Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Een alternatieve cultuur methode om Genomic Hypomethylation van muis embryonale stamcellen met MEK-remmer PD0325901 en vitamine C

Published: June 1, 2018 doi: 10.3791/56391
Automatic Translation
1, 1, 1
1State Key Laboratory of Environmental Chemistry and Ecotoxicology, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences

Summary

Wij beschreven twee chemische-gebaseerde protocollen voor het kweken van muis embryonale stamcellen in detail. Deze nieuwe methode maakt gebruik van synergetische mechanismen ter bevordering van Tet-gemedieerde oxidatie (door vitamine C) en onderdrukken van DOVO synthese van 5-methylcytosine (door PD0325901) om DNA hypomethylation en pluripotent van muis embryonale stamcellen te onderhouden.

Abstract

Embryonale stamcellen (ES) hebben het potentieel om te onderscheiden in een van de drie lagen van de kiem (endoderm, mesoderm of ectoderm), en vele geslachten voor regeneratieve geneeskunde kunnen genereren. ES cel cultuur in vitro lang het onderwerp geweest van wijdverbreide bezorgdheid. Klassiek, muis ES-cellen worden bijgehouden in serum en leukemie remmende factor (LIF)-met medium. Echter onder voorwaarden van de serum/LIF, cellen heterogeniteit in de morfologie en het profiel van de expressie van genen pluripotent-gerelateerde weergeven, en zijn meestal in een metastabiele staat. Bovendien, gekweekte ES-cellen vertonen wereldwijde hypermethylation, maar naïef ES-cellen van de binnenste cel massa (ICM) en primordial kiemcellen (PGCs) zijn in een staat van wereldwijde hypomethylation. De toestand van de hypomethylated van ICM en PGCs is nauw verbonden met hun pluripotent. Ter verbetering van muis ES cel cultuur methoden, hebben we onlangs een nieuwe methode gebaseerd op het selectief gecombineerd gebruik van twee kleine-molecuul verbindingen de DNA-hypomethylated en pluripotente toestand te handhaven ontwikkeld. Hier presenteren we dat de gezamenlijke behandeling van vitamine C (Vc) en PD0325901 kunt ongeveer 90% van de 5-methylcytosine (5mC) 5 dagen op muis ES cellen wissen. De inhoud van de gegenereerde 5mC is vergelijkbaar met die in PGCs. Het mechanistisch onderzoek blijkt dat PD0325901 up-regelt Prdm14 expressie om te onderdrukken Dnmt3b (DOVO DNA methyltransferase) en Dnmt3l (de cofactor van Dnmt3b), door vermindering van DOVO 5mC synthese. VC vergemakkelijkt de omzetting van 5mC 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) gekatalyseerde voornamelijk door Tet1 en Tet2, met vermelding van de betrokkenheid van zowel de actieve als de passieve DNA-demethylations. Bovendien Toon muis ES cellen onder Vc/PD0325901 voorwaarden, homogene morfologie en pluripotente staat. Gezamenlijk stellen wij een roman en chemische-synergy cultuur methode voor het bereiken van DNA-hypomethylation en het onderhoud van pluripotent in muis ES-cellen. De kleine-molecuul chemische-afhankelijke methode overwint de grote tekortkomingen van serum cultuur en houdt belofte voor het genereren van homogene ES-cellen voor verdere klinische toepassingen en onderzoeken.

Introduction

ES-cellen zijn afkomstig uit de ICM een blastocyst-1. De cellen kunnen in een Braziliaanse pluripotent zijn en alle somatische lineages en germline cellen2. Oprichting van ES-cellen biedt de mogelijkheid te onderzoeken van de ontwikkeling processen in vitro en cellen voor medische relevantie voor regeneratieve geneeskunde op basis van hun pluripotent3kan genereren.

Twee groepen seminally de muis ES-cellijnen opgericht in 1981 en wanneer cellen afgeleid van het vroege embryo muis werden gekweekt in de foetale runderserum (FBS)-met medium met muis embryonale fibroblasten (MEFs) als de feeder laag1,4 . MEFs mitotically waren geïnactiveerd en vooraf waren gegroeid in gerechten vóór het kweken van ES-cellen. MEFs ondersteuning voor muis ES cel bijlage en produceren van groeifactoren te bevorderen van voortplanting en onderdrukken de differentiatie5, terwijl FBS essentiële trofische factoren en hormonen voor celproliferatie biedt. Latere studies aangegeven dat LIF geproduceerd door feeder cellen de belangrijkste cytokine voor zelf-vernieuwing en onderhoud van pluripotent in muis ES-cellen was, en de toevoeging van LIF in het medium voor feeder cellen6 vervangen kon. Het uithoudingsvermogen van muis ES cellen in FBS/LIF medium op feeders is momenteel nog steeds de standaard methode die door veel onderzoekers aangenomen. Echter, sommige problemen met deze benadering van de klassieke cultuur. Ten eerste, feeder cellen afscheiden van overtollige en ongecontroleerde factoren en pathogene besmetting7kunnen veroorzaken. Om te voorkomen dat deze inmenging, coating het oppervlak van gerechten met gelatine en de toevoeging van LIF in serum-bevattende medium zijn alternatieve methoden voor het behoud van de muis ES cellen zonder feeder-laag cellen. Bovendien vertonen de muis ES cellen geteeld onder omstandigheden van de serum/LIF morfologische heterogeniteit in cel populaties, en zelfs in de mate van expressie van pluripotent-gerelateerde factoren8. Recente studies suggereren dat onder omstandigheden van de serum/LIF, de kern pluripotent-gerelateerde transcriptiefactoren (met inbegrip van SOX2, Nanog en OCT4) de pluripotent door middel van LIF en WNT signalering ondersteunen kunnen; echter, met name, zij ook activeren een fibroblast groeifactor (FGF) signaal om differentiatie8trigger. Als gevolg van de ambivalente dubbele actie van de kern transcriptiefactoren, muis ES cellen gekweekt in het serum aanwezig heterogeniteit, bestaande uit twee verwisselbare populaties, een soortgelijk aan ICM en een ander lijkt de op de voorbehandelde epiblast staat8. Bovendien, muis ES cellen in serum vertonen vaak global hypermethylation9, overwegende dat ICM en PGCs zijn in een staat van de wereldwijde hypomethylated, die nauw is met hun pluripotent9,10 verbonden.

