Summary
이 프로토콜에서는 조직 문화 supernatants 자극된 마우스 splenocytes 다중 구슬 기반된 immunoassay 플랫폼 및 교류 cytometer 사용 하 여에서 수집에 동시에 여러 cytokine 목표의 정량화를 설명 합니다.
Abstract
비드 기반 immunoassays 샌드위치 immunoassays로 동일한 기본 원칙을 사용합니다. 구슬, 크기와 내부 allophycocyanin (APC) 형광 강도 의해 분화 될 수 있다, 항 체는 특정 분석에 활용 된 캡처. 다음, 정의 된 캡처 구슬 세트의 선택한 패널 캡처 항 체를 특정 대상 analytes를 포함 하는 생물 학적 샘플 알을 품는. 칵테일는 biotinylated 탐지 항 체에 추가, 캡처 구슬-분석-탐지 항 체 샌드위치의 형성에 이르게 합니다.
마지막으로, streptavidin phycoerythrin (SA-PE) 추가 됩니다, biotinylated 탐지 항 체, 바운드 분석의 금액에 비례하여 형광 신호 강도 제공 하는 바인딩. PE는 형광 분석 관련 구슬 영역의 신호 cytometry를 사용 하 여 계량은 및 특정 analytes의 농도 데이터 분석 소프트웨어와 분석 결과에서 생성 된 표준 곡선을 사용 하 여 결정 됩니다.
이 실험에서 사용 마우스 T 도우미 cytokine 패널 마우스 splenocytes 다양 한 물질로 조건 하에서 경작된에서 수집 하는 조직 문화 supernatants의 13 별도 cytokine 대상 들의 농도 동시에 계량 합니다.
Introduction
그들의 역할에서 녹는 신호 분자, cytokines 높게 조정 하 고 multifactorial 프로세스 호스트 면역학 응답을 제어 하는 중재. 그들은 해상도, 개시에서 선 동적인 과정의 모든 단계 동안 표명 하 고 그들의 자신의 합성과 그들의 세포질 수용 체1의 포함 하는 복잡 한 상호 작용 네트워크 규제. 이 통신 네트워크는 개별 구성 요소 간에 존재할 수 있는 시너지 또는 대립 관계를 넘어 복잡 계층입니다. 실제로, 많은 cytokines 공유 중복 또는 적어도 부분적으로 겹치는 기능2,3으로 알려져 있습니다.
동시에 여러 cytokine analytes 계량 통합된 시스템 생물학 접근 현재이 여러 질병을 기본 면역 응답을 통합 하는 독특한 cytokinomes의 점점 더 포괄적인 이해를 제공 하는 4,5상태. 이러한 질병 상태에 이르기까지 일반적인된 염증 암, 신경 퇴행 성 조건, 및 심혈 관 질환6,7,,89.
이러한 사이토카인 네트워크 LEGENDplex 구슬 기반 immunoassays를 사용 하 여 효과적으로 심문 수 있습니다. 이 분석 실험 Enzyme-Linked Immunosorbent 분석 결과 (ELISA), 샌드위치와 같은 원리에 기반 하 고 covalently 그들의 표면에 부착 된 캡처 항 체와 형광 인코딩된 스피어를 사용 합니다. 이 항 체는 전통적인 ELISA 형식으로 필요한 것 보다 훨씬 더 작은 표면 영역에 움직일 수 있습니다. 이 같은 분석 실험을 훨씬 적은 샘플 볼륨으로 동시에 여러 analytes의 분석 다중화 일반적인 바인딩 및 제공 하는 동안 수행할 수 있습니다.
이 프로토콜에서 설명 하는 분석 결과 13 목표까지 동시에 quantitate에이 기술을 활용 합니다. 이 분석 결과에서 데이터 다양 한 일반적으로 사용 가능한 흐름 cytometers 사용 하 여 얻어질 수 있다 고 다른 사용 가능한 분석 실험과 달리 전용된 분석 결과 특정 장비를 사용 하 여를 필요 하지 않습니다. 유효한 분석 패널의 확대 카탈로그,이 분석 실험 몇 가지 지속적인 생물 의학 연구 프로젝트10,11,,1213에 사용 되었습니다.
용이성 및 유틸리티 분석 결과 형식 마우스 도우미 cytokine 패널 quantitate를 사용 하 여이 실험의 13 마우스 splenocytes 다중 아래 양식에서 얻은 조직 문화 supernatants에서 사이토카인 농도 분리 물질로 조건입니다. 조직 문화 supernatants 이외에이 분석 결과 또한 수행할 수 있습니다 혈 청 또는 혈장 샘플을 사용 하 여.
Protocol
모든 동물 실험 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 가이드에 포함 된 NIH 권장 사항에 따라 수행 하 고 BioLegend에 IACUC에 의해 승인 했다.
