Summary
Este protocolo descreve um método simples para gravação simultânea de co localizada Eletroencefalografia (EEG) e multi-laminar local campo potencial em um rato anestesiado. Um orifício de trépano, perfurado o crânio para a inserção de um microeléctrodo é mostrado para produzir distorção negligenciável do sinal EEG.
Abstract
Apesar de eletroencefalografia (EEG) é amplamente utilizada como uma técnica não-invasiva para gravação de atividades neurais do cérebro, nosso entendimento sobre a neurogênese de EEG é ainda muito limitado. Potenciais de campo local (LFPs) gravados através de um microeléctrodo multi-laminar podem fornecer um relato mais detalhado da atividade neural simultânea em diferentes camadas corticais no neocórtex, mas a técnica é invasiva. Combinar medidas de EEG e LFP em um modelo pré-clínico pode extremamente aumentar a compreensão dos mecanismos neurais envolvidos na geração de sinais EEG e facilitar a derivação de um modelo matemático mais realista e biologicamente exato de EEG. Um procedimento simples para a aquisição de EEG simultâneo e co localizada e multi-laminar LFP sinais no roedor anestesiado é aqui apresentado. Também investigamos se sinais EEG foram significativamente afetados por um orifício de trépano, perfurado o crânio para a inserção de um microeléctrodo. Nossos resultados sugerem que a trepanação tem um impacto insignificante na gravações de EEG.
Introduction
É geralmente aceite que LFPs gravadas através de microeletrodos principalmente refletem a soma ponderada das atividades sinápticas excitatórias e inibitórias sincronizadas de populações locais de neural piramidal1,2,3 , 4. nossa pesquisa recente demonstrou que o perfil do sinal do LFP pode ser separado em componentes de excitação e inibição de5,6. No entanto, LFP é normalmente medido através de um procedimento invasivo, não é adequado para a maioria dos estudos do cérebro humano.
Por outro lado, o EEG é uma técnica não-invasiva para medir a atividade elétrica do cérebro. É amplamente utilizado como uma ferramenta diagnóstica para certos tipos de doenças neurológicas como a epilepsia e como uma ferramenta de pesquisa em estudos cognitivos humanos. Apesar de sua popularidade, uma grande limitação de EEG é a incapacidade de interpretar seus perfis temporais precisamente em termos do subjacente sinais neurais7,8,9.
Cada vez mais, os modelos matemáticos de EEG são desenvolvidos para melhorar a compreensão do cérebro função10,11,12,13,14,15. A maioria dos modelos existentes de EEG é desenvolvida com base na frequência domínio as características do modelo previsto de saída para o espectro de dados de EEG durante a atividade espontânea de montagem, e muito poucos modelos de EEG podem gerar potenciais evocados sensoriais realistas. Neste contexto, gravações simultâneas de EEG e LFP irão fornecer uma visão importante e restrições para o desenvolvimento de modelos matemáticos mais precisos de EEG.
Para atender a essa necessidade para gravações simultâneas explorar a origem neural do EEG, desenvolvemos uma metodologia para gravar simultaneamente EEG e multi-laminar LFP sinais no neocórtex do rato anestesiado. A instalação é semelhante de estudos anteriores de EEG/LFP simultâneos, realizados em primatas16,17. Investigamos mais o efeito de um orifício de trépano, perfurado o crânio em gravações de EEG em torno do furo, através da comparação bilaterais gravações de EEG (ou seja, um hemisfério com um orifício de trépano, o outro hemisfério intacto) na ausência de sensorial estimulação. Nossos resultados demonstram que gravações simultâneas de EEG/LFP podem efectuar-se simples e eficaz, com pouca distorção do sinal EEG da trepanação do crânio.
Protocol
Todos os experimentos foram realizados em conformidade com os regulamentos da British Home Office (ato de animais (procedimentos científicos), 1986) e aprovados pelo Comitê de ética de pesquisa na Universidade de Reading, UK.
1. preparação animal
Nota: Ratos fêmea Lister Hooded foram usados para todos os experimentos. Este é um procedimento não-sobrevivência.
- Registre o peso do rato em escala de laboratório.
- Anestesia o rato em uma câmara com isoflurano 5% e uma taxa de fluxo de oxigênio de 1 L/min.
- Coloque o rato sobre um suporte estereotáxica com um papel toalha por baixo de seu corpo e com os seus dentes descansando através da barra de mordida. A toalha de papel irá facilitar a inserção de uma almofada de calor (ver passo 2.3) e pegar qualquer excremento de rato durante o experimento.