Er is een aanzienlijke vraag naar het ontwikkelen van nieuwe methoden voor het kweken van muis ES-cellen. Diverse verbeterde protocollen zijn vastgesteld sinds 200311 maar er nog steeds enkele beperkingen en tekortkomingen7. Sinds 2008, het gecombineerde gebruik van twee kleine-molecuul kinase-remmers, PD0325901 (de Inhibitor van de omwenteling van de mitogeen-geactiveerd proteïne kinase (MAPK) / extracellulaire-signaal-gereglementeerde kinase (ERK) (MEK)) en CHIR99021 (de Inhibitor van de omwenteling van glycogeen synthase kinase 3 (GSK3)), in N2B27 medium met LIF en zonder serum voor kweken muis ES12 cellennieuwe perspectieven heeft geopend. Deze nieuwe beschreven medium wordt gekenmerkt door het gebruik van twee remmers (2i). Muis ES-cellen gekweekt in 2i/LIF medium zijn meer homogeen in cel populaties en de uitdrukking van pluripotent factoren. Daarnaast vertonen 2i/LIF-gekweekte muis ES-cellen DNA hypomethylation wereldwijd, die dichter bij ICM-achtige cellen9,13is. Zelfs zo, heeft 2i cultuur zijn nadelen. PD0325901 en CHIR99021 zijn onoplosbaar in water en in het algemeen worden opgelost in dimethylsulfoxide (DMSO)-op basis van de stamoplossing te voegen in een kweekvloeistof. Studies hebben aangetoond dat langdurig en lage dosis blootstelling van cellen aan DMSO kan leiden tot cytotoxiciteit14.

Hier, we twee kleine-molecuul verbindingen gebruikt en ontwikkelde een nieuwe methode van de cultuur van muis ES-cellen. De nieuwe cultuur methode combineert Vc en MEK-remmer PD0325901 ter bevordering van DNA hypomethylation snel en doeltreffend tot een vergelijkbaar niveau van PGC, genoemd als het protocol voor het kweken van Vc/PD0325901. Muis ES cellen in serum-bevattende medium Vc/PD0325901-toegevoegde vertonen homogeniteit in de morfologie en zijn opgelopen in een grondtoestand. Vergeleken met 2i cultuur, muis ES cellen gekweekt onder Vc/PD0325901 voorwaarden vertonen sneller kinetiek van DNA-demethylatie en het hypomethylation niveau vergelijkbaar met die van PGC kunnen bereiken. Bovendien, het gebruik van een enkele inhibitor (PD0325901) vermindert de input DMSO tot medium in vergelijking met die gebruikt in 2i (PD0325901/CHIR99021) en vermindert de schade aan cellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. voorbereiding

  1. Bereiden van een oplossing van 1,0 mM PD0325901 (MEK-remmer) en 3.0 mM CHIR99021 (GSK3-remmer).
    1. Weeg 2 mg PD0325901 en voeg 4.15 mL van DMSO in een flesje amberkleurig glas.
    2. Weeg 2 mg CHIR99021 en voeg 1.43 mL van DMSO in een flesje amberkleurig glas.
    3. Volgende reconstitutie, (50 µL/buis in 200 µL PCR buizen) aliquots bij-20 ° C worden opgeslagen en beschermd tegen licht. Verwijder een buis met de bevroren voorraad van een vriezer en ontdooien bij kamertemperatuur vóór gebruik.
  2. Weeg 0.0176 g van Vc in 1 mL van een centrifugebuis en reconstrueren het met 1 mL steriel water met een eindconcentratie van 100 mM vóór gebruik.
  3. Inactivering van FBS: Incubeer FBS 500 mL in een waterbad bij 56 ° C gedurende 30 min.
  4. 600 mL voedingsbodem voor te bereiden voor het kweken van muis ES-cellen.
    1. Gebruik van een fles van DMEM/hoge glucose medium (500 mL) en verwijderen van 40 mL.
    2. Supplement 460 mL van DMEM/hoge glucose medium met 20% geïnactiveerd FBS (120 mL), 1000 U/mL LIF (60 µL van 107 U/mL stockoplossing), 0.1 mM niet-essentiële aminozuren (NEAA) (6 mL van de stockoplossing 10 mM), 1 mM natrium pyruvaat (6 mL van de stockoplossing 100 mM) , 2 mM L-glutamine (6 mL van de stockoplossing van 200 mM), 0.1 mM β-mercaptoethanol (600 µL van 100 mM stockoplossing), en 33 IU/mL penicilline en 33 µg/mL streptomycine (2 mL penicilline-streptomycine gemengd oplossing (10.000 IE/mL penicilline en 10.000 µg Mo/mL streptomycine)) . Definieer de voedingsbodem als serum medium.
    3. Pipeteer 50 µL van de stockoplossing van PD0325901 (1,0 mM) en Vc (100 mM), respectievelijk, in 50 mL van het serum medium (eindconcentratie: 1.0 µM PD0325901 en 100 µM Vc), en definiëren van de middellange als Vc/PD0325901 medium.
      Opmerking: Bereiden de Vc/PD0325901 middellange fresh vóór gebruik als gevolg van de instabiliteit van Vc.
    4. Met behulp van een precisiepipet, breng 50 µL van de stockoplossing van PD0325901 (1,0 mM) en CHIR99021 (3,0 mM), respectievelijk, in 50 mL van het serum medium (eindconcentratie: PD0325901 1.0 µM en CHIR99021 3.0 µM), en definiëren van de middellange als 2i medium.
  5. De gelatine beklede gerechten te bereiden.
    1. Bereid de 0,1% gelatine-oplossing: los van 0,3 g gelatine in 300 mL ultrazuiver water in een glazen reagens fles met een dop en steriliseren in een autoclaaf bij 121 ° C gedurende 20 min. winkel de steriele oplossing bij kamertemperatuur.
    2. Incubeer de cel cultuur gerechten (6 cm diameter) met 2 mL 0,1% gelatine oplossing gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en vervolgens gecombineerd de gelatine. De gerechten in de lucht droog en ze gebruiken binnen 12 uur.
  6. Bereiden van 10 mL van muis ES cel bevriezing medium in een centrifugebuis 15 mL: 90% FBS (9 mL) en 10% DMSO (1 mL). Gebruik het medium binnen 1 dag.
  7. Bereiden van een bevriezing container: 100% isopropylalcohol aan de vullijn van de bevriezing container toevoegen en verwijderen van de oude isopropyl-alcohol. Voeg nieuwe isopropyl alcohol direct na elke vijf keer gebruiken.
  8. Maken van de enzymatische spijsvertering-buffer: Weeg 1.2114 g van Tris poeder in 100 mL ultrazuiver water toevoegen te bereiden 100 mM Tris oplossing geconcentreerd zoutzuur (ongeveer 12 M) in de oplossing van Tris op pH 7,6 (ongeveer 0,6 mL geconcentreerd zoutzuur).
  9. 50 mL radio immunoprecipitation assay buffer (buffer RIPA) bereiden: 20 mM Tris, pH 7.4, 1 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 20% glycerol, 0,5% NP40, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA. Te vullen met 1 mM DTT, 1 X proteaseinhibitor cocktail, en 1 mM PMSF vóór gebruik. Zodra de PMSF is toegevoegd, gebruikt u de buffer binnen 30 min.