그림 1: 필터 플레이트 분석 결과 절차 요약. 필터 플레이트를 사용 하 여 분석 결과 수행 하기 위한 프로토콜 분석 결과 주요 구성 요소와 인큐베이션 단계를 묘사한 다이어그램으로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
1. 생물학 견본 준비
참고: 선택한 해 부 사이트와 혈액 컬렉션의 볼륨은 각 개별 수 사관의 재량에 왼쪽과 분석 결과의 결과는 영향을 미치지 것입니다. 그러나, 그들은 얻을 수 있습니다, 일단 샘플 처리 아래에 나열 된 단계에 따라.
- 혈 청 샘플의 준비
- 원하는 양의 기본 컬렉션 튜브에 혈액을 수집 하 고 적어도 30 분에 대 한 응고
- 샘플 실 온에서 1000 x g에서 10 분 원심.
- 폴 리 프로필 렌 microcentrifuge 튜브로 혈 청 및 분석 결과 즉시 또는 약 수를 제거 하 고 저장에서 샘플 ≤-20 ° c.
- 플라즈마 샘플 준비
- 혈액 ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)를 사용 하 여 원하는 양의 혈액 컬렉션 튜브를 코팅 하는 수집.
- 컬렉션의 실내 온도 30 분 이내에 1000 x g에서 10 분 원심 분리기.
- 폴 리 프로필 렌 microcentrifuge 튜브로 플라즈마와 분석 결과 즉시, 또는 약 수를 제거 하 고 저장에서 샘플 ≤-20 ° c.
- 조직 문화 표면에 뜨는 샘플의 준비
- 샘플 셀 및 파편 제거 하 4 ° C에서 1500 x g에서 10 분 원심.
- 폴 리 프로필 렌 microcentrifuge 튜브로 상쾌한 및 분석 결과 즉시 또는 약 수를 수집 하 고 저장 ≤-20 ° c.
- 녹고 냉동 생물 샘플의
- 완전히 녹여 얼음, 그리고 사용의 앞에 짧게 소용돌이에 모든 이전 냉동된 생물 학적 샘플. 2 개 이상의 동결/해 동 주기를 방지.
참고:이 프로토콜에 사용 되는 샘플 BALB/c 마우스 splenocytes를 경작 하 여 얻은 했다 (37 ° C + 5% CO 2 다양 한 조건에서 1 x 10 6 셀: unstimulated, LPS (100 ng/mL), αCD3 (1 µ g/mL 플레이트 코팅) + αCD28 (1 µ g/mL 녹는), PMA (20 ng/mL) + Ionomycin (500 ng/mL). 문화 supernatants 48 h 후 수집 된 고 1.3 섹션에서 설명한 대로.
- 완전히 녹여 얼음, 그리고 사용의 앞에 짧게 소용돌이에 모든 이전 냉동된 생물 학적 샘플. 2 개 이상의 동결/해 동 주기를 방지.
2. 시 약 준비
- Preparation of Pre-mixed Antibody-Immobilized 구슬
- Sonicate 미리 혼합된 구슬 병 실 온에 30 s 이전 사용에 대 한 다음 소용돌이 sonicator 목욕에서 1 분. Sonicator 목욕을 사용할 수 있는 경우와 동 시간 1 분을 증가
- 준비의 워시 버퍼
- 가져와 20 x 워시 버퍼 (1 %20 x PBS 트윈-20) 실내 온도와 솔루션으로 모든 염 려 소용돌이 키트와 함께 제공 된.
- 475 mL 이온된 물으로 워시 버퍼 x 20의 25 mL를 희석. 2 ° C와 1 달까지를 위한 8 ° C 사이 저장소 사용 하지 않는 부분.
- 매트릭스 B 준비 (사용을 위해 혈 청 및 혈장 샘플만)
- 분석 결과 버퍼 (1 %BSA PBS)의 완전 한 reconst에 대 한 동결 건조 된 매트릭스 B. 허용 최소 15 분을 포함 하는 병을 키트에 포함 된 5.0 mL를 추가 itution, 다음 잘 섞어 소용돌이 남은 재구성된 매트릭스 B에 저장 될 수 있다 ≤-70 ° C 까지의 한 달.
3. 표준 준비
참고:이 패널에서 각 분석은 10000 pg/mL의 최고 표준 농도.
- . 짧게 vortexing에 의해 혼합 고 10 분 동안 실내 온도에 앉아 유리병
4. 샘플 희석
참고:이 분석 결과 사용 하 여 여러 희석과 예비 파일럿 실험 생물 샘플의 특정 집합에 대 한 가장 적절 한 희석 비율을 결정 하는 데 필요한 수 있습니다. 적절 한 희석 요소 농도 계산 샘플에 대 한 표준 곡선의 범위 내에서 거짓말을 생산할 예정 이다. 다음 단계 지침으로 의미 되 고 샘플 유형에 따라 실험적으로 결정 되어야 할 수 있습니다.
- Dilute 혈 청 또는 플라스마 2-fold 샘플 분석 결과 버퍼 (예. 50 µ L의 샘플 분석 결과 버퍼의 50 µ L로 희석) microcentrifuge 폴 리 프로필 렌 튜브에.