- Administre o isoflurano continuamente através de um cone de nariz de plástico rígido montado ao grampo do nariz para o adaptador de rato em uma concentração de 3%, com uma taxa de fluxo de oxigênio de 0,5 L/min. Connect o cone para um sistema de pequenos animais isoflurano anestésico.
2. ato cirúrgico
- Inserir uma almofada de aquecimento termostática debaixo da toalha de papel em que o rato está descansando, segura a cabeça do rato com duas barras de orelha e monitorar a temperatura do corpo, usando um termômetro retal.
- Raspe a parte superior da cabeça do rato.
- Aplica a pomada oftálmica nos olhos para evitar a secura da córnea.
- Antes de expor o crânio, aplique gotas de lidocaína no couro cabeludo e massaje suavemente na pele.
- Fazer uma incisão de aproximadamente 2-3 cm no couro cabeludo usando um bisturi para expor a superfície do crânio.
- Separe com cuidado o músculo temporalis contra-lateral à almofada whisker a ser estimulado a partir do crânio utilizando um Jacquette Scaler e um par de Pinças dissecação serrilhadas e curvas. Limpe o crânio com cotonetes de algodão, sempre que necessário.
- Usando uma seda trançada, sutura não absorvível, amarre o músculo separado para o couro cabeludo com um nó apertado e depois amarrar a sutura firmemente para a armação estereotáxica18.
- Use coordenadas estereotáxicos para localizar o córtex de barril, caudal de bregma 2,5 mm e 6 mm lateral à linha média19. Desenhe um ponto no local do córtex somatossensorial, usando um lápis ou um marcador.
-
Faça um furo de rebarba no local marcado usando uma broca de dentista. Para impedir que o crânio superaquecimento durante a perfuração, aplica soro fisiológico estéril (0,9% de cloreto de sódio) para a área de trabalho cada 10-15 s. O processo de perfuração envolve 3 etapas a seguir:
- Faça um furo de < 2 mm de diâmetro no crânio usando uma broca #4 (0,055 de diâmetro). Tome cuidado para não perfurar a dura-máter.
- Fina o fundo do buraco para translucidez usando uma broca #1/4 (0,019 de diâmetro).
- Use uma agulha 27G para perfurar a dura-máter para permitir a inserção de um microeléctrodo.
- Transferi o rato, fixado em uma armação estereotáxica, para uma gaiola de Faraday, montada em cima de uma estação de trabalho de isolamento de vibração.
- Anexar uma braçadeira de sensor de oxímetro conectada a uma unidade de controle de oxímetro a pata traseira de rato para monitorar continuamente os seguintes parâmetros fisiológicos: frequência cardíaca, taxa de respiração, saturação arterial de oxigênio, distensão do pulso e distensão de respiração. Estes parâmetros foram exibidos continuamente em um monitor de PC, refletindo o estado fisiológico e anestésica profundidade do rato.
- Substituir o cone de nariz de plástico rígido para a administração de isoflurano e a pinça de nariz para adaptador de rato com um respiradouro de microflex equipado com um cone de nariz macio transparente que é modificada (figura 1A) para permitir a estimulação whisker fácil para o lado da Suiça almofada sem comprometer a administração de isoflurano.
- Inserir dois eletrodos de aço inoxidável estimulante à almofada whisker exposta o corta-circuito no nariz.
- Conecte os eletrodos de estimulação para um estimulador isolado atual.
- Levante a pele da linha média do pescoço com a pinça e fazer um 1 ~ incisão de 2 cm com uma tesoura pronta para a colocação de eletrodos de referência. Tome cuidado para não cortar o tecido muscular.
3. co-localizados EEG/LFP Setup
- Limpe e seque o crânio ao redor do orifício de trépano usando um cotonete.
- Coloque cuidadosamente a pasta condutora do EEG de um lado plano de um eletrodo de aranha de EEG. Deixe um buraco pequeno claro da pasta de EEG no eléctrodo do Aranha para permitir um microeléctrodo multi-laminar passar pelo buraco sem contato com o colar e o eléctrodo de aranha. Isso evita o contato elétrico entre o eletrodo de EEG e o microeléctrodo.
- Alinhe o eléctrodo de aranha para a trepanação do crânio, com o colar de EEG enfrentando o crânio.