2. groeien muis ES-cellen op gelatine beklede gerechten

  1. Vooraf warm muis ES-cellen (wild type, 129 SvEv) cultuur medium, trypsine en fosfaatgebufferde oplossing (PBS) in een waterbad bij 37 ° C.
  2. Passage van de cellen. Gecombineerd het medium volledig uit de schotel en Pipetteer 2 mL PBS aan de gerechten te spoelen van de cellen.
    1. Verwijder de PBS met een pipet en wassen van de cellen opnieuw met 2 mL PBS.
    2. Verwijder de PBS en Voeg 0.3 mL trypsine-EDTA (0,25%) toe aan elk gerecht.
    3. Betrekking hebben op de hele schotel met de trypsine snel en dan onmiddellijk verwijderen.
    4. Zet de schotel in een incubator bij 37 ° C gedurende 1 minuut om de cellen van de Schotel los te maken. Neem de gerechten uit de incubator en voeg toe 2 mL voorverwarmde serum middellange tot het beëindigen van de actie van trypsine.
    5. Distantiëren van de kolonies van de cel in een enkele celsuspensie door resuspending met een pipet (5 mL pipet tip) 10 keer.
  3. Breng 150 µL van 2 mL van de oplossing van de cel (ongeveer 190.000 cellen door te tellen met een hemocytometer) in een nieuwe gelatine beklede schotel, en aan te vullen met 3 mL van versgemaakte Vc/PD0325901 medium per 6 cm cultuur schotel. Cultuur van de cellen in een incubator 37 ° C met 5% CO2.
  4. Elke 24 uur tijdens het broeden, verwijder het oude kweekmedium en voeg 3 mL verse Vc/PD0325901-medium in de schotel van de cultuur als gevolg van de instabiliteit van Vc. Expect 70-80% confluentie na 2-3 dagen.
  5. Na het bereiken van 70-80% confluentie, passage van de cellen en blijven ze zoals beschreven in stappen 2.2-2.4 cultuur.

3. bevriezen en ontdooien muis ES-cellen

  1. Bevriezen muis ES-cellen.
    1. De cellen van de schotels met trypsine loskoppelen door stap 2.2.
    2. Breng de cellen in een plastic tube van 15 mL en centrifuge bij 800 x g en kamertemperatuur gedurende 3 minuten.
    3. Dump de bovendrijvende vloeistof zachtjes in een bekerglas en resuspendeer de pellet cel met 1 mL vers gemaakte bevriezing medium. Bereiden de bevriezing middellange 30 min vóór deze stap om ervoor te zorgen dat er kamertemperatuur vóór gebruik.
    4. Overdracht van de cellen in de bevriezing van de middellange-tot een 1.8 mL microcentrifuge buis met een 1 mL pipet en plaats de microcentrifuge buis in een bevriezing container. Isopropyl alcohol toevoegen aan de vullijn van de bevriezing container en bewaar deze bij kamertemperatuur alvorens het te gebruiken.
    5. Laat de bevriezing containers's nachts in een vriezer-80 ° C.
    6. De microcentrifuge-buizen overbrengen in een container van vloeibare stikstof tot 2 – 3 jaar.
      Opmerking: Doe niet houden cellen in het ijskoude medium voor een lange tijd en de cellen snel overbrengen in een vriezer-80 ° C als gevolg van de toxiciteit van DMSO.
  2. Ontdooi muis ES-cellen.
    1. Vooraf warm 50 mL serum voedingsbodem in een waterbad 37 ° C.
    2. Neem een cel-bevattende flesje uit de vloeibare stikstof-container en dompel de afgetopte ampul in een waterbad 37 ° C. Schud het snel in het waterbad te ontdooien. Breng de cellen in een tube van 15 mL met een pipet 1 mL. Voeg 2 mL voorverwarmde serum kweekmedium in de buis te verdunnen het bevriezing medium en vervolgens Centrifugeer bij 800 x g en kamertemperatuur gedurende 3 minuten.
    3. Verwijder het supernatant en resuspendeer zachtjes de cel pellets met verse Vc/PD0325901 medium gebruik van een 5 mL-pipet 3 mL.
    4. De cellen van de tube van 15 mL overbrengen in een gelatine beklede schotel en cultuur van de cellen voor 24 h. cultuur de cellen opnieuw zoals beschreven in stap 2.

4. uittreksel totaal eiwit uit cellen

  1. Spoel de verzamelde cellen met 1 mL PBS en vervolgens Centrifugeer bij 800 x g en kamertemperatuur gedurende 3 minuten.
  2. Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de pellet cel grondig met RIPA buffer pipetteren zachtjes met DTT, proteaseinhibitor cocktail en PMSF aangevuld. Het volume van de buffer RIPA is ongeveer 5 x die van de cel pellet.
    Opmerking: Uit de cel resuspensie op ijs te voeren.
  3. Houd de cellen in de buffer RIPA gedurende 30 minuten op ijs en centrifugeer bij 13.000 x g en 4 ° C gedurende 5 min.
  4. Het supernatant overbrengen in een nieuwe buis en slaan aliquots bij-80 ° C.
  5. Bepaal de concentratie van het eiwit met de een Bradford eiwit assay kit.

5. het uittreksel van DNA uit cellen en Digest DNA in een enkele Nucleoside met behulp van enzymen

