lgr5+ células. (A) fluxograma do procedimento experimental. Lgr5 De ratos (Lgr5creERT2-EGFP-IRES) repórter EGFP 1 foram utilizadas como uma fonte de Lgr5+ classificados de células-tronco. Células de Paneth foram classificadas como indicado e descrito anteriormente6,7. (B) multiplicidade de organoides observada após reconstituição de células-tronco Lgr5+ e células de Paneth. Quando as células indicadas foram pré-tratados com siRNA oligonucleotides dirigido contra o Apc (siRNA Apc) ou mexidos sequência de controle (SCR). Os asteriscos indicam diferenças estatisticamente significativas (n = 3, * p < 0,05 * * p < 0,001). Barras de erro referir-se a células SD. (1) Lgr5+ , (2) Lgr5+ células SCR, (3) Lgr5+ células siRNA Apc, (4) células de Lgr5+ + células de Paneth, (5) Lgr5+ células siRNA Apc + células de Paneth, células de Paneth (6). (C) imagens representativas de organoids derivado (1) Lgr5+ células siRNA Apc, células de Paneth - Lgr5+(2). Barra de escala = 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O ORA permite a análise funcional refinada dos dois componentes essenciais de nicho de células-tronco intestinal, ou seja, Lgr5+ e células de Paneth. Esta abordagem tem sido empregada anteriormente por nós e outros, com pequenas modificações,6,10,11. Aqui, apresentamos o procedimento ORA como um protocolo do laboratório reproduzíveis e padronizada. Além disso, relatamos sobre os efeitos da Apc downregulation em células-tronco Lgr5+ , como um exemplo da possibilidade de implementação de genética (ou bioquímicos6) modificações aos componentes celulares classificadas. Coletivamente, os dados mostram que siRNA mediada por nocaute da Apc melhora a função de células-tronco de células Lgr5+ , conforme indicado pela multiplicidade organoides aumentada (figura 1B).
Diversas vantagens do uso de culturas de organoides 3D intestinal já foram registradas em comentários4, incluindo a impressionante semelhança de sua organização com que a cripta-vilosidades arquitetura na vivo, especialmente quando comparado com o arquitetura de métodos de cultura padrão 2D com linhas celulares imortalizado. No entanto, uma das principais limitações desse método é que na maioria dos casos, organoides culturas são estabelecidas de criptas intestinais todo, um processo que não permite a análise funcional dos seus componentes individuais e, em particular, do tronco e nicho células, aqui representadas pelo Lgr5+ e células de Paneth, respectivamente.
O ORA supera estas limitações. Células estaminais e nicho podem ser classificadas de animal separadamente e reconstituídas para gerar organoids. Como tal, esta abordagem permite a análise funcional destes dois componentes celulares por qualquer empregando modelos de rato carregando as modificações genéticas específicas ou expostos a fatores de estresse específico (por exemplo, DSS e/ou dietas específicas); ou modificando diretamente as células classificadas geneticamente (siRNA, CRISPR-Cas9) ou bioquimicamente, antes reconstituting-los para gerar organoids. A multiplicidade, morfologia, capacidade de auto-renovação e grau de diferenciação (e eventualmente a extensão das mudanças metaplastic) do organoids resultante podem ser empregados como leituras funcionais. No caso de manipulação genética, tais como siRNA, quando um efeito morfológico não é evidente, as células devem ser analisadas uma hora depois de Transfeccao para validar o nocaute do mRNA do interesse. Paneth e Lgr5+ também podem ser classificados de camundongos geneticamente modificados com mutações diferentes para estudar se diferentes mutações em células estaminais e nicho originar alteradas interações entre estes tipos de duas células e um diferente organoides eficiência de formação e/ou morfologia.
Passos críticos dentro do protocolo são a remoção das vilosidades (passo 2.7) e a ressuspensão das células em HBSS/2%FCS (passo 4.1). Remoção das vilosidades é fundamental para enriquecer Paneth e Lgr5+ células localizadas no terço inferior das criptas e para melhorar a eficiência de classificação. Embora os protocolos FACS comumente sugerem classificação células em PBS/FCS, o uso de HBSS em vez de PBS aumentou e manteve a viabilidade celular estável ao longo do tempo de classificação. Outras medidas importantes são passos 4.7 e 4.8, onde física Associação de Paneth e Lgr5+ células permite que estas linhagens de parelhas de forma que eventualmente dará origem a organoids.
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Disclosures
Os autores têm nenhum interesse financeiro concorrente ou outros conflitos de interesses
Acknowledgments
Este estudo foi viabilizado pelo financiamento da sociedade holandesa de câncer (KWF; EMCR 2012-5473) e a World câncer pesquisa fundos International (WCRF; projeto n º 2014-1181)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM F12 * | Thermo Fisher Scientific | 12634-010 | |
| Glutamax * | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Final concentration: 10 mM |
| Penicillin/streptomycin * | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Final concentration: 1% |
| Hepes * | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Final concentration: 10 mM |
| Recombinant murine EGF * | Thermo Fisher Scientific | PMG8041 | Final concentration: 50 ng/ml |
| Recombinant murine Noggin * | Peprotech | 250-38 | Final concentration: 100 ng/ml |
| y27632 * | Sigma | Y0503 | Final concentration: 10 µM |
| Jagged-1 * | Anaspec Bio | AS-61298 | Final concentration: 1 µM |
| Recombinant murine R-spondin * | R&D systems | 3474-RS-050 | Final concentration: 1 mg/ml |
| Flexitube Gene solution siRNA APC | Qiagen | GS11789 | Final concentration: 100 nM |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| CD24 APC | Biolegend | 101814 | |
| c-kit PE | Biolegend | 105808 | |
| BV 421 CD31 | Biolegend | 102424 | |
| BV 421 CD45 | Biolegend | 103134 | |
| BV421 TER119 | Biolegend | 116234 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 14180046 | |
| B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J | Jackson Laboratories | 008875 | |
| Low binding tubes | Eppendorf | Z666548-250EA | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| * The combination of these reagents constitutes the complete culture medium |
References
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