- Pressione cuidadosamente o eletrodo de aranha sobre o crânio, fazendo contato firme com o crânio através do colar de EEG. Remova qualquer colar obscurecendo a trepanação utilizando uma agulha de uma seringa.
- Remova o colar de EEG excessiva além da periferia do eléctrodo aranha para que o contacto entre o eléctrodo de aranha e o crânio é espacialmente restrito ao tamanho do eletrodo (figura 1B).
Figura 1: configuração geral para gravação simultânea de EEG/LFP. (A), a instalação consiste em um cone de nariz modificado para facilidade de estimulação de almofada whisker sob anestesia de isoflurano, dois eletrodos estimulantes inseridos o whisker almofada, um eletrodo de aranha posicionado no crânio acima o barril córtex contra-lateral para os eletrodos de estimulação, um microeléctrodo multi-canal inseridos no córtex através do eletrodo de aranha e eletrodos de referência de barril colocado dentro de uma incisão na nuca do rato. (B) uma vista através do microscópio do eléctrodo aranha firmemente posicionado sobre o crânio pela pasta de EEG. O microeléctrodo é inserido em um orifício de trépano, perfurado o crânio sob o eletrodo de aranha. O couro cabeludo é retido por fio cirúrgico (sutura) amarrado na armação estereotáxica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Smear colar de EEG para o eletrodo de referência para o EEG e coloque-a firmemente dentro da incisão na nuca do rato.
- Conecte os eletrodos de EEG do pré-amplificador através de um divisor de sinal passivo para sinais de baixa impedância (Figura 2). Certifique-se que a impedância do eléctrodo aranha é inferior a 5 kΩ. Se não for, verifique que o colar de EEG está em bom contato com o crânio e o eletrodo é firmemente pressionado para colar o EEG. Se necessário, adicione mais colar de EEG.
- Monte um braço micromanipulador na armação estereotáxica. Conecte um microeléctrodo linear de 16 canais (100 µm espaçamento, área de cada local 177 µm2) uma headstage aguda de 16 canais, recortada firmemente para o braço de micromanipulador.
- Esfregaço de EEG colar para os eletrodos de referência para o EEG e microeletrodos e, em seguida, coloque-os de forma segura dentro da incisão (figura 1A).
- Ajuste o ângulo do braço micromanipulador para que o microeléctrodo é perpendicular à superfície cortical. Este ângulo é normalmente entre 25-35 °.
- Desça o microeléctrodo sob um microscópio rodando os botões micromanipulador para que a ponta do microeléctrodo visa a pequena abertura na parte inferior da trepanação até o eletrodo superior só penetra na superfície cortical. Deve ter cuidado para evitar forçar o microeléctrodo sobre a superfície da dura-máter como isso iria quebrar o eletrodo.
- Casal de microeletrodos de 16 canais para um pré-amplificador conectado a uma unidade de aquisição de dados através de um cabo de fibra óptica (Figura 2).
- Ligue o computador conectado à unidade, a unidade de aquisição de dados e o pré-amplificador. Ative a caixa de estimulador.
- Inserir o microeléctrodo normalmente à superfície cortical girando lentamente o botão de eixo z do micromanipulador a uma profundidade de 1.500 µm20.
- Microajuste da profundidade, aplicando um trem de estímulo à almofada whisker e observando a LFP evocado de 16 canais em um monitor de PC usando o software da unidade de aquisição de dados instalado no PC. Com cuidado, gire o botão de eixo z sobre o micromanipulador até a maior amplitude da LFP evocado ocorre em torno do canal 7 (como isso coincide com a camada IV no córtex).
Nota: Instalação de eletrodos de EEG Ipsi-lateral: para alguns experimentos, um segundo eletrodo de aranha foi colocado no lado ipsi-lateral do crânio intacto acima o córtex de barril. Esta configuração permissão bilateral EEG gravação durante o estado de repouso investigar o efeito da trepanação do sinal de EEG.
Nota: O procedimento cirúrgico para configurar o eletrodo de EEG é idêntico ao descrito acima, exceto que durante a etapa de 2.6, o músculo temporalis em cada lado da cabeça foi cuidadosamente separado do crânio, suturado volta e atado ao lado correspondente da a armação estereotáxica.
Nota: A configuração de EEG/LFP simultânea também é idêntica ao descrito acima, com uma etapa adicional que um segundo eletrodo de aranha é carregado com o colar de EEG, então pressionado firmemente no crânio acima o córtex ipsi-lateral barril.