  1. De cellen met trypsine verzamelen zoals beschreven in stappen 3.1.1 en 3.1.2.
  2. De DNA-extractie uit te voeren met een genomic DNA zuivering kit na instructies van de fabrikant.
  3. Bewaar de geëxtraheerde DNA in 1 mL centrifuge buizen. Voeg 100 µL ultrazuiver water in de centrifugebuis, en los van het DNA door pipetteren ongeveer 15 keer. Bepaal de concentratie en het evalueren van de kwaliteit van DNA door het meten van de absorptie bij 260 nm en 280 nm15. De DNA-concentratie is ongeveer 500 ng/µL.
  4. Digest 5 µg van DNA in een 50 µL oplossing systeem: Voeg 5 µL van 100 mM Tris-HCl-oplossing, pH 7,6 (eindconcentratie: 10 mM), 2 U kalf intestinale fosfatase, 1 U DNase I, 0.005 U snake venom fosfodiësterase ik, en 5 µg van DNA (het berekenen van de toegevoegde volume volgens de measu rode DNA-concentratie, ~ 10 µL) in een centrifugebuis en verhoging van het volume van de oplossing voor 50 µL met ultrazuiver water. Incubeer het mengsel bij 37 ° C's nachts. Centrifugeer de verteerd DNA-oplossing bij 1000 g en kamertemperatuur voor 1 min voor het verzamelen van de oplossing naar de onderkant van de buizen.
  5. Breng de verteerd DNA-oplossing van de centrifuge buizen in ultra-filtratie buizen (een molecuul gewicht cutoff: 3 kDa) en centrifuge bij 13.000 g- en 4 ° C gedurende 30 minuten om de spijsvertering enzymen.
  6. Bereid de monsters voor de analyse van 5mC en 5hmC.
    1. P.a. 5hmC: Pipetteer 36 µL van filter oplossing voor een nieuwe centrifuge buis (1 mL) en voeg 4 µL van 5'-(hydroxymethyl-d3),-2'-deoxycytidine ([D3]-5hmC) met de uiteindelijke concentratie van 3 nM.
    2. P.a. 5mC: 196 µL van ultrazuiver water in een nieuwe centrifugebuis en Pipetteer 4 µL van filter oplossing toevoegen aan de buis (50-fold verdunning), als gevolg van de hoge dichtheid van 5mC in genomic DNA. Breng 36 µL van de verdunde oplossing tot een nieuwe centrifugebuis en voeg 4 µL van (5'-(methyl-d3),-2'-deoxycytidine ([D3]-5mC) met de eindconcentratie van 50 nM. Gebruik [D3]-5hmC en [D3]-5mC als de interne standaard te kalibreren van 5hmC en 5mC, respectievelijk.
  7. Overdracht van de monsteroplossing meten buizen en bewaren bij 4 ° C. 5mC en 5hmC met ultra-high-performance liquid chromatography-triple vierpolige massaspectrometrie met meerdere-reactie monitoring (UHPLC-MS/MS (MRM)) zoals beschreven in een vorige verslag15analyseren.

6. het analyseren van 5mC en 5hmC met behulp van UHPLC-MS/MS15

  1. Verschillende parameters voor het analyseren van 5mC en 5hmC instellen met behulp van de UHPLC-MS software.
    1. Het stellen van een nieuwe methode. Open de software en klik op "bestand | Nieuw | Methode". Vertonen het berichtvak van "Method Editor" met de inhoud "Wilt u de wijzigingen voor de huidige methode wilt opslaan" en klik op "Nee".
    2. Het bouwen van de parameters van de sampler. Klik op "Sampler | Setup | Injectie". Selecteer "Standaard injectie" en "5 µL op geïnjecteerde volume" input.
    3. De parameters van de pomp in UHPLC bouwen.
      1. Klik op "BinPump2 | Setup"om te bouwen van de parameters van de pomp. Instellen "Flow" op "0,25 mL/min" en "Stop time" op "15 min".
      2. Instellen "Oplosmiddel B op 5%" en "Limieten druk" op "Max 600 bar".
      3. Klik op "BinPump2 | Tijdschema"te bouwen de isocratic elutie parameters voor 5mC analyse. Klik op "Toevoegen" als een rij wilt toevoegen. Ingang "0.00" op "Tijd" en "5.0" op "B %". Klik op "Toevoegen" eens te meer om een nieuwe rij toevoegen. Ingang "15.00" op "Tijd" en "5.0" op "B %".
      4. Klik op "BinPump2 | Tijdschema"om te bouwen van de kleurovergang elutie parameters voor 5hmC analyse. Klik op "toevoegen als een rij wilt toevoegen. Ingang 0,00 op tijd en 5.0 op "B %". Klik op "Toevoegen" eens te meer om een nieuwe rij toevoegen. Ingang "3.00" op "Tijd" en "5.0" op "B %". Klik op "Toevoegen" voor een andere 6 keer 6 rijen worden toegevoegd. Ingang "3.01" op "Tijd" en "15,0" op "B %", "6,00" op "Tijd" en "15,0" op "B %", "6.01" op "Tijd" en "100" op "B %", "10.00" op "Tijd" en "100.0" op "B %", "10.01" op "Tijd" en "5.0" op "B %", "15.00" op "Tijd" en "5.0" op "B %" in volgorde.
        Opmerking: De analyse van 5mC en 5hmC individueel als gevolg van de scheiding van de verschillende gebruiksvoorwaarden UHPLC uitvoeren
    4. De parameters van de temperatuur van het compartiment (TCC) van de kolom in de UHPLC bouwen.
      Klik op "TCC | Setup | temperatuur (links) "en"30 ° C"input.
    5. Stellen de parameters van de QQQ-MS/MS.
      1. Klik op "MS QQQ | Stop de tijd | Geen limiet/als pomp"," Ion bron | ESI"," tijd filteren | Piekbreedte: 0.07 min ". Instellen "tijd van segmenten: Begintijd: 0"; "Scantype: MRM"; "Div waarde: MS"; "Delta EMV (+): 200" en "Delta EMV (-): 0".
      2. Bouwen van de parameters van de controle van de overgangen van 5mC, D3-5mC, dC, 5hmC en D3-5hmC
        1. Klik op "MS QQQ | Overname | Scannen segmenten: wonen: 90"; "Fragmentor: 90"; "Botsing energie: 5"; "Cel Accelerator Voltage: 4" en "polariteit: positieve".
        2. Ingang "5mC" op "Samengestelde naam", "242" atie"voorloper", "126" bij "Product Ion" voor 5mC analyse. Klik op de rechter knop en selecteer "Rij toevoegen" om een nieuwe rij toevoegen. Input "D3-5mC" op "Samengestelde naam", "245" atie"voorloper", "129" bij "Product Ion" voor D3-5mC-analyse.
        3. Aanvulling andere drie rijen met dezelfde modus. Ingang "dC" op "Samengestelde naam", "228" atie"voorloper", "112" bij "Product Ion" voor dC analyse. Ingang "5hmC" op "Samengestelde naam", "258" atie"voorloper", "142" bij "Product Ion" voor 5hmC analyse. Ingang D3-5hmC op samengestelde naam, "261" atie"voorloper", "145" bij "Product Ion" voor D3-5hmC-analyse.
      3. De parameters van de gas-bron te bouwen. Klik op "MS QQQ | Bron | Source parameters: Gas Temp: 300 ° C "; "Gas Flow: 11 L/min"; "Vernevelaar: 15 psi"; "Positieve-capillair: 3500 V".
      4. Sla de voorgestelde methode. Klik op "MS QQQ | Instrument | De methode Save". Selecteer een traject voor de voorgestelde methode van "Map" en geef een naam voor de methode door het invoeren van de inhoud van "Methode", bijvoorbeeld: 5mC en 5hmC analyse.
  2. UHPLC scheiding en MS/MS analyse van mononucleosides
    1. Bereiden de mobiele fase voor 5mC en cytosine (C) analyse: vormen de mobiele fase van oplossing A en B. oplossing A: 500 mL ultrazuiver water met 500 µL van mierenzuur (uiteindelijke concentratie: 0.1%), en oplossing B: 500 mL voor 100% methanol. Meng de oplossing A en B bij 95:5 (v: v) als de mobiele fase te elueren 5mC en C (ingesteld in stap 6.1.3.3). Het debiet vastgesteldop 0,25 mL/min (ingesteld in stap 6.1.3.1).
    2. De mobiele fase door oplosmiddel A en B voor 5hmC analyse voor te bereiden. Oplosmiddel A is 2.0 mM NH4HCO3 waterige oplossing (pH 9.0) (500 mL), en oplosmiddel B is 100% methanol (500 mL). Aparte 5hmC door een geoptimaliseerde kleurovergang elutie: 0-3 min, 5,0% B en 95% per (v: v); 3-6 min, 15,0% B en 85% A; 6-10 min, 100% B; 10-15 min, 5,0% B en 95% A (ingesteld in stap 6.1.3.4). Het debiet vastgesteldop 0,25 mL/min (ingesteld in stap 6.1.3.1).
  3. Electrospray MS/MS gebruiken met MRM modus (ingesteld in stap 6.1.5.1) te analyseren van de elutie van de kolom en het aannemen van het positieve ion-modus (ingesteld in stap 6.1.5.2.1).
    1. Controleren van de overgangen: 5mC, m/z 242→126 (botsing energie, 5 eV); [D3]-5mC, m/z 245→129 (5 eV); dC, m/z 228→112 (5 eV); 5hmC, m/z 258→142 (5 eV); [D3]-5hmC, m/z 261→145 (5 eV) (te zetten in stap 6.1.5.2.2).
    2. De capillaire en fragment spanningen vastgesteldop +3,500 V (ingesteld in stap 6.1.5.3) en 90 V (ingesteld in stap 6.1.5.2.1), respectievelijk.
    3. Het geïnjecteerde volume vastgesteldop 5 µL en analyseren van elk monster 3 keer (ingesteld in stap 6.1.2). Dienst van de bijbehorende standaard curven te evalueren van de hoeveelheid 5mC en 5hmC.
      1. De standaard curve van 5mC: 1 – 50 nM transfer (1, 5, 10, 20, 50 nM, eindconcentratie) standaardoplossing van de 5mC in centrifuge buizen en voeg 50 nM [D3]-5mC buizen. Aanvulling het totale volume aan 50 µL. uitvoeren van de analyse van de standaard 5mC de instructies volgen voor het 5mC monster (stap 6).
      2. Bouwen van de standaard curve van 5hmC: 1 – 20 nM overdragen (1, 2, 5, 10, 20 nM, eindconcentratie) standaardoplossing van de 5hmC te centrifugeren van buizen en voeg 3 nM [D3]-5hmC de buizen. Aanvulling het totale volume aan 50 µL. uitvoeren van de analyse van de standaard 5hmC de instructies volgen voor het 5hmC monster (stap 6).

