Summary
Beschrijven we een methode voor laminotomy in varkens die toegang tot lumbale dorsal root ganglia (DRG) voor intraganglionic injectie geeft. Injectie is toezicht op de vorderingen en en histologisch bevestigde tot 21 dagen na de operatie. Dit protocol kan worden gebruikt voor toekomstige Preklinische studies waarbij DRG injectie.
Abstract
Dorsal root ganglia (DRG) zijn anatomisch goed gedefinieerde structuren die alle primaire sensorische neuronen onder het hoofd bevatten. Dit feit maakt DRG aantrekkelijke doelen voor injectie van roman therapeutics gericht op de behandeling van chronische pijn. In kleine diermodellen, is laminectomie gebruikt om de DRG injectie omdat daarbij chirurgische verwijdering van de wervel bot rond elke DRG. We tonen een techniek voor intraganglionic injectie van lumbale DRG in een grote diersoorten, namelijk varkens. Laminotomy wordt uitgevoerd om directe toegang tot de DRG met behulp van standaard neurochirurgische technieken, instrumenten en materialen. In vergelijking met de meer uitgebreide bot verwijderen via laminectomie, implementeren we laminotomy om te besparen wervelkolom anatomie terwijl het bereiken van voldoende DRG toegang. Intraoperatieve voortgang van DRG injectie wordt gecontroleerd met behulp van een niet-toxisch kleurstof. Na euthanasie op postoperatieve dag 21, het welslagen van de injectie wordt bepaald door de histologie voor intraganglionic distributie van 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Wij injecteren een biologisch inactieve oplossing om aan te tonen van het protocol. Deze methode zou toegepaste voortaan Preklinische studies naar doel therapeutische oplossingen voor DRG. Onze methodologie moet vergemakkelijken de vertaalbaarheid van intraganglionic kleine dierlijke paradigma's te testen in een grote diersoorten. Bovendien, kan dit protocol dienen als een belangrijke bron voor die planning van preklinische studies van DRG injectie in varkens.
Introduction
Dorsal root ganglia (DRG) zijn anatomisch discrete, neuronale verzamelingen gelegen langs de wervelkolom. Elke DRG bevat de primaire sensorische neuronen die coderen en doorsturen van perifere prikkels aan het centrale zenuwstelsel (CNS) uit specifiek orgaan regio's. Bijvoorbeeld, begint de pijn van artrose met pijnreceptoren gelegen over een gezamenlijke waarnemen schadelijke stimuli. Dit proces heet Nociceptie. Op lange termijn bewustzijn van schadelijke stimuli leidt tot chronische pijn 1.
Chronische pijn is een frequent onderwerp van preklinische studie 2 waar het doel is om nuttige methoden voor gerichte levering van pijnstillers aan DRG, zoals intraganglionic injectie 3te ontwikkelen. Deutsche Reichsbahn zijn echter moeilijk toegankelijk, omdat zij zich bevinden binnen de boney grenzen van lat. foramen 4. Verschillende groepen hebben met succes het overwinnen van dit obstakel door het gebruik van de wervelkolom chirurgie in knaagdieren 5,6,7,8,9,10.
In de kliniek, laminectomie is een gemeenschappelijk rug operatie en verwijst naar de chirurgische verwijdering van de wervel lamina, waardoor unroofing de vertebral kanaal 11. Opneming van chirurgische technieken om directe toegang bieden DRG succesvol is geweest in knaagdieren 5,12, vertaling kan evenwel onrealistisch overweegt verschillen in grootte van de betrokken structuren en hoe die invloeden farmacokinetiek of technische haalbaarheid 13,14. Bijvoorbeeld vastgesteld een studie de diameter van de dwarse ruggenmerg bij T10 3.0, 7.0, en 8,2 mm voor de rat, varken en menselijk, respectievelijk 15. Dus diermodellen grote beter geschatte menselijke afmetingen van zenuwstelsel structuren.
In varkens gebruikt de Raore et al. multi-level laminectomie toegang te krijgen tot het cervicale ruggenmerg voor meerdere intraspinal injecties 16. De procedure werd goed verdragen en geleid tot een fase I klinische proef waar vergelijkbare chirurgische resultaten waren gedocumenteerd 17. Deze resultaten bevorderen voortgezet gebruik van preklinische grote dierlijke modellen als voorspellers van technische haalbaarheid en veiligheid bij de mens.
Tot op heden bestaat geen gedetailleerde methodologie voor chirurgische toegang en injectie van de DRG in een grote diersoorten. Als u wilt dit translationeel kloof te verkleinen, rapporteren we een protocol voor DRG blootstelling en injectie via laminotomy in varkens. Standaard neurochirurgische technieken, instrumenten en materialen werden gebruikt en de methode werd ontworpen om na te bootsen moderne chirurgische praktijk. We tonen intraganglionic injectie met behulp van een waterige oplossing voor lumbale DRG en Bevestig succesvolle levering via histologie na postoperatieve dag 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Mayo Clinic.
1. vereisten van strengheid en reproduceerbaarheid
- te zorgen van de strengheid van ontwerp, volg nationale normen van goede laboratorium praktijken zijn te allen tijde en interne erkend door IACUC (of soortgelijke Commissie) voorafgaand aan een dier betrokkenheid bij experimenten.