Figura 2. Um diagrama de fluxo de sinal. O rato é colocado dentro de uma gaiola de Faraday. Os eletrodos estimulantes recebem comandos da caixa de estimulador controlada pela unidade de aquisição de dados através do seu software instalado em um PC. O sinal neural gravado pelo microeléctrodo é transmitido para um pré-amplificador dentro da gaiola de Faraday. O sinal neural gravado pela sonda EEG é transmitido para o pré-amplificador através de um divisor de sinal. O pré-amplificador é conectado à unidade de aquisição de dados fora da gaiola de Faraday, através de um cabo de fibra óptica. Os dados neurais em seguida são armazenados em uma unidade local no PC, enquanto eles também podem ser exibidos em um monitor de PC. Um sistema móvel pequeno animal isoflurano administra isoflurano de fora da gaiola de Faraday. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
4. eletroestimulação e gravações Neural
Nota: A frequência de amostragem para todos os dados neurais é 24,41 kHz com resolução de 16 bits. Um julgamento consiste de uma estimulação elétrica única no início do julgamento. Cada teste dura 10 s, que também é o intervalo entre estímulo (ISI). Cada estímulo é um pulso quadrado atual de 1,2 mA duração 0,3 ms. para experiências bilaterais para estudar o efeito de trepanação, contínua descansando estado de 250 s também é gravado.
- Abra o software de gravação no computador em uso.
- Carrega o circuito correto para o experimento, selecionando 'Carregar projeto...' no menu suspenso de 'OpenProject'. Uma nova janela ('WorkBench') aparecerá (Figura 3).
Figura 3. Uma exibição do software GUI para a unidade de aquisição de dados Ele permite que o circuito apropriado para ser carregado, parâmetros de estimulação a ser definido e dados a serem gravados e visualizado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Crie um novo diretório (chamado um 'tanque' pelo software) para armazenar as gravações neurais.
- Clique em 'Arquivo' do topo da janela e selecione 'Gerenciamento de tarefa de dados'. Aparecerá uma nova janela '(gestão tanque').
- Na janela 'Tanque de gestão', pressione o botão direito do mouse para exibir um menu. Selecione 'Criar novo tanque'. Outra nova janela ('criar dados tanque') aparecerá.
- Na janela 'criar dados reservatório ', selecione o caminho onde você planeja criar um novo diretório de dados e digite o nome do novo diretório. Em seguida, pressione 'Okey'. Esta janela irá desaparecer.
- O novo diretório será exibido na janela de 'Gestão de tanque' mas em cinza. Registrar este diretório clicando sobre ele e selecione o 'reservatório Registrar' no menu suspenso. Uma estrela vermelha e uma seta verde aparecerá à esquerda do nome do diretório novo que está agora em preto (Figura 4).
- Cancelar o registro de quaisquer diretórios anteriores não estiver em uso clicando na janela 'Tanque de gestão' e selecionando 'Atualizar lista de depósito' no menu suspenso.
- Clique em 'Okey' para sair da janela 'Tanque de gestão'.
Figura 4: uma tela do software GUI mostrando um diretório de dados registrado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Registre o novo diretório no 'Escopo' para exibir sinais neurais durante o experimento.
- Clique no ícone 'Escopo' na janela 'OpenProject'. Aparecerá uma nova janela ('escopo').
- Botão direito do rato na janela 'Escopo' e selecione 'Atualizar lista de depósito' no menu suspenso. Nome do diretório novo aparecerão em cinza.
- Clique sobre o novo diretório. Uma estrela vermelha e uma seta verde aparecerá à esquerda do nome do diretório novo que está agora em preto.
- Configure os parâmetros experimentais para aquisição de dados na janela de 'Bancada' clicando em 'Configuração' da parte superior da janela. Uma nova janela aparecerá. Selecione 'Varrer laço', definir o comprimento do julgamento e o número de testes a ser gravado.
- Verifique se a caixa do estimulador é ativada.
- Pressione o botão 'Record' na janela 'WorkBench'. Uma nova janela aparecerá. Digite o nome do arquivo de dados que deseja salvar para o experimental executar mas não apertar o botão de retorno nesta fase, como a necessidade de parâmetros de gravação de EEG para ser configurado.
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Configure os parâmetros de gravação de EEG usando a Interface de usuário gráfica (GUI) do pré-amplificador. Toque na tela (em qualquer lugar) do pré-amplificador para acordar a tela. Selecione 'Desbloquear' para desbloquear o visor (Figura 5).
- Pressione o ícone à esquerda na 2: EEG' painel. Uma nova tela aparecerá.
- Pressione 'Engate' e selecione 'AC'.
- Pressione 'Ref Mode' e selecione 'Local'.
- Pressione 'Taxa de Samp' e selecione 25 KHz'.
- Pressione 'Okey' para retornar à visualização original.
Figura 5: A GUI do pré-amplificador. Ele permite que o EEG gravação parâmetros (por exemplo, frequência de amostragem e referência de preferência), a ser definido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Verifique a impedância de ição o EEG pressionando o ícone médio na 2: EEG' painel. Se muito alto, adicione mais pasta de EEG para a sonda. Pressione 'Okey' para retornar à visualização original.
- Espere 20 s para evitar a flutuação inicial das gravações EEG de gravação.
- Volte para o monitor do PC (após a espera de s 20) e pressione a tecla 'Return' no teclado. O EEG e os sinais LFP serão gravados.
5. análise de dados
-
Pré-processe os sinais LFP e EEG evocados em uma base de julgamento-por-julgamento usando as seguintes etapas.
- Mude de volta os dados neurais em tempo por 20 amostras (equivalentes a 0,82 ms). Este é o atraso produzido pelo circuito usado para coletar dados neurais na TDT em si. Deslocando-se os dados, o ponto de tempo zero é alinhado ao aparecimento do estímulo.
- Remover o artefato de estímulo, substituindo os dados neurais de 0 a 1 ms com uma linha reta conectando os dados apontam para 0 ms com o ponto de dados em 1 ms.
- Zero-significa cada julgamento subtraindo o valor médio do sinal neural 200 ms antes do início do estímulo.
- Passa-baixa filtrar os dados abaixo de 800 Hz, usando um filtro de tipo Butterworth IIR a ordemth 4 em ambas as direções para evitar a introdução de qualquer mudança temporal dos dados.
- Alinhe os dados multi-laminar através de animais. Para dados do cada animal LFP, aplicar o inverso da atual fonte de densidade (iCSD spline, fonte raio R = 0,5 mm) análise21 com um filtro gaussiano (λ = 50 µm) para localizar a camada IV pia1, que é determinado pelo maior pico negativo, ocorrendo em uma cortical profundidade abaixo da superfície pial dentro os primeiros ms 15 de aparecimento de estímulo. O CSD e o correspondente LFP, dados são então alinhados de acordo com suas localizações de pia através de animais. O coletor comum está localizado na camada IV, ~ 600 µm na superfície pial.
- Após o alinhamento, use canais 2, 7 e 12 da LFP realinhada como representantes das respostas neurais da supragranular, granular e camadas de infragranular, respectivamente no córtex de barril.
- Calcule que a média evocados LFP e EEG calculando os dados previamente processados mais de 100 ensaios.
- Para investigar o efeito da trepanação no EEG, baixo-amostra o EEG sinaliza a 1.000 Hz e calcular a densidade espectral de potência (PSD) para o contra-lateral (com um furo no crânio) e ipsi-lateral (crânio intacto) gravações de eletrodo de aranha ao longo de um período de s 250 do estado de repouso. PSD é calculado a partir de 0,1-100 Hz em Matlab usando a função 'pmtm', que se baseia o método multitaper22.
- Divida a faixa de frequência nas seguintes bandas de frequência conhecida: Delta (δ): 0.1-4 Hz, Theta (): 4-8 Hz, Alpha (α): 8-13 Hz, Beta (β): 13-31 Hz, Gamma (γ): 31-100 Hz. calcule o médio PSD dentro de cada banda.
- Dentro de cada banda de frequência, calcule a diferença normalizada no PSD, Perrar, entre o contra - e o EEG ipsi-lateral usando a equação:
onde Pc e P, são a média PSD da contra-ipsi-lateral e EEG, respectivamente, na faixa de frequência de interesse. - Dentro de cada banda de frequência, execute um t-teste uma amostra para testar a hipótese de que não há nenhuma diferença significativa (no nível de significância de 0,05) entre o PSD do sinal EEG gravado a partir de dois hemisférios.
Representative Results
Dados de 4 ratos foram em média para obter o tempo médio série, quando aplicável. A amplitude da resposta evocada EEG, também conhecido como o evento relacionado potencial (ERP), é geralmente muito menor do que a LFP. A Figura 6 mostra a média ERP e LFP no supragranular, granular e infragranular camadas do córtex barril, respectivamente. A banda de erro em cada parcela é o erro-padrão correspondente. Pode ser visto que ERP é aproximadamente 10 vezes menor do que a LFP evocado.
Figura 6: dizer (n = 4) sinais neurais de ERP, supragranular, granular e infragranular LFP. Sombra indica erro padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Comparações da dinâmica temporal do ERP e LFP são mostradas na Figura 7. Superposição direta de ERP e o supragranular LFP na Figura 7A ilustra a ordem de amplitude as diferenças entre estes dois tipos de sinais neurais. Para comparar a dinâmica temporal, tanto o ERP e o LFP são normalizados em relação a sua amplitude de pico negativo. Figura 7B e 7C mostram que o ERP normalizado sobreposta com o supragranular normalizado LFP e normalizado LFP granular, respectivamente.
Pode ser visto a partir da Figura 7B que os picos de P1 e N1 para ERP são mais atrasados do que os picos correspondentes da LFP na camada supragranular. No entanto, os perfis temporais destes dois sinais neurais são semelhantes, com P1 anterior N1. Por outro lado, o perfil temporal de ERP é marcadamente diferente de granular (camada IV do córtex barril) LFP (Figura 7). Importante não são imagens espelhadas um do outro, com LFP granular, dominada por um único pico negativo (refletindo um dissipador grande na camada cortical IV), Considerando que o ERP consistia primariamente de dois picos com polaridade oposta.
Figura 7: comparação da dinâmica temporal do ERP e LFP. (A) ERP (linha sólida) sobreposto com supragranular LFP (linha tracejada). Sombra indica erro padrão. (B) normalizado ERP (linha sólida) sobreposto com supragranular normalizado LFP (linha tracejada). (C) normalizado ERP (linha sólida) sobreposto com LFP granular normalizado (linha tracejada). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
O sinal ERP foi medido através de um eletrodo de aranha colocado no crânio com um orifício de trépano, perfurado-lo. Para investigar o efeito do buraco em gravações de EEG, outro eletrodo de aranha foi colocado no crânio intacto acima o córtex ipsi-lateral barril. Cuidado foi tomado para garantir que as impedâncias dos eléctrodos dois aranha eram comparáveis em magnitude ajustando a quantidade de EEG colar usado. Dados de quatro ratos (que foram não os ratos mesmos usados acima) são apresentados aqui.
A Figura 8 mostra as gravações simultâneas de descanso do EEG estado de ambos os eletrodos de um rato, com 100 dados exibidos na Figura 8Ae os dados no quadro retangular (20 s) são expandidas na Figura 8B. Os dois sinais de EEG em grande parte co variam, dentro da gama de amplitude semelhante. A Figura 9 mostra o PSD dos quatro ratos, com a linha superior usando uma escala linear no eixo de frequência e a linha de fundo, usando uma escala logarítmica no eixo de frequência para fornecer uma visão expandida na faixa de frequência mais baixa. Da Figura 9, não parece ser consistente viés no PSD através de temas. Isto foi confirmado por meio de uma amostra t-testes as diferenças normalizadas no PSD em média na faixa dos cinco, mostrado na Figura 10. Nenhuma das diferenças PSD normalizadas nessas bandas de frequência era significativamente diferente de zero (p = 0,32, 0.46, 0.85, 0,69 e 0,97, respectivamente).
Figura 8: gravações de EEG Bilateral. (A) crânio EEG gravação durante repouso estado com um orifício de trépano no crânio (preto) e um registro de EEG simultâneo no hemisfério oposto, com o crânio intacto (cinza). Expanded (B) vista de dentro do quadro retangular no (A) as formas de onda. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: densidade espectral (PSD) de energia do contra-(azul) e o EEG ipsi-lateral (vermelho). Cada coluna mostra o PSD para um rato. Os painéis superiores usam a escala de frequência linear, enquanto os painéis de fundo usam escala logarítmica frequência para permitir que o PSD na faixa de frequência mais baixa para ser visualizado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10: análise de grupo. Normalizada a diferença entre o contra - e o PSD ipsi-lateral com as bandas de cinco frequência: Delta, Theta, alfa, Beta e gama. Cada barra mostra as diferenças normalizadas médios dentro da faixa de frequência, com o erro-padrão mostrado como a barra de erro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Descrevemos um procedimento experimental para gravação simultânea de sinais de EEG e LFP co localizadas de um rato de isoflurano anestesiados em resposta à estimulação de almofada whisker. Um microeléctrodo foi inserido o neocórtex através de uma abertura no eletrodo de aranha EEG que foi alinhado com um orifício de trépano, perfurado o crânio. O eletrodo foi fixado ao crânio por um condutor e adesivo EEG colar23. O cone de nariz, usado para a administração de isoflurano foi modificado para que os eletrodos de estimulação pode ser inserido a almofada dos whiskers com facilidade.