7. het analyseren van de statistische significantie

  1. De statistische analyses met behulp van software uit te voeren.
    1. Open de software en selecteer "Kolom" in "nieuwe tabel & grafiek". Stel de parameters als volgt: "proef van gegevens | Begin met een lege tabel"; "Kies een grafiek-de eerste modus"; "Graphing wordt gerepliceerd of foutbalken | Plot | Bedoel met SEM".
    2. Klik op "Create" input van de drie replicaat-organismen van de groep van de controle- en Vc/PD0325901-behandeld in de "A" en "B"-lijn, respectievelijk. De zes gegevens selecteren en klik op "Analyseren" in de "analyse".
    3. Selecteer "t tests (non-parametrische tests)" in "Kolom Analyses" en klik op "OK" om de volgende interface.
    4. Stel de parameters als volgt: "Kies test | De naam van de test | Ongepaarde t -test; Opties | Tweezijdige"; "Betrouwbaarheidsintervallen: 95%"; "Significante cijfers | Toon 4 significante cijfers". Klik op "OK" om het verwerven van de p -waarde tussen de controle- en Vc/PD0325901 behandeling.
  2. Evalueren van de statistische significantie tussen het besturingselement en de experimentele groepen met tweezijdige en ongepaarde van de Student t-test van16.
    Opmerking: p < 0.05 duidt het bezitten van statistisch significant verschil. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

VC/PD0325901 geïnduceerde synergetisch global wissing van muis ES-cellen. Muis ES cellen in serum vertonen DNA hypermethylation, terwijl pluripotente ICM cellen en PGCs Toon globale verwijdering van methylation van DNA en de hypomethylated staat nauw verbonden met hun pluripotent9,10 is.

Eerder, wij en anderen gevonden dat Vc Tet-gemedieerde 5mC demethylatie15,17kan versterken. Ondertussen, 2i bleek ook voor de remming van DOVO synthese van 5mC. In het kader van deze bevindingen voorgesteld wij verder de synergetische manipulatie van muis ES cellen Vc en 2i samen gebruiken. Na de analyse van UHPLC-MS/MS vonden we dat Vc en 2i aangevuld in het serum-bevattende medium drastisch de 5mC inhoud van 3,2 tot 0,33 per 100 C (~ 90% 5mC verlies) per dag 11 in muis ES-cellen (figuur 1A verminderen kunnen). In tegenstelling, veroorzaakt Vc of 2i-behandeling alleen alleen 58% wissen met de gestage niveau op 1,4% 5mC of 61% vermindering op het niveau van 1,3% 5mC.

Het medium 2i is samengesteld uit MEK-remmer PD0325901 en GSK3β-remmer CHIR99021. Vervolgens onderzoeken we welk onderdeel het mondiale verlies van 5mC tijdens de gezamenlijke behandeling van Vc en 2i induceert. Interessant, veroorzaakte Vc/PD0325901 een snellere daling in niveaus van methylation van DNA dan Vc/2i. VC/PD0325901 bereikt gestage 5mC niveaus (~0.33% 5mC) na 5 dagen, terwijl Vc/2i een vergelijkbaar niveau op dag 11 bereikte. In tegenstelling, onderdrukt het supplement van de CHIR99021 deels Vc-geactiveerd DNA demethylatie (figuur 1A). Deze gegevens blijkt duidelijk dat PD0325901 in 2i tot de wereldwijde hypomethylation van genomic DNA in cellen van de muis ES, bijdraagt terwijl CHIR99021 van 2i gedeeltelijk de uitwissing van 5mC remt. Dus speculeren we dat de snellere DNA-demethylatie geïnduceerd door Vc/PD0325901 ten opzichte van Vc/2i kan worden toegeschreven aan de gedeeltelijke remming van de CHIR99021 op demethylatie.