참고: 추가 샘플 희석 해야 하는 경우 희석 할 수 매트릭스 b 정확 하 게 측정 하도록 분석 결과 버퍼 대신. 희석 하지 않고 추가 혈 청 또는 혈장 샘플 분석 결과 낮은 정확도 되며 필터 플레이트를 방해할 수 있습니다. 매트릭스 B는 풀링된 마우스 혈 청 내 생 분석 결과 대상의 고갈로 구성 됩니다. 그것 immunoassays의 영향 분석 감도에 알려져 있습니다 매트릭스 효과 피하기 위해 혈 청 또는 혈장 샘플 희석제로 사용 됩니다. - 테스트 셀 희석 하지 않고 문화 표면에 뜨는 샘플.
참고: 분석의 수준 샘플 샘플에서 크게 달라질 수 있습니다. 필요한 경우 해당 세포 배양 매체 또는 분석 결과 버퍼의 신선한 준비를 사용 하 여 표면에 뜨는 샘플 희석.
5. 시험의 절차
참고: 폴 리 프로필 렌 필터, 마이크로 FACS 튜브, 또는 V 아래 microplates에서 분석 결과 수행할 수 있습니다. 필터 플레이트 분석 결과 절차 일관성, 분석 결과 견고성 및 취급의 용이성 때문에 좋은 샘플 샘플 좋습니다. 이 절차 (최종 사용자가 제공)에 진공 여과 장치를 필요로.
- 따뜻한 실내 온도 (20-25 ° C) 모든 시 약을 사용 하기 전에 허용.
- 거꾸로 플레이트 커버에 필터 플레이트 항상 분석 결과 설치 및 인큐베이션 단계는 플레이트의 하단 만지지 않는다 어떤 표면 든 지 그것은 누수를 일으킬 수 있도록 세트.
- 구슬 유실을 방지 세척 단계를 포함 하 여 전체 분석 결과 절차 동안 접시를 똑바로 유지.
- 어두운 또는 모든 인큐베이션 단계에 대 한 알루미늄 호 일 포장에 접시를 유지.
- 순차적 순서로 접시에 배열 하는 중복으로 모든 표준 및 샘플을 실행.
- 미리 각 우물에 워시 버퍼 x 1의 100 µ L을 추가 하 여 필터 플레이트를 젖은 및 (해당 되는 경우 사용 하는 필터-하단 microplate) 실 온에서 1 분 동안 앉아 보자.
- 진공 매니폴드 (5-10 s)를 사용 하 여 제거 버퍼 볼륨. 10을 초과 하지 마십시오 " Hg 진공의. 오 점 초과 워시 깨끗 한 종이 수건의 스택에 접시를 눌러 접시의 아래쪽에서 버퍼. 거꾸로 플레이트 커버 위에 접시를 놓습니다.
참고: V-하단 microplate 또는 마이크로 FACS 튜브를 사용 하 여 분석 결과 수행 하는 경우 생략 될 수 있습니다 단계 5.1-5.2. - 셀 문화 표면에 뜨는 샘플에 대 한 추가 분석 결과 버퍼의 25 µ L 모든 우물. 표준 우물에 각 표준의 25 µ L를 추가 합니다. 각 샘플의 25 µ L 샘플 우물을 추가.
- 혈 청 또는 혈장 샘플을 측정, 표준 우물을 행렬 B의 25 µ L을 추가. 샘플 우물에 분석 결과 버퍼의 25 µ L를 추가 합니다. 표준 우물에 각 표준의 25 µ L를 추가 합니다. 각 희석된 혈 청 또는 혈장 샘플의 25 µ L 샘플 우물을 추가.
- 소용돌이 구슬 구슬 정착 하지 않으려면 일시적으로 구슬 병을 흔들어 각 잘 혼합된 구슬의 30 s. 추가 25 µ L에 대 한 혼합. 마지막 볼륨 구슬의 추가 후 75 µ L에 각 잘 되어야 합니다.
- 접시 마감재와 접시를 봉인. 거꾸로 플레이트 커버, 알루미늄 호 일을 포함 하 여 전체 접시를 바꿈. 판 통에 접시를 놓고, 보안 및 실 온에서 2 h에 대 한 약 500 rpm에서 흔들어. 누수를 방지 하려면에 적용 되지 않는 긍정적인 압력 판 마감재.
- 반전, 없이 접시에 진공 매니폴드 및 이전과 진공을 적용 놓고 각 잘 워시 버퍼 x 1의 200 µ L 추가.
- 진공 여과 분석 결과 격판덮개 우물의 내용을 제거합니다. 오 점 흡수 성 패드 또는 종이 수건을 가진 격판덮개의 바닥에서 과잉 워시 버퍼. 이 단계를 한 번 더 반복.
참고: 분석 결과 수행 하는 경우 건너뛰기 단계 5.12 및 5.13 튜브 V 하단 microplate 또는 마이크로 FACS를 사용 하 여 합니다. 대신 실 온에서 5 분 동안 1000 x g에서 격판덮개 원심 다음 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 상쾌한 제거. - 탐지 항 체 (재료의 표 참조)를 각 잘의 추가 25 µ L.