O colar de EEG foi eficaz na montagem do eletrodo de aranha firmemente ao crânio, proporcionando excelente condutividade elétrica durante todo o dia experimental, sem a necessidade de aplicativos adicionais de colar. Substituiu o uso indesejável de colagem para reparar a periferia do eléctrodo aranha no crânio, como colagem é não-condutora e pode aumentar a impedância do eléctrodo se corre entre o crânio e o eletrodo. Colar de EEG tem um número de vantagens sobre gel de EEG, que é difícil de forma ao redor do orifício de trépano e pode secar durante o experimento, resultando em sinais de EEG pobres.
Como o rato foi colocado dentro de uma gaiola de Faraday, ruído elétrico devido ao ambiente extremamente foi atenuado. No entanto, às vezes o sinal neural ainda era muito barulhento. Na maioria dos casos, isso foi causado pelo eletrodo de referência não está bem posicionado e, portanto, precisava ser reajustado ou EEG mais colar usado. Outro problema comum que era a LFP evocado pequena amplitude. Isto pode ser devido o microeléctrodo não posicionado no centro da região cortical ativada pelos eletrodos de estimulação. Em vez de re-inserir o microeléctrodo, que poderia causar mais danos para os neurônios locais, geralmente ajustamos a posição dos eléctrodos de estimulação da almofada da Suiça até uma razoável amplitude de LFP (> 3 mV) podia ser observada.
Uma das limitações da técnica é a resolução espacial pobre do eléctrodo aranha, que tem um diâmetro de 6 mm. Isto é grande em comparação com o tamanho do crânio de ratos. Infelizmente, o eletrodo de aranha usado aqui é o menor disponível para compra. Será desejável para reduzir o diâmetro do eletrodo aranha para 2-4 mm, aumentando assim a especificidade espacial de gravações de EEG, fazendo a comparação entre o sinal de EEG e o supragranular LFP sinal menos ambíguo.
Vários passos críticos no protocolo precisam de atenção especial. O primeiro é a inserção do microeléctrodo através do orifício de trépano. Como a dura-máter, caso contrário está intacta, a precisão da inserção é crucial. Uma leve resistência na ponta do eletrodo geralmente significa que o eletrodo não está posicionado corretamente. Ele deve ser aumentado, posição ajustada e re-inserido. O segundo é a posição do cone de nariz no rato. Não deve ser demasiado solta, como o isoflurano pode escapar através do cone. Também não deve ser muito apertado, pois isso pode obstruir as narinas do rato e causar dificuldade para respirar. Atenção especial também é necessário para garantir que a amplitude da gravação do EEG é muito menor (geralmente 5 a 10 vezes menor) do que a LFP top canais de gravação. Se eles são semelhantes, é uma indicação de que a sonda de EEG tem entrar em contato direto ou indireto com o microeléctrodo. Um contato indireto é geralmente através do fluido espinal cerebral (CSF) que às vezes enche o buraco perfurado no crânio. A condutividade do CSF é tipicamente 100 vezes do crânio24,25. Assim, se o nível do CSF do orifício de trépano é suficientemente elevado, pode fazer contato com o eletrodo de aranha. Para evitar isso, o furo deve ser limpos frequentemente com esponjas algodão super absorvente, tais como as lanças de absorção.
O efeito de uma trepanação (diâmetro < 2 mm) no crânio no EEG gravação em torno do buraco foi estudada, colocando outro eletrodo de aranha no crânio intacto no topo do barril ipsi-lateral córtex para que as gravações de EEG bilaterais podem ser comparadas. Os resultados mostrados na Figura 9 e Figura 10, sugiro que o efeito de ser insignificante para o nível de significância de 0,05. Outros fatores que afetam a amplitude do EEG incluem quão bem o colar de EEG foi em contato com o crânio, firme como o eletrodo foi pressionado para o colar e a extensão espacial da pasta de EEG no crânio.
Também vale a pena notar que o protocolo descrito aqui registada crânio EEG, que é diferente do couro cabeludo EEG usado em estudos humanos de EEG. O couro cabeludo age como um resistor ou um filtro low-pass, que irá reduzir a relação sinal-ruído de EEG gravação ainda mais.
Finalmente, comparação da dinâmica temporal do ERP e da LFP evocado em camadas corticais sugerem que o potencial evocado somatossensorial reflete melhor a LFP na camada supragranular do córtex do que na granular e camadas de infragranular. Isto está de acordo com nossos anteriores trabalhos6, demonstrando que o segmento inicial (P1) do ERP está relacionado com o atual retorno decorrente da afluência do excitatórios sináptica atual que ocorrem na camada granular, enquanto a subsequente diminuição ( N1) em ERP pode estar relacionado com a chegada atrasada de camadas aferente a cortical talâmica II/III e/ou feedforward sinais de camadas corticais mais profundas. Em conclusão, gravações simultâneas de EEG/LFP podem aumentar a compreensão do genesis neural de EEG e facilitar a modelagem matemática de EEG em termos de sinais neurais em camadas corticais.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a Andrew Cripps e unidade BioResource na Universidade de Reading. Esta pesquisa foi financiada pelo BBSRC (número de concessão: BB/K010123/1). Dados associados a este trabalho são livremente disponíveis a partir do Y.Z. (ying.zheng@reading.ac.uk).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Female Lister Hood rats | Charles Rivers | ||
| Spider electrode | Unimed Electrode Supplies Ltd | SCS24-426 | |
| EEG paste: Ten20 | Unimed Electrode Supplies Ltd | 10-20-S | |
| Stereotaxic holder with dual micromanipulator arms: Dual Manipulator Stereotaxic Frame with 18° Ear Bars | WPI (World Precision Instruments) | 502603 | |
| Isoflurane | National Vet Services Limited | 50878 | |
| Hard plastic nose cone: Anasthesia Gas Mask for Rat | WPI | 502054 | |
| Small animal isoflurane anaesthetic system | WPI | EZ-B800A | |
| Thermostatic heating pad: Rat Blanket System 230V | Harvard Apparatus UK | 50-7221-F | |
| Ophthalmic ointment: Optixcare eye lube | Viovet | 203865 | |
| Lidocaine Hydrochloride (Injection 2%) | Larkmead Vets | ||
| Jacquette Scaler #1SSE, 18cm, Hollow | WPI | 503421 | |
| Serrated and curved dissecting forceps | WPI | 15915 | |
| Braided silk, non-absorbable suture: Mersilk Suture W502H | National Vet Services Limited | 153746 | |
| Dental drill: BONE MICRO DRILL SYST 230 VAC | Harvard Apparatus UK | 72-4860 | |
| Sterile Saline: Sodium chloride 0.9% | Animalcare Ltd | 14K26BT | |
| Drill bit #4 : Ball Mill, Carbide, #4 | Harvard Apparatus UK | 72-4958 | |
| Drill bit #4 : Ball Mill, Carbide, #1/4 | Harvard Apparatus UK | 72-4962 | |
| Faraday cage | Newport Corporation | VIS-FDC-3600 | |
| Vibration isolation workstation: Vision IsoStation | Newport Corporation | M-VIS3660-RG4-325A | |
| Oximeter Control Unit and sensor: MouseOxPlus, Starr Life Sciences Corp. | WPI | O15001 | |
| Transparent soft nose cone: Microflex Non-Rebreathing Unit with a Rat Nosecone | WPI | EZ-103A | |
| Stainless steel stimulating electrodes | PlasticsOne | E363/1/SPC | |
| Isolated current stimulator | Made in House | ||
| 16-channel micro-electrode, 100 μm spacing, area of each site 177 μm2 | NeuroNexus | A1x16-10mm-100-177-A16 | |
| 16-channel acute headstage | Tucker David Technologies Inc., TDT | RA16AC-Z | |
| Pre-Amplifier: Z-Series 64-Channel Neuro-Digitizing Preamp | TDT | PZ5-64 | |
| Passive signal splitter: 32-Channel Splitter Box for PZ5 | TDT | S-BOX_PZ5 | |
| Data acquisition unit: RZ2 BioAmp Processor. Z-Series 4-DSP ultra high performance processor | TDT | RZ2-4 | |
| Software for Neurophysiology: OpenEX | TDT | ||
| Matlab | MathWorks | ||
| Absorption spears | Fine Sicence Tools | 18105-01 |
References
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