We veronderstelde dat de globale wissing van 5mC in muis ES cellen geïnduceerd door Vc/PD0325901 mogelijk gedeeltelijk relevant zijn voor de versterking van DNA-demethylatie. Vandaar, onderzochten we genomic oxidatie producten van 5mC. Er werd gemeld dat 5mC kan worden omgezet in 5hmC door de katalytische oxidatie van Tet familie dioxygenases, die afhankelijk van Fe (II) en 2-oxoglutarate18,19 zijn. Genomische 5hmC kan worden verdund door DNA replicatie20. Bovendien 5hmC verder kan worden geoxideerd door Tet dioxygenases tot 5-formylcytosine (5fC) en 5-carboxylcytosine (5caC), die worden efficiënt door thymine DNA glycosylase (TDG weggesneden kan) te herstellen unmethylated cytosine, waarin een actieve DNA demethylatie21,22.

In overeenstemming met eerdere werk15, Vc-bevattende behandeling (Vc Vc/2i, Vc/PD0325901, Vc/CHIR99021) dramatisch toegenomen 5hmC frequentie (5hmC/106 C) na 1 dag, en daarna 5hmC niveaus daalde geleidelijk (figuur 1B) wegens de geleidelijke afname van de 5mC substraat. Met name toonde Vc/PD0325901 en Vc/2i sneller kinetiek van 5hmC verlies in vergelijking met Vc en Vc/CHIR99021 als gevolg van de snellere vermindering van 5mC. Daarnaast zien we ook dat op dag 1, Vc-behandeling gestimuleerd meer generatie van 5hmC in vergelijking met Vc/CHIR99021, die aangeeft dat de CHIR99021 gedeeltelijk de productie van Vc-geïnduceerde van 5hmC onderdrukt en DNA demethylatie geremd. 5hmC verlies in 2i behandeling moet worden toegeschreven aan de daling van het substraat 5mC. Samen genomen, deze resultaten toonden aan dat DNA Vc-enhanced demethylatie activiteit mede bijgedragen aan het synergetisch hypomethylation bij co behandeling van Vc/PD0325901 en Vc/2i.

Beide Habibi et al. 23 en von Meyenn et al. 24 ook gemeld dat muis ES-cellen onder 2i voorwaarden global DNA hypomethylation en naïef pluripotent toonde. 5mC niveaus toonde geleidelijk afnemen en bereikte een steady-state (~ 1% 5mC) 12-14 dagen na de terugkeer van serum naar 2i. In het systeem van Vc/PD0325901 cultuur, de co behandeling veroorzaakt snellere DNA-demethylatie en een stabiel niveau (0,33% 5mC) na suppletie van Vc/PD0325901 in serum medium voor 5 dagen, als gevolg van het synergetische effect van Vc/PD0325901 bereikt. De bereikte methylated level (0,33% 5mC) was duidelijk lager dan die voorwaarden 2i gerapporteerd door Habibi et al. en von Meyenn et al., terwijl 5hmC niveaus hoger als gevolg van het gepromoveerde generatie van Vc waren.

PD0325901 verheven Prdm14 expressie om te onderdrukken van Dnmt3b en Dnmt3l, maar niet Dnmt3a25. Om te onderzoeken het optreden van PD0325901 in 5mC verlies inducerende, een reeks van 5mC-gerelateerde eiwituitdrukking werd onderzocht, met inbegrip van het onderhoud (Dnmt1) en DOVO (Dnmt3a en Dnmt3b) DNA methyltransferases en hun cofactor (Uhrf1 en Dnmt3l) en verordening eiwit (Prdm14) 8,9,26. Na westelijke vlekkenanalyse, werd de Prdm14 duidelijk verheven in PD0325901-met inbegrip van cultuur (Figuur 2). In tegenstelling, toonde Dnmt3b en haar cofactor Dnmt3l grote down-regulatie van eiwit expressie in PD0325901-met inbegrip van behandeling (Figuur 2). CHIR99021 behandeling bleek geen of lichte effect op het niveau van Prdm14, Dnmt3b en Dnmt3l. De expressie van Dnmt3awas niet veranderen en de oorzaak is onduidelijk. Bovendien, het onderhoud DNA methyltransferase Dnmt1 en zijn gericht op factor Uhrf1 bleek ook geen wijziging en de gegevens niet werden getoond.

Recente studies hebben aangegeven dat de Prdm14 kunnen aanwerven polycomb repressieve complexe 2 (PRC2) aan de initiatiefnemers van sommige genen te onderdrukken hun expressie, zoals DOVO DNA methyltransferases (Dnmt3a en Dnmt3b) en hun cofactor (Dnmt3l), en tot bijdraagt hypomethylation onder 2i voorwaarden8,27te handhaven. Onze gegevens bleek dat de PD0325901 verhoogd het niveau van de expressie van de Prdm14 voor de remming van Dnmt3b en Dnmt3l en DOVO genomische 5mC synthese verminderd met het mechanisme.

Om te verkennen de pluripotent onderhoud van muis ES cellen onder Vc/PD0325901 voorwaarden, mRNA niveaus van de expressie van verschillende core pluripotent alternerende factoren werden onderzocht, en deze factoren hebben bevestigd om te spelen een vitale rol in pluripotent28. Real-time PCR analyse gevonden dat Oct4, SOX2, Esrrb en Sall4 toonde een uniforme expressie niveaus door 5 dagen van behandeling met Vc/PD0325901 in tegenstelling tot serum cultuur (figuur 3A). Nanog en Tcf3 meer 1.3-fold en 1.6-fold, respectievelijk. Daarentegen, Klf4 toonde 42% omlaag-verordening en Rex1 slechts daalde met ongeveer 12%. Deze resultaten suggereren dat Vc/PD0325901 co behandeling diverse wijzigingen in expressie pluripotent factoren geïnduceerde; maar, Oct4 en SOX2, de meeste kern factoren, bleef vrijwel constant niveau van meningsuiting.

Vervolgens werd een alkalisch fosfatase (AP)-test uitgevoerd om te beoordelen of muis ES-cellen in een ongedifferentieerde of gedifferentieerde staat werden. Foto's van cellen (figuur 3B en 3 C) werden verkregen uit een camera die is aangesloten op een omgekeerde Microscoop met 10-fold versterking van een objectief. Na continu teelt van 26 dagen in Vc/PD0325901-toegevoegde serum medium toonde de muis ES-cellen homogene morfologie. Bovendien, bijna alle cellen werden paars-zwart gebeitst en een bal-achtige status zonder uitgroei (Figuur 3 c), een ongedifferentieerde staat tentoongesteld. Daarentegen onder serum voorwaarden, een deel van de muis ES-cellen ten dage 26 waren paars-zwart na kleuring en had een bal-achtige toestand in morfologie, terwijl anderen gepresenteerd lichte kleur met outspreading gekenmerkt door witte ovale stippellijnen (figuur 3B); Hieruit bleek dat de serum-gekweekte muis ES-cellen waren heterogene in morfologie en in een pluripotente staat, die in overeenstemming met de vorige verslagen13 is. Collectief, ondersteund de gegevens dat PD0325901 in combinatie met Vc uitstekende morfologie en een ongedifferentieerde staat in de muis ES-cellen aankunnen.