- 신선한 플레이트 마감재와 접시를 봉인. 거꾸로 플레이트 커버, 알루미늄 호 일을 포함 하 여 전체 접시 포장.
- 판 통에 접시를 놓고 실 온에서 1 시간에 약 500 rpm 동요.
- 진공 청소기, 없이 각 우물에 직접 25 µ L SA PE 시 약의 추가. 없음 희석 시 약의 필요 하다.
- 신선한 플레이트 마감재와 접시를 봉인. 거꾸로 플레이트 커버, 알루미늄 호 일을 포함 하 여 전체 접시 포장.
- 판 통에 접시를 놓고 실 온에서 30 분 동안 약 500 rpm 동요.
- 반복 단계 위의 5.13.
- 워시 버퍼 각 x 1의 추가 200 µ L 음. 다시 1 분에 대 한 접시 통에 구슬 중단
- 샘플을 필터 플레이트에서 교류 cytometer에 샘플을 읽을 FACS 튜브 전송 다채널 피펫으로 사용 하 여,.
참고: 샘플 볼륨 증가 200 µ L에서 300 µ L에 건조를 실행 하는 샘플을 피하기 위해 각 튜브를 워시 버퍼 x 1의 추가 100 µ L을 추가 하 여. 필요한 샘플에 저장 될 수 있습니다 4 ° C 빛에서 보호 하 고 다음 날 분석. 그러나, 장기간된 샘플 저장 감소 된 신호를 발생할 수 있습니다.
6. Flow Cytometer 설정
참고: 신뢰할 수 있는 데이터를 생성 하기 위해 교류 cytometer 설정 해야 합니다 제대로 데이터 수집 전에. 이 과정에 일부 분석 결과에 수행 하는 특정 악기의 구성에 따라 개별 사용자에 대 한 달라질 수 있습니다. PE와 APC를 측정할 수 및 둘 다 갖춘 cytometer에 대 한 일반적인된 설치 과정 488 고 633 nm 레이저 아래 설명.
- 흐름 cytometer 및 수집 소프트웨어는 제조 업체에 따라 시동 ' 악기와 함께 제공 된 s 지침.
- 만들기 점 x 축 및 y 축에 대 한 SSC (사이드 분산형) FSC (앞으로 분산형)와 음모. FSC 그리고 SSC를 선형 모드로 설정.
- Y 축 x 축과 APC에 PE와 함께 두 번째 점 음모를 만듭니다. 이 음모는 로그 기반 디스플레이 모드를 설정 해야 합니다.
- 소용돌이 30 키트에 포함 된 원시 구슬의 유리병 다시 구슬을 일시 중단 하는 s. 이 구슬 내부 APC 염료를 포함 하 고 두 크기 인구의 구성.
- 새 FACS 튜브를 원시 구슬의 전송 400 µ L.
- 낮은 교류 cytometer 유량 설정.
- 원시 구슬, 신중 하 게 조정 이득 및 전압 FSC 그리고 SSC는이 구슬의 크기 인구 두 가시 분리 하 고 게이트를 쉽게 실행.
- 원치 않는 이벤트 (예: 파편 또는 공기 거품)를 제외 하는 FSC 임계값 조정.
- SSC 대 FSC에 음모, 그리는 모든 비드 인구를 포함 하는 문.
참고: 원시 구슬 포함 구슬의 두 개의 크기 인구 더 작은 "는 구슬 " 및 큰 " B 구슬 " 지역. - Y 축 x 축과 APC에 PE와 함께 두 번째 점 플롯에 FSC 대 SSC 줄거리에서 문이 비드 인구 표시.
- 송출 신호 모든 인구를 구슬에 1 x 10 1와 5 x 10 3 사이 중간 형광 강도 (MFI) APC 형광 채널 PMT 전압 조정.
- 소용돌이 PE 설치의 유리병 30 비즈 구슬 다시 중단 s.
- 새 FACS 관에 PE의 전송 400 µ L 비즈.
- 바꾸기 원시 구슬 PE와 교류 cytometer에서 튜브 튜브 비즈.
- PE 구슬 유리병에 표시는 PE 형광 채널 설정 있도록 PE 구슬의 MFI 폭포 발견 많은 특정 범위 사이의 광 전 증폭 관 관 (PMT) 전압 조정.
참고: PE 설치 구슬 포함 한 인구 크기의 구슬 ("는 구슬 "만).
7. 데이터 수집
참고: 특정된 악기에 대 한 데이터의 수집와 관련 된 정확한 절차 다를 수 있습니다 고는 cytometer에 ' s 구성 사양 및 사용 하는 인터페이스 소프트웨어. 아래의 지침 따라서 cytometer 분석 결과 관계 없이 분석 결과에 주의가 필요한 단계를 강조 하기 위한 것.
- Cytometer 유량 설정 아직 확인을.
- 약 300 실정이 획득 구슬 이벤트의 수를 설정 합니다. 13-플렉스에 대 한이 3900 이벤트 습득에 상당 하는 패널 두 구슬 크기 인구 (A + B 구슬)에서 결합.
- 소용돌이 5 각 샘플 분석 하기 전에 s.
- 읽기 샘플입니다. 샘플을 읽을 때 먼저 교류 cytometer 설치 모드를 설정 하 고 비드 인구 수집 모드로 전환 하기 전에 안정화 될 때까지 기다립니다.
- 간단한 이름을 데이터 파일에 대 한 연속 번호와 함께 사용 하 여 데이터 분석을 용이 하 게.
- 총 이벤트 보다 (A + B 구슬 지역) 문이 이벤트만 내보냅니다.
- 각 분석 결과 대 한 동일한 폴더에 모든 FCS 파일을 저장합니다. 여러 분석 실험을 실행 하는 경우 각 분석 결과 대 한 별도 폴더를 만듭니다.
참고: 교류 cytometer에서 생성 되는 FCS 파일 다운로드 받을 수 있는 무료 14 데이터 분석 소프트웨어를 사용 하 여 분석 해야 합니다.
- 데이터 분석 소프트웨어는 PC에 설치.
- 분석 소프트웨어를 포함 하는 컴퓨터에 모든 시험 FCS 파일 전송.
- 컴퓨터의 USB 포트에 꽂습니다 (키트에 포함) 라이센스 키 동글.
- 데이터 분석 소프트웨어 출시.
- 파란색을 클릭 " 파일 추가 " 버튼 화면의 상단에 있는.
- 팝업 표시 되는 창에에서 분석 결과에서 FCS 파일이 들어 있는 폴더를 탐색.
- 클릭 소프트웨어 디스플레이 팝업 창에서에서 모든 분석 결과 FCS 파일을 드래그. 모든 파일을 목록에 이제 나타납니다.
- 클릭 녹색 " 다음 " 디스플레이의 오른쪽 하단에 있는 버튼. 작은 드래그를 누르고 클릭 블루 표준 곡선 표준 곡선을 정의 하 고 목록에서 해당 FCS 파일 (C0에 C7) 버튼.
- 녹색을 클릭 " 다음 " 제어 팝업 창이 열 디스플레이의 오른쪽 하단에 버튼.
- 제어 윈도우의 왼쪽에 A의 이름을 입력 하 고 B 비드 지역 분석 결과 분석 대상과 (분석 결과 함께 제공 된 설명서에서 발견 되는) 그들의 관련 된 비드 ID 오름차순.
- 팝업 창 상단에서 제어 도구를 선택 하 고 금감위 대 SSC 음모에 2 문, A 구슬 주위 1와 B 구슬 주위 그릴 사용.
- 는 APC 대 PE 점도 나타나는 FSC 대 SSC 음모 아래 표시를 검토 합니다. A 구슬 (왼쪽된 그림)에서 6 실정이 밴드와 7 실정이 밴드 B 구슬 (오른쪽 그림)에 있을 것입니다.
참고: 게이츠 상단에 지우개 도구를 선택 하 고 주어진된 문 삭제를 클릭 하 여 수동으로 다시 수 있습니다. 제어 도구 수 있습니다 다음 선택 하 고 수동으로 원하는 밴드 영역에는 게이트를 적용 하는 데 사용. - 녹색을 클릭 " 확인 " 버튼 제어 팝업 창 닫고 FCS 파일의 목록으로 돌아갑니다.
- 정의 오른쪽 클릭 하면 지정 된 파일을, 선택 하 여 생물 학적 샘플으로 만들어진 모든 희석 " 희석 배 " 메뉴를 입력 올바른 값.
- 녹색을 클릭 " 실행 " 분석 결과 대 한 표준 곡선을 생성 하 고 알 수 없는 생물학 샘플의 농도 계산 하는 디스플레이의 오른쪽 하단에 버튼.
Representative Results
이 프로토콜은 동시에 교류 cytometer를 사용 하 여 생물 학적 샘플에서 cytokine 프로필을 quantitate 하 immunoassay 구슬-기반 플랫폼을 사용 하는 방법을 보여 줍니다. 이 예제에서 사용 하는 생물 학적 샘플 분석 결과 형식 또한 혈 청 또는 혈장 샘플 사용에 대 한 검증 된 있지만 셀 문화 supernatants 했다 이전 다양 한 활성화 조건에서 알을 품는 마우스 splenocytes에서 했다.
분석 결과에서 생성 된 데이터는 멀티플렉스 패널에 모든 analytes에 대 한 표준 곡선을 생성 하는 데 사용 됩니다. 데이터 분석 소프트웨어 각 특정 분석 독특한 구슬 크기와 APC 강도에 따라 분류 하 고 체육 기자를 사용 하 여 그들을 단정. 그림 2A에서 로그-로그 규모에 때 분석 결과의 감도 서 동적 범위는 설명 했다. 소프트웨어 분석 결과 데이터를 사용 하 여 및를 정확히 계산 하는 사용자에 analytes의 농도 뿐만 아니라 5 매개 변수 곡선 맞춤 알고리즘 제공 모든 표준 곡선 (표 1의 높고 낮은 끝에 생물 학적 샘플 뿐만 아니라 탐지의 한계 ). 이 프로토콜에서 설명 하는 형식 또한 매우 강력한 분석 결과 정밀도를 제공 합니다. 그림 2B 와 2c 에서 데이터의 각 분석 내부 분석 결과 다양성 묘사 되 게 됩니다. 두 개의 별도 표준 단백질 농도 (높거나 낮은) 한 분석 결과 각 샘플에 대 한 16 복제에에서 분석 되었다. 그림 2C 와 2D 3 개의 독립적인 분석 실험에서 대상 analytes 간 분석 결과 변화를 나타냅니다. 내부 분석 결과 정밀 실험과 높고 낮은 표준 농도 3 분석 했다 독립적인 실험의 각 복제 합니다. 대상 단백질의 계산 된 농도에서 최소한의 변화 명확 하 게 표시 됩니다.
Cytokine 식 프로필 질문에서 구슬 기반 cytometric 분석 유틸리티를 보여 주기 위해 마우스 splenocytes 다양 한 활성화 조건 하에서 인 큐베이 팅 했다. Unstimulated 컨트롤 뿐만 아니라 셀 LPS, 안티-CD3/안티-CD28 항 체 또는 phorbol myristate 12 13-아세테이트와 ionomycin incubated도 했다. 셀 문화 supernatants 48 h 나중 및 마우스 도우미 cytokine 패널을 사용 하 여 분석을 수집 했다. 이 실험에서 정량화 결과 그림 3 에 표시 되 고 사이토카인 농도에 자극의 효과 명확 하 게 delineated.
위에서 설명한 결과 실험 좋은 실험실 기술을 하 고 제공 된 분석 결과 프로토콜을 다음과 같이 전형적, 이다. 이 분석 결과 형식 오류의 소스 샘플을 분석 하는 데 사용 하는 교류 cytometer에서 보육 시간, 시 약 볼륨, 세척, 편차 또는 부적 절 한 PMT 설정에서 발생할 수 있습니다. 그림 4A 분산형 플롯 성공적인 분석 결과에서 명확 하 게 정의 된 2 가지 구슬 인구를 보여줍니다. 이 그림 4B, 어디 가난한 세척 및 프로토콜 준수 이끌어 두 개의 인구 블러 비드 집계에 대조 될 수 있다. 또한, 낮은 왼쪽된 사분면에서 파편에 의해 입증, 총 cytometer 이벤트 분석 보다는 문이 이벤트만의 기본 형식에 대 한 수출 되었다. 적절 한 cytometer 설정 신뢰할 수 있는 데이터를 생성 하는이 분석 결과에 중요 하다. APC 분류 채널에서 6 analytes의 각각의 해상도 그림 4C 적절 한 PMT 설정을 사용 하 고. 부적 절 한 PMT 설정 비슷한 그림 4D 어디 송출 채널은 겹치는 분류 농도와 구슬 인구에에서 제공 된 데이터에서 발생 합니다. 분석 농도 분석 결과 구슬의 명확 하 게 정의 된 인구 없이 계산 가능한 것이 분석 결과 무효화 됩니다.
그림 2: 표준 곡선 범위와 분석 결과 정밀도. (A)는 대표적인 표준 곡선 마우스 도우미 cytokine 패널을 사용 하 여 생성. 표준 곡선 각 분석 결과 함께 실행 되어야 합니다. (B-C) 내부 분석 결과 정밀도입니다. (높고 낮음) 대상 단백질의 다른 농도 함께 두 개의 샘플은 각 샘플에 대 한 16 복제 한 분석 결과에 분석 되었다. 데이터는 평균 + 표준 편차로 표시 됩니다. (D-E) 간 분석 결과 전체 자릿수입니다. 대상 단백질 (높고 낮음)의 다른 농도 함께 두 개의 샘플은 각 샘플에 대 한 3 복제와 3 개의 독립적인 분석에 분석 되었다. 데이터는 평균 + 표준 편차로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 대표 결과의 정량화. 마우스 splenocytes (1 x 106 셀) 37 ° C + 5% CO2 다양 한 조건 하에서 경작 했다: unstimulated, LPS (100 ng/mL), αCD3 (1 µ g/mL 플레이트 코팅) + αCD28 (1 µ g/mL 녹는), PMA (20 ng/mL) + Ionomycin (500 ng/mL). 문화 supernatants 48 h 후 수집 된 다음 마우스 도우미 cytokine 패널을 사용 하 여 계량 합니다. 차동 cytokine 식 프로필 자극 조건에서 명확 하 게 볼 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 실패 분석 실험 대 성공에서 유래한 다. (A) 성공적인 분석 스피어 인구에 대 한 뚜렷한 비드 인구 있을 것 이다. (B) 가난한 인구의 분리, 비드 집계 및 너무 많은 수집된 이벤트 실패 분석 할 것 이다. (C) 성공적인 분석은 명확 하 게 정의 농도 게이트, 계량 하기 쉬운 분류 형광 채널에서. (D) 실패 분석은 제대로 분리 및 정량화를 어렵게 만드는 여러 구슬 인구 중복 분류 농도. 이러한 오류 분석 결과 프로토콜에 주의 깊은 부착을 통해 피할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 표준 곡선 | 감도 (pg/mL) | ||||
| 실정이 | 맞춤된 수식 | 이력서 | R2 | 분입니다. | 최대입니다. |
| IFN-Γ | 5-P.log(4.43, 14.40, 0.54, 9.11, 0.01) | 1.77% | 0.99 | 2.1 | 18105.0 |
| IL-5 | 5-P.log(4.36, 12.68, 0.64, 5.73, 0.36) | 1.32% | 1 | 1.9 | 14514.0 |
| TNF-Α | 5-P.log(4.36, 11.63, 0.79, 5.45, 0.37) | 1.48% | 0.99 | 1.9 | 20109.0 |
| 일리노이-2 | 5-P.log(4.46, 12.62, 0.78, 5.07, 0.34) | 1.34% | 1 | 1.9 | 25109.0 |
| 일리노이-6 | 5-P.log(4.58, 11.66, 0.64, 5.77, 0.37) | ||||
표 1: 표준 곡선 피팅 및 분석 결과 감도. 데이터 분석 소프트웨어는 다중 분석 결과에 포함 된 모든 analytes에 대 한 표준 곡선을 생성 하기 위해 사용 되었다. 이 완전 자동화 된 분석 분석 결과에서 희석 시리즈 표준 알고리즘을 피팅 강력한 5 매개 변수 곡선을 적용 하 고 또한 분석 결과 감도 검색의 이론적인 한계를 사용 하 여 정의 하는 데 사용 했다.
Discussion
실험을 제공 하는 생물 학적 샘플 프로 파일 녹는 중재자의 강력한 정량화는 좋은 실험실 기술 및 권장된 프로토콜에 부합이 프로토콜에서 설명 하는 분석 결과 형식을 제공할 수 있습니다.
신뢰할 수 있는 결과 보장 하기 위하여 따라야 하는 몇 가지 주요 단계가 있습니다. 첫째, 재조합 형 기준 분석 결과 버퍼 권장, 풀 타임에만 폴 리 프로필 렌 튜브에 희석 후 다시 구성할 허용 되어야 합니다. 폴리스 티 렌 튜브는 표준 곡선을 생성할 때 낮은 신호를 이어질 수 있는 튜브의 벽에는 단백질의 준수를 홍보할 수 있습니다. 둘째, 적절 한 인큐베이션 단계 동안 떨고 하는 것이 중요 합니다. 적절 한 동요 없이 분석 결과 구슬의 바인딩 특성은 심각 하 게 방해 될 수 있습니다. 또한, 인큐베이션 단계 사이의 적절 한 세척 필요 이기도합니다. 실험 프로토콜에는 다음 단계를 시작 하기 전에 우물에서 초과 시 약 제거 됩니다 확인 해야 합니다. 분석 결과 구슬 심문 하는 데 사용 하는 교류 cytometer 악기 설정 또한 낙관 되어야 한다. 특히, PMT 설정은 적절 한 비드 분리 하 고 표준 곡선에 대 한 광범위 한 동적 범위를 조정 해야 합니다. 마지막으로,는 cytometer에 분석 되 고, 직전 구슬 vortexed 적절 한 정지를 보장 하 고 집계 결과 왜곡 수는의 형성을 피하기 위해 해야 합니다.
이 프로토콜 연구원은 크고, 전체 격판덮개 분석 실험을 수행 하기 전에 그들의 세포의 용 해 프로토콜을 최적화 하고자 제공이 원고에서 설명 하는 샘플 형식으로 조직 homogenates 분석 하 잠재적으로 수정할 수 있습니다. 실제 기술 과정에 따라 달라질 수 조직 유형; 그러나, 일반적으로 프로토콜 중립 pH 버퍼 이오니아 소금의 생리 적 농도, 아니 변성 화학 물질, 그리고 가급적 이면 아무 세제 사용 해야 합니다. 세제를 사용 해야 하는 경우 비 이온 세제 농도 최소 (예: 더 이상 1%)에서 유지 되어야 한다. 버퍼 또한 대상 단백질의 분해 성능 저하를 방지 하기 위해 충분 한 protease 억제제를 포함 해야 합니다. 사용 되는 세포의 용 해 프로토콜에 최종 준비 분석 전에 미 립 자 제거를 centrifuged 한다.
분석 결과 제한에 관한 생물 학적 샘플 유형에서 분석 대상의 농도 크게 달라질 수 있습니다. 제대로 계량 분석 농도, 하기 위해서는 그들이 표준 곡선에 대 한 위쪽 및 아래쪽 값에를을 해야 합니다. 곡선의 값의 추정은 반드시 신뢰할 수 고 하지 것이 좋습니다. 조사자는 따라서 풀 플레이트 분석 결과 실행 하기 전에 파일럿 실험에 그들의 특정 샘플의 희석을 최적화 해야 합니다. 또한, 수 분석을 생물 학적 샘플의 주의 준비는이 분석 결과의 성공에 있어서 최우선 이다. Lipemic, hemolyzed, 또는 단백질 파편을 포함 하는 샘플이이 immunoassay의 핵심 원칙을 정의 하는 항 원 항 체 상호 작용에 영향을 미칠 하 고 해석할 수 있는 결과 렌더링.
이 분석 여러 가지 이유로 기존의 정량화 방법에 관하여 중요 하다. 제대로 실행 될 때 시험 형식 전통적인 ELISA 분석 실험을 사용 하 여 샘플을 분석 하는 데 필요한 것 보다 훨씬 작은 볼륨을 사용 하 여 샘플에서 최대 13 analytes를 quantitate 수 있습니다. 이 분석 결과 형식은 또한 수행 하려면 전용된 장비를 필요 하지 않습니다. 이것은 일반적으로 사용 되는 교류 cytometers의 어떤 숫자를 사용 하 여 분석 결과 실행할 수 있는 다른 상용 구슬 기반 immunoassays에 비해 이점이 다.
역할에 과학적 탐구 분 비 요소와 cytokine 네트워크 건강에서 하 고 질병 확대. 분석 결과 형식이이 원고에 설명 된 이러한 다양 하 고 복잡 한 현상을 이해 하고자 하는 연구자에 대 한 유용한 도구 수 있습니다. 활성 생물 의학 연구 프로그램 뿐만 아니라 지역 같은 일반 염증6, cytokine 네트워크의 역할 뿐만 아니라 동맥 경화, 암, neuroinflammation 등 특정 질병 상태에 맥락을 탐구 하기 시작 15,,1617. 의심할 여 지 없이, 조사는 이러한 만성 질환 치료에 새로운 치료제에 대 한 검색 확장으로이 지역에서 성장 계속 됩니다. 이 질병와 관련 된 성 중재자의 정확 하 고 신뢰할 수 있는 정량화에 대 한 필요성은 중요 한 연구 우선권 유지 됩니다.
Disclosures
저자는이 원고에 설명 된 시 약을 제조 하는 BioLegend에 의해 고용 됩니다. Vigene 기술, i n c.는이 원고에 설명 된 분석에서 생성 된 데이터를 분석 하는 데 사용 되는 LEGENDplex 데이터 분석 소프트웨어를 개발 했다.
Acknowledgments
저자 바이오 마커 및 면역 분석 실험의 기여를 인정 하고자 제품 개발 팀의 분석 결과 개발. 또한, 우리는 데이터 분석 소프트웨어 패키지 설계에 그들의 공동 노력에 대 한 Vigene 기술, i n c.를 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Allegra 6R Centrifuge with MICROPLUS Carrier Adaptor | Beckman Coulter | 366816 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |
| LEGENDplex Mouse T helper Cytokine Panel | BioLegend | 740005 | Multiplex Immunoassay (13-plex) |
| Anti-mouse CD3ε antibody | BioLegend | 100314 | Clone 145-2C11, low endotoxin, azide free format |
| Anti-mouse CD28 antibody | BioLegend | 102112 | Clone 37.51, low endotoxin, azide free format |
| Vacuum Pump | EMD Millipore | WP6111560 | For LEGENDplex assays using filter plates (recommended) |
| Vacuum Manifold | EMD Millipore | MSVMHTS00 | For LEGENDplex assays using filter plates (recommended) |
| Sterile Disposable Reagent Reservoirs | Fisher Scientific | 07-200-130 | Or equivalent |
| Polypropylene MicroFACS Tubes | Fisher Scientific | 11-842-90 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |
| Pipette Kit | Fisher Scientific | 14-388-100 | Four pipette sizes (0.2-2µL, 2-20µL, 20-200µL, 100-1000µL) |
| Multi-Channel Pipette | Fisher Scientific | FA10011G | capable of dispensing 5 μL to 200 μL |
| Microplate Shaker | Fisher Scientific | 88880023 | Or equivalent |
| Microcentrifuge | Fisher Scientific | 75002410 | Or equivalent |
| FACS tubes | Fisher Scientific | NC9885747 | 12 x 75 mm round bottom |
| PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma-Aldrich | L-8274 | Escherichia coli O26:B6 |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634 | |
| Branson B200 Ultrasonic Cleaner | Sigma-Aldrich | Z305359 | Or equivalent |
| Microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z666505 | 1.5 mL polypropylene tubes |
| Flow Cytometer | Various | Various | Cytometer equipped with single laser (488nm blue) or two lasers (488nm blue or 532nm green + 633nm Red) capable of reading emission wavelengths at 575nm and 660nm |
| 96-Well Polypropylene Plate | VWR | 82050-662 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |
References
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