Opmerking: Dit protocol werd ontworpen om een klinisch trouw aanpak. Dus, de materialen, instrumenten en technieken die worden beschreven op een manier die identiek zijn aan de hoogste klinische normen bij de mens. Bijvoorbeeld, strenge steriele techniek wordt gevolgd en verlopen materialen mag nooit worden gebruikt. - Ter ondersteuning van de reproduceerbaarheid van deze methode in een experimentele omgeving, ontwikkelen van interne operationele standaardprocedures en controle voor variabiliteit in varkens ras, gewicht, geslacht en leeftijd tussen afzonderlijke cohorten.
Opmerking: Het ontwerp van dit protocol was gebaseerd op het gebruik van varkens 38-53 kg. weegt
2. Pre-operatieve Animal Care
- beheren profylactische intramusculair (IM) ceftiofur, gegeven bij 5 mg/kg, 1 dag vóór de ingreep.
- Snel van vast voedsel dieren en dieren verhinderen dat cosmetische behandelingen, d.w.z. olie baden, 12 uur vóór de ingreep.
- Induce narcose binnen 1 uur van de procedure, met behulp van IM tiletamine en zolazepam, als Telazol bij 5 mg/kg, en IM xylazine, gegeven op 2 mg/kg. gegeven
- Zodra geïnduceerde, onderhuidse (SC) buprenorfine opgelopen release (SR), gegeven op 0,18 mg/kg. beheren
- Plaats een oor-veneuze katheter en het uitvoeren van snelle opeenvolging intubatie om een Endotracheale tube.
- Hechten van een Pulsoximeter met hartslag controle functie om de tong oxygenatie en hartslag controleren.
- Plaats van het dier in de vatbaar positie en illustraties van de huid over het dorsum met behulp van een elektrische clipper. Haar illustraties over een grote, bilaterale gebied uit te breiden van de middellijn sagittale vlak aan de middellijn coronale vlak en lengterichting van de sacrale apex aan de scapular stekels. Gebruik plakband om te verwijderen van de vrij zwevende huid en haren.
- Schrobben het uitgeknipte gebied tot 3 keer met warm water en zeep en droog de huid met behulp van een pluisvrije handdoek.
- Mark bilaterale anatomische monumenten met een chirurgische markering-pen. Mark van de laatste ribs iliac toppen, spinous processen en de dwarsuitsteeksels.
Opmerking: Door te markeren de laatste ribs iliac toppen en de dwarsuitsteeksels, de lumbale wervelkolom is afgebakend in de superior, inferior en zijdelingse begrenzingen, respectievelijk. Dit protocol is ontworpen om de toegang en de injectie van een lumbale DRG van belang. Ter referentie, de superieure iliac toppen uitlijnen met de L3 en L4 Vertebrale niveau. - Dekking van het dier met een warme deken voor transport naar de operatieve suite.
3. Positionering in de operatieve Suite
- zachtjes lift en het dier vatbaar positie in een gemodificeerde groot menselijk dier sling met gewatteerde abdominale diafragma.
Opmerking: De abdominale diafragma zorgt voor afname van de abdominale druk vergelijkbaar met het frame van de Wilson gebruikt tijdens de menselijke operatie van de wervelkolom. Beurtelings, vermindert dit intraoperatieve bloeden uit de spinale bloedvaten. De slinger is gunstig omdat de benen zijn toegestaan om te hangen vrij door gewatteerde openingen die het dier tegen perifere zenuwen impingement beschermen. Echter omdat het frame van de slinger is gemaakt van metaal, moet het worden opgevuld met isolatie elektrische kortsluiting en onbedoelde dierlijke branden te voorkomen. Een deken rollen kan worden geplaatst om de positie van het hoofd en de nek in een comfortabele positie, afhankelijk van de grootte van het dier te. - Behouden narcose met 1-3% ingeademd (IH) Isofluraan, getitreerd daartoe. Bevochtig ogen met ophthalmic zalf en tape ze zachtjes dicht.
- Plaatsen-regels voor de controle van de vitale teken aan document temperatuur, bloeddruk, hartslag en zuurstoftoevoer. Controleren van ventilatie door capnography.
- Plaatst u een zelfklevende, wegwerp elektrochirurgische dispersief elektrode op de linker of rechter schouderblad.
- Beheren opgewarmd Ringer Lactated ' s als onderhoud vloeistoffen via de oor-veneuze katheter. Geven van vloeistoffen met een snelheid van 5-10 mL/kg/h.
- Plaatst u een opwarming van de aarde apparaat van gedwongen-lucht boven de thoracale en cervicale regio en voorkomen die betrekking hebben op de laatste ribbetjes.
4. Steriele voorbereiding van operatieve veld voor een linkerpagina injectie
nota: vanaf dit punt naar voren, gaan in strenge steriele mode.
- Voorbereiden de huid over het begin van de lumbale wervelkolom met ruime toepassing van 0,7% jodium povacrylex en 74% isopropyl alcohol volgens de fabrikant ' s instructies. Lateralize om ervoor te zorgen dat de naald van de gids later kan worden geplaatst in een steriele mode, toepassing naar de kant van de geplande injectie door uit te breiden naar de middellijn coronale vlak langs de gemarkeerde dwarsuitsteeksels antisepsis.
- Plaats van wegwerpbare handdoeken van de chirurgische in rechthoekige mode te schetsen van de geplande incisie site, die over de middellijn langs de gemarkeerde lumbale spinous processen is.
- Toepassen een lijm antimicrobiële incise draperen over de operatieve handdoeken en huid blootgesteld. Klem gordijnen in plaats en de rand van de gordijnen uit het operationele gebied uit te breiden.
- Een verticale gordijn aan palen aan het hoofd van de strop of tussen de operatieve veld en de monitoring technicus secure.
- Secure lijnen voor zuig- en elektrochirurgie binnen het operationele gebied door klemmen aan de steriele gordijnen. Passeren van de vrije uiteinden van buizen en draden uit het steriel veld.
5. Huid incisie en dissectie van de Subperiosteal
- palperen van de lumbale spinous processen langs de middellijn en identificeren van 3 opeenvolgende Vertebrale niveaus.
- Gebruiken een scalpel #15 te openen een Sagittaal incisie van de middellijn van 8-12 cm via de incise gordijn direct posterieure aan de spinous processen. Handhaven van hemostase met behulp van gaas tamponade en monopolaire elektrochirurgie.
Opmerking: Let erop niet af te wijken van de middellijn als de incisie is gevorderd in de voorste richting omdat dit beperkt bloeden uit de paraspinal spieren. Periodieke palpatie voor de spinous processen vergemakkelijkt vooruitgang. Zelf behoud van Weitlaner, Meyerding of Gelpi OPROLMECHANISMEN kan worden geplaatst en zo nodig ter vergemakkelijking van de dissectie verplaatst. Zuigkracht wordt gebruikt om zichtbaarheid. - Ontleden de subcutane weefsel en vet met behulp van monopolaire elektrochirurgie totdat de thoracolumbar fascia is bereikt. De spinous processen diep aan de thoracolumbar fascia palperen en snijd de fascia langs de middellijn bloot de supraspinata ligament spanning tussen spinous processen.
Opmerking: De thoracolumbar fascia wordt geïdentificeerd als een georganiseerde, aponeurotic schede met een bindweefsel graan dat in een schuine, lateraal op mediale richting achtergrondspoor. Op dit punt, de incisie in de superior of inferieur richting om ervoor te zorgen dat de 3 spinous processen volledig zichtbaar met de centermost spinous proces uitgelijnd binnen het middelpunt van de dissectie-veld zijn kan worden verlengd. - Gebruiken een #15 mes te plaatsen van een incisie van 2-mm diepe parasagittal door middel van het ligament supraspinata posterieure aan elk spinous proces. Plaats elke snede langs de linker derde van het achterste oppervlak van het proces van spinous.
- Vrij voorzichtig het ligament supraspinata op elk niveau langs iedere meerderingision met behulp van een vrijere lift van 5 mm.
- Het subperiosteal vliegtuig identificeren en ontleden binnen die vlak langs het laterale oppervlak van elk proces spinous.
- Subperiosteal dissectie uitvoeren op elk spinous proces op een parallelle manier om ervoor te zorgen dat een zachte, zelfs dissectie is bereikt.
- Incise de paraspinal spier bijlage langs de interspinous ruimten met behulp van monopolaire elektrochirurgie in concert met subperiosteal dissectie.
- Identificeren de lamina op elk niveau en blijven subperiosteal dissectie lateraal te bereiken van de laterale rand van de 2 zygapophyseal gewrichten die verbinding maken met de 3 blootgestelde wervels en te bereiken van de laterale rand van de lamina tussen de gewrichten, genaamd de pars interarticularis.
Opmerking: De pars interarticularis is de achterste rand van de lat. foramen waarin de DRG zich bevindt. Af en toe een kleine ader komt voort uit een foramen gelegen op het achterste oppervlak van de lamina. Deze aders hebben de neiging te scheuren tijdens de subperiosteal dissectie. Hemostase wordt gemakkelijk bereikt met behulp van een combinatie van bipolaire elektrochirurgie en been wax toegepast op het foramen.
6. Gelijkvloerse Laminotomy
- het doel van laminotomy identificeren als de centermost lamina gelegen tussen en mediale aan de 2 zygapophyseal gewrichten.
- Traceren de lamina naar zijn inferieur rand, tot een punt net mediale aan het aaneengesloten inferieur articulaire proces van het caudal zygapophyseal gewricht.
- Gebruiken een 5-mm vrijer lift of curettage te palperen van de overgang tussen de rand van de caudalmost van de lamina en centrale kanaal.
Opmerking: Zorg wordt genomen niet dwingen de palpating instrument anterior zoals dit dural OSS en het ruggemerg stuurt. Merk op dat het ruggenmerg in varkens strekt zich uit langs de lumbale wervelkolom 18. Een tussenwervelschijf rongeur kan worden gebruikt voor het verwijderen van extra zacht weefsel overliggende van dit gebied te vergemakkelijken van palpatie. - Gebruik een 2-mm up-bijten, 45 graden Kerrison rongeur bot in een stuksgewijze mode uitpakken. Verwijderen van bot langs de basis van het proces van de spinous superiorly tot een niveau net caudal op het caudal oppervlak van de stam en lateraal uit haar volle omvang.
- Gebruik aflopend bot rongeurs om te helpen met de verwijdering van het bot. Laat de inferieure articulaire proces die was verbonden met de lamina in plaats totdat de laminotomy is grotendeels voltooid.
- Bevestigen dat de inferieure articulaire proces vrij mobiel en bijgevoegde alleen door de zygapophyseal gezamenlijke capsule is. De capsule met behulp van een #15 en #11 mes incise.
- Verwijderen van de inferieure articulaire proces in een stuksgewijze mode maar het aangrenzende superieure articulaire proces intact laten.
Opmerking: Als de laminotomy is voltooid, wordt hemostase uitgevoerd met bipolaire elektrochirurgie. Monopolaire elektrochirurgie is niet gebruikt vanwege de nabijheid van neurale structuren. Been wax kan worden geplaatst langs sites van bloeden uit blootgestelde bot en absorbeerbare gelatine sponzen kunnen worden gebruikt voor het verkrijgen van hemostase in de buurt van weke delen. Cottonoid is een nuttig hulpmiddel om wick met vocht en bloed uit de buurt van de dissectie.
7. Dissectie van de Deutsche Reichsbahn
- Evacuate het epidurale vet in een stuksgewijze mode van oppervlakkig naar diepe begin mediaal en lateraal verloopt. Verwijderen van vet door zachte dissectie met behulp van bipolaire pincet en zuig met 6-10 Franse Frazier zuig tips.
Opmerking: Loupe vergroting of het gebruik van een ontleden Microscoop is nuttig bij het verstrekken van de mate van detail die nodig zijn voor het veilig evacueren van de epidurale vet en bereiken van nauwgezette hemostase van de epidurale veneuze plexus met behulp van bipolaire elektrochirurgie. - Identificeren de dural OSS langs de middellijn uitgevoerd in een superoinferior richting, evenwijdig aan de aslijn van de huid incisie. Epidurale vet langs de dural sac verwijderen totdat de dural OSS kan blijken dat aanleiding geven tot de dural zenuw wortel mouw.
- Traceren de dural mouw lateraal en ondeugdelijkheid epidurale vet evacuatie totdat het wordt gezien om te vergroten rond de DRG.
Opmerking: Identificeer de DRG voor haar ovale vorm en geel tot oranje kleur. Op de mid lumbale wervelkolom is de DRG meestal 4-6 mm in grootte, langste in het mediale, laterale richting, en ligt direct inferieur of 2-3 mm aan de respectieve stam medial. Een botte, rechthoekige zenuw haak kan worden gebruikt om voorzichtig voor de stam palperen. - Evacueren epidurale vet lateraal, voorbij de DRG, totdat de aangrenzende spinale zenuw wordt gezien.
Opmerking: Als durotomy optreedt, repareren door waterdichte sluiting met 6-0 nylon hechtdraad en glad micro naald stuurprogramma in een eenvoudige lopende stich.
8. Injectie van de Deutsche Reichsbahn
- gebruik een spinale naald van 22-gauge te begeleiden de baan van een 32-gauge convectie verbeterde levering (CED) naald. Punctie van de 22-gauge gids naald door de huid en paraspinal spieren.
Opmerking: De CED naald is ontworpen om vloeistof convectie in weefsel, ook bekend als bulk stroom, als gevolg van druk verlopen 19 , 20. - Beogen de naald van de gids langs een traject dat benadert de lengteas van de Deutsche Reichsbahn en resulteert in het uiteinde van de naald uit de muur van de laterale paraspinal van het veld dissectie.
- Fine tune de naald weg totdat de naald lumen wordt uitgelijnd met het middelpunt van de Deutsche Reichsbahn.
Opmerking: De gids naald nooit mogen contact opnemen met de Deutsche Reichsbahn. - Steriel injectate opstellen in een steriele injectiespuit en de spuit verbinden met de steriele infusie buis.
- Beveiligen van de buis aan de CED naald en de spuit uit de steriele veld hand. De spuit verbinden met een programmeerbare-spuitpomp.
Opmerking: Buis is bereid tot een lengte van 5 voet om ervoor te zorgen dat de steriliteit en mobiliteit worden gehandhaafd. Ook is het van het allergrootste belang dat er geen luchtbellen worden ingevoerd in oplossing. - De injectate verder tot expressie wordt gezien vanaf de punt van de naald CED.
- De naald van de CED binnen de gids naald lumen en de CED naald langzaam verder totdat uit de gids naald tip blijkt. Zorgen dat de DRG niet tijdens naald uitlijning is doorboord.
- Fine tune de gids naald positie langs de lange as van haar baan om te bepalen van de uiteindelijke locatie van de CED-tip.
- De gids veilige naalden en CED naald samen met elkaar grijpende naald hubs zodra diepte en de uitlijning van de gids en CED naalden is bereikt.
- Bevestigen dat alle injectie apparatuur verbindingen zijn volledig beveiligd, waaronder de gids naald, CED naald, en aangesloten leidingen boordevol injectate.
- Verder van de naald van de gids langs de lange as tot de onderlinge aanpassing van de CED naald uiteinde en de Deutsche Reichsbahn.
- De DRG met de tip van CED naald punctie.
- Borrelend de CED naald tip in het driedimensionale midden van de Deutsche Reichsbahn.
Opmerking: omdat de DRG een driedimensionale structuur van variabele grootte en vorm is, DRG blootstelling moet zijn afgerond om nauwkeurig de CED naald tip op het echte centrum van de Deutsche Reichsbahn. De echte DRG-centrum ligt op het snijpunt van de drie anatomische assen, namelijk de anterior naar posterior, lateraal naar mediaal, en superieur aan inferieure assen. - Leveren 100 μl van injectate door met behulp van een geijkte snelheid en volume van 3 stappen CED.
- Leveren 4 μl op 2 μL/min voor de eerste stap. 8 μL leveren op 4 l/min voor de tweede stap. 8 l/min voor de derde en laatste stap leveren 88 μL.
Opmerking: Laat een 3-min pauze tussen stappen en na de laatste stap te maken voor druk evenwichtsinstelling. - Trekken de injectie apparatuur na de laatste injectie stap en 3-min pauze langs de lange as in een gladde, zachte beweging.
Opmerking: Voor ingespoten oplossingen die kleurloos zijn, gekleurde kleurstof is opgenomen in de oplossing bij een concentratie van 0,1% gewicht/volume bij visuele beoordeling van injectate distributie 12. Ook de vitale kleurstof 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) is opgenomen in oplossing bij een concentratie van 0,25 μg/l wanneer de studie ontwerp histologische beoordelingvan injectate distributie 5 vereist.
9. Sluiting
- van toepassing 3 rondes van warme zoute irrigatie naar de chirurgische site vóór sluiting te mobiliseren en spoelen van de site van puin, dat wil zeggen de botfragmenten. Zuig gebruiken om te herstellen van de zoutoplossing en puin.
Opmerking: Zorgvuldige hemostase is gewaarborgd wanneer irrigatie duidelijk blijft. Hemostatische agenten (gelatine spons) en cottonoid zijn verwijderd op dit moment. Zorgen dat alle materialen en instrumenten zijn gewist van de incisie site vóór sluiting. - Gebruik van een 3-gelaagde techniek voor sluiting.
- De thoracolumbar hechtdraad fascia 0 Sutuur (geologie) met een eenvoudige, onderbroken, noninverted mode. Plaatsen van een stich elke 5-8 mm om waterdichte sluiting.
- Hechtdraad geplaatst van het subcutane weefsel met 2-0 Sutuur (geologie) in een eenvoudige, onderbroken, omgekeerde mode met een steekje vallen elke 5 - tot 8-mm te bereiken van voldoende sterkte.
- Sluit de huid met behulp van 0 Sutuur (geologie) in een eenvoudige, actief of onderbroken mode.
- Een naald teller gebruiken om ervoor te zorgen dat geen slijpsel vermisten voor
- Bevloeiing van de huid met zoutoplossing, de huid droog en plaats zelfklevend verband stroken loodrecht op de incisie.
- Gaas op de top van de pleister strips en hechten een definitieve lijm antimicrobiële incise draperen.
10. Post-operatieve Animal Care
- Extubate, dek af met warme dekens, en vervoer van het dier tot herstel.
- Volg institutionele operationele standaardprocedures voor postoperatieve bewaking en herstel van overleving chirurgie. Minimaal acht het dier elke 15 min tot terugkeer van bewustzijn, per uur totdat volledige verdoving herstel wordt bereikt, en tweemaal daags daarna.
- Geven postoperatieve pijn beheer door het toedienen van IM of mondelinge carprofen, gegeven op 4 mg/kg, eenmaal daags gedurende 5 dagen vanaf postoperatieve dag 0. Beheren van SC buprenorfine SR, gegeven bij 0,18 mg/kg, eenmaal op postoperatieve dag 2.
- Beheren van post-operatieve antisepsis doordat IM ceftiofur, gegeven bij 5 mg/kg, eenmaal op postoperatieve dag 4.
- Verwijder het verband op postoperatieve dag 5-7. Verwijderen van de hechtingen bij wondgenezing voltooid, meestal op postoperatieve dag 10-14 is.
- Het dier volgens institutionele operationele standaardprocedures humaan euthanaseren zodra het eindpunt van de studie is bereikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Histologische beoordelingvan injectate verspreiding
Succesvolle levering van injectate aan DRG wordt bepaald door de histologische beoordelingvan DAPI verspreid. De techniek gaat positionering van de naald-tip in de driedimensionale midden van de Deutsche Reichsbahn. Daarom, succesvolle levering wordt bepaald door de beoordeling van de omvang van de DAPI kleuring van histologische secties beide in de buurt van (centrale DRG delen) en verre (perifere DRG afdelingen) tot aan de vingertop naald. Figuur 1A en figuur 1B vertegenwoordigen een succesvolle injectie van één DRG. DAPI kleuring werd gelijkmatig verspreid door zowel de centrale en perifere DRG parenchym. Dus, een succesvolle DRG-injectie wordt geïllustreerd door de diffuse verspreiding van de DAPI kleuring gedurende de driedimensionale DRG-architectuur. Sub-optimale injectie wordt geïllustreerd door inconsistente kleuring. Bijvoorbeeld, minimale kleuring (Figuur 1 c) of focal kleuring langs de buitenste rand maar niet innerlijke aspect van DRG parenchym (Figuur 1 d) geeft aan mislukte injectie. Ook illustreren gezamenlijk onderzocht, Figuur 1 c (middenstuk van de DRG) en Figuur 1 d (perifere DRG sectie) een gebrek aan consistente kleuring binnen drie dimensies voor dit één lumbale DRG.
Figuur 1 : Driedimensionaal beoordelingvan DAPI distributie in ingespoten DRG. (A) een centraal gedeelte uit een ingespoten lumbale DRG representatief zijn voor een succesvol resultaat. De kleuring van de marker kleurstof DAPI is gelijkmatig verspreid over de hele DRG in twee dimensies. (B) een parallel, perifere gedeelte van de dezelfde DRG in (A), ter illustratie van de consistentie van de DAPI verspreid binnen een tweede vliegtuig van sectie, bevestiging van een succesvolle injectie in drie dimensies. (C) een centraal gedeelte uit een vertegenwoordiger van een sub-optimale resultaat ingespoten lumbale DRG. Minimale tot geen verkleuring van de DAPI wordt gezien met uitzondering van de occasionele foci. (D) een parallelle, perifere gedeelte van de dezelfde DRG in (C), ter illustratie van gedeeltelijke verdeling van de DAPI langs de DRG periferie. Blauw: DAPI. Rood: autofluorescence. Schaal bars = 500 μm (A en C), 100 μm (B en D). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We wilden een methode voor chirurgische blootstelling van DRG via laminotomy en intraganglionic injectie in een gezonde grote diersoorten, met name varkens. Bij knaagdieren is een gelijkaardige methode gedetailleerde 12 en gebruikt voor conventionele farmacologische agenten 8,10 en virale vectoren 6,,7,,9,12 naar de Deutsche Reichsbahn. De resultaten van de bovenstaande kleine dierlijke studies zijn veelbelovend en we hopen dat ons protocol zal de weg vrijmaken voor anderen om te vertalen van deze voorafgaande bevindingen aan varkens. Gezonde en zieke dieren werden gebruikt in de bovenstaande studies, ondersteuning van het nut van kleine dieren van preklinisch onderzoek. Onvermijdelijk, grote dierlijke modellen zullen moeten maken van de beste beschikbare vergelijking aan menselijke DRG in termen van grootte en injectate distributie. Het verschil in grootte van de DRG is bijvoorbeeld duidelijk tussen ratten en de mens. L5 DRG in volwassene, mannelijke ratten meet ongeveer 2,6 x 1,5 mm 5 in vergelijking met 11.6 x 6.6 mm in volwassen, mannelijke mensen 21. Op basis van levende radiografische metingen in varkens, L5 DRG bleken ongeveer 8,0 x 6.0 mm 22. Daarom liggen de varkens als een bijzonder nuttige soorten voor preklinische studie vanwege structurele gelijkenissen met het menselijke zenuwstelsel en in de buurt van spier-en anatomie. Dit blijkt uit de omgekeerde vertaling gebruikt voor het ontwerpen van dit protocol volgens die uitgevoerd in de kliniek. Bovendien, varkens zijn gebruik maken van dieren en zijn steeds belangrijker in biomedisch onderzoek. Dit protocol zal steunen Preklinische studies van intraganglionic levering van injecteerbare oplossingen om voorafgaande bevindingen van het werk bij knaagdieren naar grote dieren. Dit protocol kan daardoor nieuwe strategieën voor de behandeling van chronische pijn die anatomisch selectieve levering technieken kunnen worden geïntegreerd met roman moleculair selectieve agenten, die we voorspellen, kunnen hebben het potentieel om te transformeren van pijn geneeskunde 3bevorderen.
Aanvullende opmerkingen voor succesvolle DRG injectie
De prelaminar beenvlies lumbale wervel niveau in varkens blijft craniale in plaats van de Nekpees flavum. Tijdens laminotomy, het beenvlies gemakkelijk kan worden gescheiden door de plaatsing van de rongeur van de Kerrison en het uiterlijk van de dura mater kan nabootsen. Het is een cruciale stap om te onderscheiden van de Nekpees flavum beenvlies, epidurale vet en dura OSS zoals de dissectie wordt uitgevoerd. Bovendien, blootstelling van de epidurale ruimte is efficiënter en maakt minder bloeden als het beenvlies gelijktijdig met de lamina wordt verwijderd. Als het beenvlies wordt niet verwijderd samen met bot, kan het met een #11 mes ingesneden en verwijderd om het onderliggende epidurale vet bloot te stellen.
Om te doen geen kwaad is een topprioriteit en dit moet worden afgewogen tegen het doel van de DRG toegang en injectie. Dus zorg wordt genomen niet om vooraf de evacuatie van epidurale vet verder anteriorly of anteromedially dan nodig is om een positieve identificatie van de dural OSS dural zenuw wortel mouw en de Deutsche Reichsbahn. Dissectie in de richting van de anteromedial waar de dural OSS aanleiding tot de dural zenuw wortel mouw geeft is bijzonder gevaarlijk als een longitudinale epidurale ader zal oplopen. Bovendien verhoogt dissectie in deze richting het risico voor onbedoelde durotomy, gesignaleerd door de uitstroom van de cerebrospinale vloeistof van het oppervlak van de dural OSS.
Een laatste punt van kritiek is dat het dural sac, dorsal wortels, DRG in haar geheel, en spinale zenuw te identificeren. Dit helpt om 4 stuks van convergerende anatomische bewijs dat zorgen volledige DRG definitie. Definiëren van de DRG in zijn geheel is vereist om de positie van de naald-tip bij de driedimensionale center, dat de CED naald toelaat om een consistente drukverschil terwijl het maximaliseren van de afstand tot de omliggende anatomische grenzen. Beide factoren verhogen sterk de volumes die worden geleverd en het bereik van intraparenchymal verspreiden 19,20. Levering van injectate op een locatie die niet de echte anatomisch centrum leidt tot suboptimale injectie omdat inconsistent druk opleveren wanneer injectate van de nabijgelegen site van DRG punctie 20 lekken.
Een probleem met het gebruik van een naald CED voor DRG injectie is dat van de naleving. Zodra de injectie is begonnen, de tip van de naald zo stil mogelijk moet worden bewaard of anders druk verlopen zal wegnemen als gevolg van de abrupte veranderingen in naleving 20. Respiratoire beweging is een bron van continue beweging tijdens de injectie. Het risico van naald beweging ondergeschikt aan luchtwegen excursie wordt echter grotendeels verwijderd door de verankering van de handleiding en CED naald binnen de paraspinal musculatuur voorafgaand aan het aanprikken van de Deutsche Reichsbahn, zoals zowel de naald en de Deutsche Reichsbahn verplaatsen in synchrony met ademhaling. De duur van de injectie van een volume van 100 μl totalen 24 min getrapt tempo hier beschreven. Worden moet toegezien externe verstoring van het gehele injectie-apparaat gedurende deze tijd te beperken. Regeling van chirurgische veld, personeel, en de omliggende obstakels moet worden gewijzigd indien nodig voordat de injectie wordt gestart om een ongestoorde intermediair tussen de CED naald tip en de Deutsche Reichsbahn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
None; de auteurs hebben geen conflicten van belang aan deze studie gerelateerde.
Acknowledgments
De studie werd uitgevoerd met steun van de Stichting familie Schulze (aan A.S.B.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Large humane animal sling | Britz & Company | 002539 | Modified to include abdominal aperture |
| Adhesive patient return electrode - 9 inch | Medtronic | E7506 | - |
| Ranger blood & fluid warming system | 3M | 24500 | - |
| Lactated Ringer's fluid | Hospira | 0409-7953-09 | - |
| Force air warming device | 3M | 77500 | - |
| Duraprep solution with applicator, 26 mL (0.7% iodine povacrylex, 74% isopropyl alcohol) | 3M | 8630 | - |
| Sterile disposable surgical towels | Medline | MDT2168286 | - |
| Ioban 2 incise drape | 3M | 6651EZSB | - |
| Disposable suction canister and tubing | Medline | DYND44703H | - |
| Button switch electrosurgical monopolar pencil | Medtronic | E2450H | - |
| Fine smooth straight bipolar electrosurgical forceps, 4 1/2 inch | Bovie | A826 | - |
| #15 blade | Miltex | 4-315 | - |
| #11 blade | Miltex | 4-311 | - |
| 4 x 4 surgical gauze | Dynarex | 3262 | - |
| Weitlaner self-retaining retractor, 8 inch | Miltex | 11-618 | - |
| Meyerding self-retaining retractor, 1 x 2 3/8 inch | Sklar | 42-2078 | - |
| Gelpi self-retaining retractor, 7 inch | Sklar | 60-6570 | - |
| Freer elevator, 5 mm | Medline | MDS4641518F | - |
| Bone wax | Ethicon | W31G | - |
| Spurling intervertebral disc rongeur, 3 mm | Sklar | 42-2852 | - |
| Spurling 45-degree, up-biting Kerrison rongeur, 2 mm | Medline | MDS4052802 | - |
| Leksell angled rongeur, 2 mm | Sklar | 40-4097 | - |
| Gelfoam, size 50 | Pfizer | AZL32301 | - |
| Cottonoid patty | Medtronic | 8004007 | - |
| Frazier suction tip, 6 Fr | Sklar | 50-2006 | - |
| Frazier suction tip, 10 Fr | Sklar | 50-2010 | - |
| Dandy blunt right angle nerve hook | Medline | MDS4005220 | - |
| Nylon suture, 6-0 | Ethicon | 697G | - |
| Castroviejo smooth micro needle holder | Medline | MDG2428614 | - |
| 22 gauge Quinke point spinal needle | Halyard Health | 18397 | - |
| 32 gauge CED needle with locking Luer hub | See comments | n/a | As in: Pleticha, J., Maus, T.P., Christner, J.A., Marsh, M.P., Lee, K.H., Hooten, W.M., Beutler, A.S. Minimally invasive convection-enhanced delivery of biologics into dorsal root ganglia: validation in the pig model and prospective modeling in humans. Technical note. J Neurosurg. 121(4), 851-8 (2014). |
| Polyethylene tubing, 5 feet | Scientific Commodities | BB31695-PE/05 | - |
| Monoject syringe, 3 mL | Kendall | SY15352 | - |
| NanoJet syringe pump | Chemyx | 10050 | - |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | - |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | - |
| Bulb irrigation syringe | Medline | DYND20125 | - |
| Fine-toothed Adson forceps | Medline | MDS1000212 | - |
| Vicryl suture, 0 | Ethicon | J603H | - |
| Vicryl suture, 2-0 | Ethicon | J317H | - |
| Needle counter | Medline | NC20FBRGS | - |
| Steri-strip skin closure, 1/2x4 inch | 3M | R1547 | - |
References
- Millan, M. J. The induction of pain: An integrative review. Prog Neurobiol. 57 (1), 1-164 (1999).
- Burma, N. E., Leduc-Pessah, H., Fan, C. Y., Trang, T. Animal models of chronic pain: Advances and challenges for clinical translation. J Neurosci Res. , (2016).
- Pleticha, J., Maus, T. P., Beutler, A. S. Future directions in pain management: integrating anatomically selective delivery techniques with novel molecularly selective agents. Mayo Clin Proc. 91 (4), 522-533 (2016).
- Standring, S. The anatomical basis of clinical practice. , Elsevier Churchill. Edinburg. (2005).
- Fischer, G., et al. Direct injection into the dorsal root ganglion: technical, behavioral, and histological observations. J Neurosci Methods. 199 (1), 43-55 (2011).
- Zhao, X., et al. A long noncoding RNA contributes to neuropathic pain by silencing Kcna2 in primary afferent neurons. Nat Neurosci. 16 (8), 1024-1031 (2013).
- Xu, Y., Gu, Y., Wu, P., Li, G. W., Huang, L. Y. M. Efficiencies of transgene expression in nociceptive neurons through different routes of delivery of adeno-associated viral vectors. Hum Gene Ther. 14 (9), 897-906 (2003).
- Puljak, L., Kojundzic, S. L., Hogan, Q. H., Sapunar, D. Targeted delivery of pharmacological agents into rat dorsal root ganglion. J Neurosci Methods. 177 (2), 397-402 (2009).
- Mason, M. R. J., et al. Comparison of AAV serotypes for gene delivery to dorsal root ganglion neurons. Mol Ther. 18 (4), 715-724 (2010).
- Jelicic Kadic, A., Boric, M., Kostic, S., Sapunar, D., Puljak, L. The effects of intraganglionic injection of calcium/calmodulin-dependent protein kinase II inhibitors on pain-related behavior in diabetic neuropathy. Neurosci. 256, 302-308 (2014).
- Greenberg, M. S. Handbook of neurosurgery. , Thieme. (2010).
- Yu, H., Fischer, G., Hogan, Q. H. AAV-mediated gene transfer to dorsal root ganglion. Methods Mol Biol. 1382, 251 (2016).
- Yaksh, T. L., et al. Pharmacology and toxicology of chronically infused epidural clonidine HCL in dogs. Toxicol Sci. 23 (3), 319-335 (1994).
- Federici, T., et al. Surgical technique for spinal cord delivery of therapies: demonstration of procedure in gottingen minipigs. J Vis Exp. (70), e4371 (2012).
- Lee, J. H. T., et al. A novel porcine model of traumatic thoracic spinal cord injury. J Neurotrauma. 30 (3), 142-159 (2013).
- Raore, B., et al. Cervical multilevel intraspinal stem cell therapy: assessment of surgical risks in Gottingen minipigs. Spine. 36 (3), e164 (2011).
- Riley, J., et al. Intraspinal stem cell transplantation in amyotrophic lateral sclerosis: A phase I safety trial, technical note, and lumbar safety outcomes. Neurosurg. 71 (2), 405-416 (2012).
- Olmarker, K., Holm, S., Rosenqvist, A., Rydevik, B. Experimental nerve root compression. A model of acute, graded compression of the porcine cauda equina and an analysis of neural and vascular anatomy. Spine. 16 (1), 61-69 (1991).
- Bobo, R. H., et al. Convection-enhanced delivery of macromolecules in the brain. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 91 (6), 2076-2080 (1994).
- Lonser, R. R., Sarntinoranont, M., Morrison, P. F., Oldfield, E. H. Convection-enhanced delivery to the central nervous system. J Neurosurg. 122 (3), 697-706 (2015).
- Shen, J., Wang, H. Y., Chen, J. Y., Liang, B. L. Morphologic analysis of normal human lumbar dorsal root ganglion by 3D MR imaging. AJNR Am J Neuroradiol. 27 (0195–6108 (Print)), 2098-2103 (2006).
- Pleticha, J., et al. Minimally invasive convection-enhanced delivery of biologics into dorsal root ganglia: validation in the pig model and prospective modeling in humans. J Neurosurg. 121 (4), 851-858 (2014).