Figure 1
Figuur 1: Vc/PD0325901 geïnduceerde synergetisch global wissing van genomische 5mCin muis ES cellen. (A) 5mC frequentie (5mC/C) en (B) 5hmC frequentie (5hmC/C) tijd-afhankelijke wijzigen tijdens een 26-daagse behandeling van een continue aanvulling met Vc, 2i, Vc/2i, Vc/PD0325901 of Vc/CHIR99021 in het serum-bevattende medium. Foutbalk toont de standaarddeviatie (SD) van drie herhaalde analyses door UHPLC-MS/MS. C: cytosine. Dit cijfer is gewijzigd van Li et al. 25. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: De eiwit expressie wijziging van Prdm14 en DNA-methyltransferases (Dnmt3a, Dnmt3b en Dnmt3l). De gepresenteerde bands (van links naar rechts) werden verkregen door middel van een 5 daagse-behandeling van de cultuur van het serum (controle), Vc, PD0325901, CHIR99021, 2i, Vc/PD0325901, Vc/CHIR99021 en Vc/2i, respectievelijk. De uitdrukking van Prdm 14 was omhoog-geregeld en Dnmt3b en Dnmt3l daalde na PD0325901-met inbegrip van cultuur. Dnmt3a tentoongesteld geen verandering. Β-tubuline werd vastgesteld als de interne referentie. Con: Controle; PD: PD0325901; CH: CHIR99021. Dit cijfer is gewijzigd van Li et al. 25. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: Vc/PD0325901-geïnduceerde wijziging in mRNA uitdrukking van pluripotente genen en de activiteit van alkalische fosfatase. (A) de mRNA niveau van gedeeltelijke pluripotente genen werd veranderd door de behandeling van een 5 daagse van Vc/PD0325901 ten opzichte van dat serum omstandigheden (Control). Gegevens waren vertegenwoordigd zoals bedoel ± SD. De statistische significantie werd geëvalueerd en p < 0.05 was statistisch significant. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0.001 en ns niet-significant vertegenwoordigd. PD: PD0325901. Muis ES cellen in serum voor 26 dagen (B) tentoongesteld gedeeltelijke uitgroei gekenmerkt door witte streepjeslijnen ovale, terwijl Vc/PD0325901-toegevoegde serum medium grote morfologie en een ongedifferentieerde staat (C onderhouden). Deze beelden werden verkregen uit een omgekeerde Microscoop verbonden met een camera op het heldere gebied. Dit cijfer is gewijzigd van Li et al. 25. schaal bars = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In het werk, wij een nieuwe methode van het combineren van Vc en PD0325901 te houden muis ES-cellen om een ongedifferentieerde en hypomethylated state, die werd bereikt door een synergetische actie ter bevordering van DNA demethylatie door Vc en onderdrukken van DOVO DNA aangetoond Methylation door PD0325901. Bovendien toonde muis ES cellen grote morfologie onder het systeem van Vc/PD0325901 cultuur.

Om beter de provincie muis ES-cellen in het Vc/PD0325901 cultuur-systeem, zijn er enkele kritische stappen. Ten eerste, FBS batches moeten worden vooraf gescreend te vinden en de beste batches; voorraad ook is frequente vervanging van serum schadelijk aan de celproliferatie en aan het behoud van pluripotent. Ten tweede vermijden over pipetting cellen tijdens de distantiëren van de kolonies van de cel tot de schorsing van een eencellige in de cel passage fase. In de derde plaats om te verzachten het nadelige effect van trypsine tijdens de teelt van de cel, moet de trypsine worden verwijderd zodra het heeft betrekking op de cellen in de gerechten in de cel passaging. Bovendien moet het kweekmedium Vc/PD0325901 dagelijks worden vervangen als gevolg van de instabiliteit van Vc.

In vergelijking met de klassieke serum cultuur Toon muis ES-cellen onder Vc/PD0325901 voorwaarden een homogener celpopulatie (figuur 3B, C) en een hypomethylated staat, die lijkt op ICM en PGC. Bovendien, vergeleken met de onlangs ontwikkelde 2i cultuur, onze methode de hypomethylation met snellere kinetiek kan realiseren, en het gebruik van een enkele inhibitor (PD0325901) vermindert de input hoeveelheid DMSO, dus het verminderen van de schade aan de cellen. Echter, als gevolg van de toevoeging van FBS in ons systeem van de cultuur, de ambivalente dubbele acties van FBS kunnen veroorzaken celdifferentiatie tijdens langetermijnkweek. Globaal, dit nieuwe cultuur-systeem is geschikt voor het onderhoud en de uitbreiding op grote schaal van muis ES-cellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs vermelden geen potentiële belangenconflicten.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door de nationale Natural Science Foundation van China (21435008 en 21327006 naar H.W.), en de strategische prioriteit Research Program van de Chinese Academie van Wetenschappen (XDB14030200 naar H.W.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
fetal bovine serum Australia source Corning 35-076-CV Component of mouse ES cell medium
DMEM/high glucose Hyclone SH30022 Component of mouse ES cell medium
LIF Millipore ESG1107 Component of mouse ES cell medium
non-essential amino acids (NEAA) Gibco 11140050 Component of mouse ES cell medium
sodium pyruvate Gibco 11360070 Component of mouse ES cell medium
L-glutamine Gibco 25030081 Component of mouse ES cell medium
penicillin streptomycin solution Gibco 15140122 Component of mouse ES cell medium
PBS Sigma P5493 Cells rinse
trypsin Hyclone SH30042 Cell dissociation
gelatin Sigma 48722 Dishes coating
PD0325901 Stemolecule 04-0006-10 small-molecule chemical for cell culture
CHIR99021 Stemolecule 04-0004 small-molecule chemical for cell culture
vitamin C Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd  XW00508171 small-molecule chemical for cell culture
Ultra Bioscience water purification systemr Purelab Ultra Ultra water
DMSO Sigma D8418 Cell freezing medium
centrifuger Eppendorf 5427R DNA and protein extraction
protease inhibitor cocktail Sigma P8340 Component of RIPA buffer
PMSF Protease Inhibitor ThermoFisher Scientific 36978 Component of RIPA buffer
DTT Sigma 43815 Component of RIPA buffer
EGTA Sigma E3889 Component of RIPA buffer
Genomic DNA Purification Kit  Promega A1125 Genomic DNA extraction
NanoDrop 2000 ThermoFisher Scientific NanoDrop 2000 Determination of DNA concentration
calf intestinal phosphatase New England Biolabs M0290 DNA digestion
DNase I New England Biolabs M0303 DNA digestion
snake venom phosphodiesterase I Sigma P4506 DNA digestion
Nanosep 3K Omega Pall OD003C35 filtration of digested DNA
1290 UHPLC system Agilent  1290 UHPLC separation
G6410B triple quadrupole mass spectrometer Agilent  G6410B MS/MS analysis
Zorbax Eclipse Plus C18 column Agilent  Zorbax Eclipse Plus colume for UHPLC separation
5-methylcytosine Solarbio Life Sciences SM8900  standard 5mC
5-hydroxymethylcytosine (standard) Toronto Research Chemicals M295900 standard 5hmC
Prdm14 antibody bioworld BS7634 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3a antibody bioworld BS6587 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3b antibody abcam ab13604 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3l antibody abcam ab3493 Western blot analysis-primary antibody
Dnmt1 antibody abcam ab13537 Western blot analysis-primary antibody
β-tubulin antibody bioworld BS1482MH Western blot analysis-primary antibody
goat anti-rabbit IgG abcam ab6721 Western blot analysis-secondary antibody
goat anti-mouse IgG abcam ab6789 Western blot analysis-secondary antibody
Trizol Invitrogen 15596-026 RNA extraction
reverse transcription system Promega A3500 RNA reverse transcription
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6001 RT-PCR
StemTAG alkaline phosphatase staining and activity assay kit Cells Biolabs, Inc. CBA-302  alkaline phosphatase staining analysis
mouse ES cells: WT, 129 SvEv Provided by Professor Guoliang Xu (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China) cell strain of mouse ES cells
microscope Zeiss LSM510 cells observation
GraphPad Prism 5.0 GraphPad Prism Software Inc. 5.0 statistical analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).
  2. Smith, A. G. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 435-462 (2001).
  3. Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
  4. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78 (12), 7634-7638 (1981).
  5. Eiselleova, L., et al. Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells. Int. J. Dev.Biol. 52 (4), 353-363 (2008).
  6. Williams, R. L., et al. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336 (6200), 684-687 (1988).
  7. Tamm, C., Galitó, S. P., Annerén, C. A comparative study of protocols for mouse embryonic stem cell culturing. Plos One. 8 (12), e81156 (2013).
  8. Yamaji, M. PRDM14 ensures naive pluripotency through dual regulation of signaling and epigenetic pathways in mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 368-382 (2013).
  9. Ficz, G., et al. FGF signaling inhibition in ESCs drives rapid genome-wide demethylation to the epigenetic ground state of pluripotency. Cell Stem Cell. 13 (3), 351-359 (2013).
  10. Smith, Z. D., et al. A unique regulatory phase of DNA methylation in the early mammalian embryo. Nature. 484 (7394), 339-344 (2012).
  11. Ying, Q. L., Nichols, J., Chambers, I., Smith, A. BMP induction of Id proteins suppresses differentiation and sustains embryonic stem cell self-renewal in collaboration with STAT3. Cell. 115 (3), 281-292 (2003).
  12. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  13. Leitch, H. G., et al. Naive pluripotency is associated with global DNA hypomethylation. Nat. Struct. Mol. Biol. 20 (3), 311-316 (2013).
  14. Galvao, J., Davis, B., Tilley, M., Normando, E., Duchen, M. R., Cordeiro, M. F. Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO. FASEB J. 28 (3), 1317-1330 (2014).
  15. Yin, R., et al. Ascorbic acid enhances Tet-mediated 5-methylcytosine oxidation and promotes DNA demethylation in mammals. J. Am. Chem. Soc. 135 (28), 10396-10403 (2013).
  16. Guerra, A. D., Rose, W. E., Hematti, P., Kao, W. J. Minocycline modulates NFκB phosphorylation and enhances antimicrobial activity against Staphylococcus aureus in mesenchymal stromal/stem cells. Stem Cell Res. Ther. 8 (1), 171 (2017).
  17. Blaschke, K., et al. Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells. Nature. 500 (7461), 222-226 (2013).
  18. Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324 (5929), 930-935 (2009).
  19. Wu, H., Zhang, Y. Mechanisms and functions of Tet protein-mediated 5-methylcytosine oxidation. Genes Dev. 25 (23), 2436-2452 (2011).
  20. Inoue, A., Zhang, Y. Replication-dependent loss of 5-hydroxymethylcytosine in mouse preimplantation embryos. Science. 334 (6053), 194 (2011).
  21. He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).
  22. Maiti, A., Drohat, A. C. Thymine DNA glycosylase can rapidly excise 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine: Potential implications for active demethylation of CpG sites. J. Biol. Chem. 286 (41), 35334-35338 (2011).
  23. Habibi, E., et al. Whole-genome bisulfite sequencing of two distinct interconvertible DNA methylomes of mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 13 (3), 360-369 (2013).
  24. von Meyenn, F., et al. Impairment of DNA methylation maintenance is the main cause of global demethylation in naive embryonic stem cells. Mol. Cell. 62, 848-861 (2016).
  25. Li, C., Liu, B., Zhong, S., Wang, H. MEK inhibitor PD0325901 and vitamin C synergistically induce hypomethylation of mouse embryonic stem cells. Oncotarget. 7 (26), 39730-39739 (2016).
  26. Hackett, J. A., et al. Synergistic mechanisms of DNA demethylation during transition to ground-state pluripotency. Stem Cell Reports. 1 (6), 518-531 (2013).
  27. Nakaki, F., Saitou, M. PRDM14: a unique regulator for pluripotency and epigenetic reprogramming. Trends Biochem. Sci. 39 (6), 289-298 (2014).
  28. Nichols, J., Smith, A. Pluripotency in the embryo and in culture. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4 (8), (2012).

Tags

Biochemie kwestie 136 vitamine C PD0325901 muis embryonale stamcellen-cellen DNA-hypomethylation Prdm14 pluripotent
Een alternatieve cultuur methode om Genomic Hypomethylation van muis embryonale stamcellen met MEK-remmer PD0325901 en vitamine C
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, C., Lai, W., Wang, H. An… More

Li, C., Lai, W., Wang, H. An Alternative Culture Method to Maintain Genomic Hypomethylation of Mouse Embryonic Stem Cells Using MEK Inhibitor PD0325901 and Vitamin C. J. Vis. Exp. (136), e56391, doi:10.3791/56391 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter