Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

En Array-baserede komparativ genomisk hybridisering Platform for effektiv påvisning af kopi antal variationer i hurtig Neutron-induceret Medicago truncatula mutanter

Published: November 8, 2017 doi: 10.3791/56470
Automatic Translation
1, 2, 3, 2, 2, 1
1Laboratory of Plant Genetics and Development, Noble Research Institute, 2Genetics Laboratory, University of Oklahoma Health Science Center, 3Medicine and Health School, Li Shui University

Summary

Denne protokol giver eksperimenterende trin og oplysninger om reagenser, udstyr og værktøjer til analyse for forskere, der er interesseret i gennemføre samlede genom array-baserede komparativ genomisk hybridisering (CGH) analyse af kopi nummer variationer i planter.

Abstract

Mutanter er uvurderlige genetiske ressourcer for gen funktion undersøgelser. For at generere mutant samlinger, kan tre typer af mutagener udnyttes, herunder biologiske såsom T-DNA eller transposon, kemiske såsom ethyl methanesulfonate (EMS), eller fysisk såsom ioniserende stråling stråling. Typen af mutation observeret varierer afhængigt af den mutagen anvendes. For ioniserende stråling stråling induceret mutanter omfatter mutationer sletning, kopiering eller omlægning. Mens T-DNA eller transposon-baserede mutagenese er begrænset til arter, der er modtagelige for forandring, kan kemiske eller fysiske mutagenese anvendes til en bred vifte af arter. Men karakterisering af mutationer afledt af kemiske eller fysiske mutagenese traditionelt bygger på en kort-baseret kloning tilgang, der er arbejdskraft intensiv og tidskrævende. Her viser vi, at en high-density genom array-baserede komparativ genomisk hybridisering (aCGH) platform kan anvendes til effektivt at afsløre og karakterisere kopi nummer variationer (CNVs) i mutanter afledt af hurtig neutron bombardement (FNB) mutagenese i Medicago truncatula, en bælgplante arter. Hele genomet Sekvensanalyse viser, at der er mere end 50.000 gener eller gen modeller i M. truncatula. På nuværende, FNB-induceret mutanter i M. truncatula er afledt af mere end 150.000 M1 linjer, der repræsenterer uvurderlige genetiske ressourcer for funktionelle studier af gener i genomet. ACGH platformen beskrevet her er et effektivt redskab til kendetegner FNB-induceret mutanter i M. truncatula.

Introduction

Bælgplanter (ærteblomstfamilien) er den tredjestørste familie af dækfrøede planter, med mange økonomisk vigtige arter såsom sojabønner (Glycine max) og lucerne (Medicago sativa). Bælgplanter planter kan interagere med kvælstofbindende jord bakterier, generelt kaldet Rhizobia at udvikle rodknolde, hvor de atmosfæriske dinitrogenoxider er reduceret til ammoniak til brug af anlægget vært. Som sådan, dyrkning af bælgplanter afgrøder kræver lidt input af kvælstofgødning og dermed bidrager til bæredygtigt landbrug. Bælgplanter afgrøder producere blade og frø med højt proteinindhold, der tjener som udmærkede foder og korn afgrøder. Dyrkede bælgplanter arter har dog generelt kompleks genom strukturer, at funktionelle studier af gener, der spiller vigtige roller i bælgplanter-specifikke processer besværlige. Medicago truncatula er blevet bredt vedtaget som en model art for bælgplanter undersøgelser, primært fordi (1) det har en diploide genom med en relativt lille haploide genom størrelse (~ 550 Mbps); (2) planter kan blive stabilt omdannet til gen funktionelle studier; og (3) når det er nært beslægtet med Lucerne (M. sativa), Dronningen af foderafgrøder og mange andre økonomisk vigtige afgrøder for Translationel undersøgelser. For nylig, genomet sekvens af M. truncatula cv Jemalong A17 har været frigivet1,2. Anmærkning af genom viser, at der er mere end 50.000 forudsagte gener eller gen modeller i genomet. For at bestemme funktionen af de fleste af gener i M. truncatula er genom en udfordrende opgave. For at lette funktionelle studier af gener, der er oprettet en omfattende samling af mutanter i rækken af mere end 150.000 M1 linjer ved hjælp af hurtig neutron bombardement (FNB) mutagenese i M. truncatula cv Jemalong A173 ,4. Hurtig neutron, en høj energi ionisering mutagen, har været brugt til at generere mutanter i mange plantearter, herunder Arabidopsis5,6, ris (Oryza sativa)7, tomat (Solanum lycopersicum), sojabønner (Glycine soja; G. max)8,9, byg (Hordeum vulgare) og Lotus japonicus10. En stor del af mutationer afledt af FNB mutagenese skyldes DNA sletninger der spænder i størrelse fra et par basepar til mega basepar9,11. Mange fænotype-associerede gener er blevet identificeret og karakteriseret4,12,13,14,15,16, 17 , 18 , 19. tidligere, Molekylær kloning af de underliggende gener fra FNB mutanter har påberåbt sig en kort-baseret tilgang, som er tidskrævende og begrænser antallet af mutanter at være kendetegnet på molekylært niveau. For nylig, flere gratis metoder herunder udskrift-baserede metoder, genom flisebelægning array-baserede komparativ genomisk hybridisering (CGH) for DNA copy number variation påvisning og hele genome sequencing, har været ansat til at lette de karakterisering af sletning mutanter i forskellige organismer, herunder dyr og planter20,21,22,23,24,25, 26,27,28,29,30,31.

For at lette karakterisering af FNB mutanter i M. truncatula, en helhed-genom array-baserede komparativ genomisk hybridisering (CGH) er platform udviklet og valideret. Som rapporteret i animalsk systemer, array-baserede CGH platform giver mulighed for påvisning af kopi nummer variationer (CNVs) på det samlede genom niveau i M. truncatula FNB mutanter. Derudover læsioner kan bekræftes ved PCR og sletning grænser kan identificeres af sekventering. Samlet set er array CGH platform et effektivt værktøj til at identificere læsioner i M. truncatula FNB mutanter. Her, er array CGH procedure og PCR karakterisering af sletning grænser i en M. truncatula FNB mutant illustreret.

Følgende protokol giver eksperimenterende trin og oplysninger om reagenser, udstyr og værktøjer til analyse for forskere, der er interesseret i at foretage samlede genom array-baserede komparativ genomisk hybridisering (CGH) analyse af kopi nummer variationer i planter. Som et eksempel, blev Medicago truncatula FN6191 mutant brugt til at identificere sletning regioner og kandidat gener forbundet med mutant fænotyper. M. truncatula FN6191 mutant, oprindeligt isoleret fra en hurtig neutron bombardement-induceret sletning mutant samling32 (Se Tabel af materialer), udstillet en hyper-nodulation fænotype efter podning med jorden bakterien, Sihorhizobium meliloti Sm1021, i modsætning til vildtype planter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bemærk: figur 1 viser de fem trin til array CGH protokol. De er: 1) forberedelse af plantematerialer; 2) isolering af høj kvalitet DNA prøver; 3) mærkningsbestemmelserne og oprensning af DNA-prøver; 4) hybridisering, vask, og scanning af hele genom arrays; og 5) CGH dataanalyse. M. truncatula samlede genom tiling arrays indeholder ialt 971,041 unikke oligo prober rettet mod mere end 50.000 gener eller gen modeller i genomet (Se tabel af materialer). De unikke sonder er fordelt ca hver 150 basepar (bp) i exonic regioner og 261 bp i intronic regioner af M. truncatula genom.

1. forberedelse af plantematerialer

  1. Scarify vilde type (WT; M. truncatula cv Jemalong A17) og FN6191 mutant frø med koncentreret svovlsyre i 8 min. (Se Tabel af materialer). Fjern og kassér svovlsyre til en flydende spildbakken.
  2. Skylles frø med autoklaveres deioniseret vand tre gange.
  3. Overfladen sterilisere frøene med 20% blegemiddelopløsning i 10 min.
  4. Skylles frø med autoklaveres deioniseret vand tre gange.
  5. Store frø ved 4 ° C i 3 dage. Efter vernalization, overføre og spire frø i jorden, for en uge i en vækst kammer med 16 h/8 h lys/mørke cyklus og 150 µE/m 2 /s lysintensitet.
  6. Transplant planter til 1 gallon krukker og dyrke dem i et drivhus med 16 h/8 h lys/mørke cyklus, 150 µE/m 2/s lysintensiteten i tre til fire uger. Indsamle unge blad prøver fra planter til DNA isoleret.

2. Isolering af høj kvalitet DNA prøver

  1. tage 1 g af unge blade væv fra en enkelt plante og fryse det i flydende nitrogen straks.
  2. Slibe frosne blad væv i flydende nitrogen med en morter og støder til fint pulver.
  3. Isolere genomisk DNA med en DNA isolering kit (Se Tabel of Materials).
  4. Resuspend renset DNA prøver i 50 µL af autoklaveres dobbelt ionbyttet H 2 O (ddH 2 O) eller 1 x TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,0).
  5. Foranstaltning DNA koncentrationer med et spektrofotometer (Se Tabel of Materials).
  6. Evaluere 260 nm/280 nm og 260 nm/230 nm nøgletal af DNA-prøver.
    Bemærk: Høj kvalitet DNA prøver bør have en 260 nm/280 nm forholdet ≥ 1,8 og 260 nm/230 nm forholdet ≥ 2.0.
  7. Yderligere evaluere DNA-prøver ved at køre dem i 1% agarosegelitris.
    Bemærk: Høj kvalitet DNA prøver bør have høj molekylvægt og bør ikke være forurenet af RNA. Ideelt, den endelige koncentrationen af DNA-prøver skal ~ 150 ng/µL.

3. DNA mærkning og rensning

  1. fortyndes 1 µg genomisk DNA prøver med ddH 2 O til en endelige mængden af 20 µL i et 500 µL centrifugeglas.
  2. Tilføje 5 µL af en tilfældig primer (Se Tabel af materialer) til røret.
  3. Vortex tube kort og sætte det ind i en thermocycler til at udruge og denaturere DNA på 98 ° C i 10 min.
  4. Tag glasset ud af thermocycler og sætte det straks på isvand til chill i 5 min.
  5. Forbered to mærkning blander som vist i tabel 1.
  6. Tilføje 25 µL af mærkning blander 1 og 2 til reference DNA og prøve DNA-rør hhv.
  7. Bland mærkning mix og DNA af pipettering tre gange og spin rør kort.
  8. Sætte rørene ind i en thermocycler til inkuberes ved 37 ° C i 2 timer og derefter på 65 ° C i 20 min. til at inaktivere exo-Klenow enzym (Se Tabel of Materials).
  9. Tilføje 430 µL 1 x TE buffer til hver tube.
  10. Blande indholdet og spin rør kort.
  11. Overførsel løsning i røret i en rensning kolonne med en 2 mL collection tube (Se Tabel of Materials).
  12. Centrifuge kolonnen rensning på 14.000 x g i 10 min.
  13. Kassere passerer gennem løsning.
  14. Tilføje 480 µL 1 x TE buffer til hver kolonne.
  15. Centrifuge kolonnen igen ved 14.000 x g i 10 min.
  16. Kassere pass-through-løsningen.
  17. Overføre mærket DNA-prøven, som forbliver på den nederste del af kolonnen for en nye centrifugerør.
  18. Måler mængden af mærket DNA-prøven ved hjælp af en pipette og bringe den endelige mængden til 80 µL med 1 x TE buffer.
  19. Måler koncentrationen af mærket DNA-prøven ved hjælp af et spektrofotometer (Se Tabel of Materials).
  20. Blandes en lige stor del af mærket prøve DNA og referere til DNA og bringe den endelige mængden til 160 µL med 1 x TE buffer.
  21. Tilføje 256 µL af 2 x hybridisering buffer, 50 µL af menneskelige Cot-1 DNA og 50 µL af 10 × aCGH blokerende agent (Se Tabel af materialer) og bland dem godt af pipettering tre gange.
  22. Spin rør kort og sætte dem ind i en thermocycler at udruge på 98 ° C i 10 min.
  23. Der inkuberes ved 37 ° C i 20 min. rør

4. Hybridisering, vask, og Scanning af genom Arrays

  1. pre varm hybridisering ovnen til 67 ° C i mindst 4 timer før hybridisering starter.
  2. Placerer en pakning dias på soklen af en hybridisering afdeling.
  3. Belastning 490 µL af hybridisering løsning fra trin 3.23 diaset pakning.
  4. Dækker pakning dias med en Medicago truncatula genom microarray chip til at danne en hybridisering afdeling.
  5. Sat på hybridisering kammer covers og spænd kammeret fast med skruetvinger.
  6. Sætte forsamlede hybridisering kammer i hybridisering ovn og inkuberes ved 67 ° C til 40-48 h.
  7. Forbered tre dias opvask: to med 250 mL vask buffer jeg opbevares ved stuetemperatur, og en med vask buffer II holdes på 37 ° C.
  8. Forbered to dias vask krukker: én med 70 mL acetonitril og én med 70 mL stabilisering og tørring løsning, holde i et stinkskab ved stuetemperatur (Se Tabel of Materials).
  9. Fjerne hybridisering salen fra ovnen og fjerne kammer klemmer og dække.
  10. Flytte microarray chip og pakning skub til en slide vask skål med wash buffer og separat chippen fra cover dias.
  11. Flyt microarray chip til andet dias vask fad med wash buffer og forsigtigt cirkulere løsning med en røre bar på en magnetisk røre pladen ved stuetemperatur i 5 min.
  12. Overførsel af microarray chip til den tredje dias vask skål med pre varmede vask buffer II og vaske det forsigtigt med en røre bar på en magnetisk røre pladen ved 37 ° C i 1 min.
  13. Overføre microarray chip til et dias, vask krukke med acetonitril i et stinkskab og vaske det for 30 s.
  14. Overføre microarray chip til et dias vask krukke med stabilisering og tørring løsning og vaske det for 30 s.
  15. Tag chippen langsomt og tørre det i 1 min.
  16. Skan microarray chip ved hjælp af en scanner (Se Tabel af materialer) under 2 µm opløsning. Angive parametre for at gemme flere billeder og hele slide scanner. Sæt kanaler 1 og 2 gevinster til 100% og annullere automatisk styrkekontrol.

5. CGH dataanalyse

  1. ekstrakt af Cy3 og Cy5 fluorescens intensiteter for hver sonden på matrixen ved hjælp af scanning software (Se Tabel of Materials).
  2. Brug Segmenteringsanalyse af software til at registrere kopi nummer variationer (CNVs) mellem prøve DNA og reference DNA. Bruge en tærskel på segmentet betyder log 2 prøve/reference forholdet ± 2,5 standardafvigelser til bestemmelse af CNVs.
  3. Inspicere fordelingen af log 2 prøve/reference nøgletal på tværs af den samlede genom ved hjælp af et signal kortlægningssoftware (Se Tabel of Materials).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 2 viser fordeling af normaliserede log2 nøgletal mutant versus WT signaler på tværs af den samlede genom. Analyse af CGH data viste en omtrentlig 22 kb sletning på kromosom 4, der omfatter hele SUNN gen33 og flere andre kommenteret gener i FN6191 mutant (figur 2, figur 3). Kandidat slettede regionen var omfattet af 73 træk sonder på matrixen med de gennemsnitlige normaliseret log2 nøgletal mindre end-2.5 (supplerende tabel 1). Inspektion af sletning grænser foreslog, at den formodede sletning i denne mutant er flankeret af sonder beliggende mellem koordinater 22,313,168 og 22,334,934 på kromosom 4 (figur 3). For at bekræfte sletning grænser, PCR primere var designet til at være cirka 1.500 bp ud over de forudsagte sletning grænser (FN6191-DB-F: GCTAGCAAGGGTCTGCGCAAGTT; FN6191-DB-R: GTATCGAGAAGGTCTTATAGCAGC) og PCR-amplifikation blev udført med disse primere og følgende parametre: 94 ° C, 5 min; 94 ° C, 45 s, 55 ° C, 30 s, 72 ° C, 1,5 min; for 35 cykler; 72 ° C, 10 min og derefter 10 ° C på ubestemt tid. Som forventet, var en enkelt PCR produkt på ca 1,5 kb med held amplificeret fra FN6191 mutant, men ikke WT (figur 4A). Baseret på M. truncatula genom release v3.5, blev størrelsen af sletning i FN 6191 anslået til at være 26.67 kb (figur 4B). CGH resultater viste, at ingen andre unormale segmenter er til stede i FN6191 mutant genomet (figur 2).

Figure 1
Figur 1: Workflow af array komparativ genomisk hybridisering (aCGH) analyse af M. truncatula mutant. (A) forberedelse af plantematerialer: M. truncatula vildtype (Jemalong A17) og FN6191 mutant blev dyrket i tre til fire uger i drivhus. (B) Isolation af høj kvalitet genomisk DNA: et gram af unge blade fra enkelt planter blev brugt til at isolere genomisk DNA. DNA kvalitet var fast besluttet på ved hjælp af et spektrofotometer og gel elektroforese. (C) DNA mærkning og rensning. Genomisk DNAs reference og eksperimentelle prøver var mærket med Cyanine 3 (Cy3) og Cy5 ved hjælp af en DNA-mærkning kit og renset ved hjælp af en rensning kolonne. (D) hybridisering, vask, og scanning af 1 x 1 M M. truncatula CGH array. (E) CGH analyse: Log2 nøgletal af eksperimentelle/reference-signaler, der er mindre end eller lig med-2.5 eller større end eller lig med 2,5 betragtes som formodede sletninger og gengangere, henholdsvis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Array baseret komparativ genomisk hybridisering analyse af kopi nummer variationer i M. truncatula hyper nodulation mutant FN6191. Vist er log2 mutant/vildtype nøgletal af sonder på alle otte kromosomer. En fortløbende 73-sonde region på kromosom 4 blev identificeret som den slettede region i muterede (pil). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. Identifikation af det slettede region i M. truncatula FN6191 mutant. Et nærbillede af regionen på kromosom 4, hvor 73 microarray sonder udstillet betydeligt reduceret log2 mutant/vildtype nøgletal, og seks kortlagt gener herunder SUNN (Medtr4g070970). Pilene angiver den placering og retning af primere til PCR-amplifikation af sletning grænser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Bekræftelse af sletning grænser i M. truncatula FN6191 mutant. (A) PCR forstærkning af sletning grænser: en 1,5 kb produkt blev forstærket fra FN6191 mutant ved hjælp af primere flankerende sletning grænser (lane 1; MU). Det samme sæt af primere ikke forstærke eventuelle produkter fra WT (M. truncatula Jemalong A17) på grund af en størrelsesbegrænsning af PCR (lane 2; WT). Lane Møller, 1 kb stigen. (B) sekvenser af sletning junction i FN6191 mutant. En pil angiver sletning krydset. (C) sekventering resultater viste, at sletning grænser (pile) er placeret ved koordinaterne, 22309163 og 22335836 på kromosom 4. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Mærkning mix 1 Per reaktion x prøve # (μL) Mærkning mix 2 Per reaktion x reference # (μL)
Hedeselskabet2O 6,0 x Hedeselskabet2O 6,0 x
5 x Buffer 10.0 x 5 x Buffer 10.0 x
10 x dNTPs 5,0 x 10 x dNTPs 5,0 x
Cyanine 5 3,0 x Cyanine 3 3,0 x
EXO-Klenow 1,0 x EXO-Klenow 1,0 x
I alt 25 x I alt 25 x

Tabel 1: Mærkning blander.

Supplerende tabel 1: Sonden sekvenser slettet i M. truncatula FN6191 mutant.
Venligst klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har udviklet en array-baserede CGH platform til påvisning og karakterisering af hurtig neutron bombardement (FNB)-induceret mutanter i M. truncatula cv. Jemalong A17. For at demonstrere brugen af array CGH metode til at opdage genmutationer, udførte vi aCGH analyse af mutant FN6191, som udstillede en hyper-nodulation fænotype i modsætning til vildtype planter, når podet med S. meliloti Sm1021. Segmenteringsanalyse, et segment var anses for væsentlig, hvis log2 forhold betyde af sonder i målgruppen var over den øvre grænseværdi eller den lavere tærskel for at given array sammenligning. Den øvre grænse for hver sammenligning var fast besluttet på at være log2 forholdet mellem værdien af 95-percentilen af alle datapunkter. Den lavere tærskel for hver sammenligning var fast besluttet på at være log2 forholdet mellem værdien af de 5 percentilen af alle data punkter24.

Vores analyse viste, at betydelige antal ændringer kan bestemmes ved at hente segmenter med en gennemsnitlig normaliseret log2 forholdet er større end gennemsnittet af 2,5 SD (overlapning) eller mindre end gennemsnittet af 2,5 SD (sletning). Baseret på CGH analyse, registreret vi en sletning region med en anslået størrelse på 22 kb på kromosom 4, omfatter SUNN gen33. Sekventering resultater bekræftede, at sletning størrelse var 26.67 kb baseret på M. truncatula genom release v3.5. Det har vist sig at SUNN koder en CLV1-lignende leucin-rig gentage receptor kinase, der styrer knude antallet i M. truncatula33. Vores CGH resultater tyder på, at FN6191 er en ny SUNN allel. Baseret på disse resultater, begrundet vi at metoden CGH kombineret med fænotypisk og genetisk analyse med held kan anvendes til hurtigt at identificere kandidat gener i FNB sletning mutanter. Over de sidste mange år, har vi brugt denne platform i at identificere og karakterisere talrige FNB mutanter for gen funktionelle studier i M. truncatula34,35. Vi har oprettet en database over kopi nummer variationer (CNVs) forbundet med FNB mutant linjer36. Slettede sekvenser fra CGH analyser af over 100 bekræftede i denne database, symbiotisk nodulation mutanter har været knyttet til M. truncatula genom. En blast server er sat op til at lette søgningen efter slettede sekvenser i samlingen mutant. Udvikling og yderligere ekspansion af sletning database ville være meget værdifuld for funktionel genomforskning forskning ved hjælp af M. truncatula FNB mutant ressourcer.

ACGH protokol har fem store skridt. Selvom alle trin er vigtigt og bør foretages omhyggeligt som beskrevet tidligere, followings er især kritisk: (1) DNA prøver må ikke degraderes og bør ikke være forurenet af RNA under trinnet forberedelse; (2) test- og referencestoffer DNA prøver bør være lige så godt forberedt, så mærket prøverne er af samme høje kvalitet; (3) mærket DNA prøver må ikke udsættes for en høj intensitet lys og et højt niveau af ozon; og (4) det er vigtigt at holde vask Buffer II ved 37 ° C under trinnet vask.

Dækningen af den aktuelle M. truncatula genom array er primært på de exonic regioner og mindre på de intronic regioner, og slet ikke i intergenic regioner. Dækning i de sidstnævnte regioner kan forbedres, hvis læsioner i disse regioner er vigtige for mutant fænotyper. På den anden side har de nuværende sonde design mindre strøm til at identificere små mutationer og single nucleotide polymorphisms (SNPs). Denne begrænsning kan overvindes ved CGH + SNP microarray design37. Samlet set er genom array-baserede komparativ genomisk hybridisering (aCGH) platform et kraftfuldt værktøj til analyse af kopi nummer og strukturelle variationer i M. truncatula FNB mutanter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ikke konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Finansieringen af dette arbejde er fastsat i en del af et tilskud fra NSF plante genomforskning (IOS-1127155).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Medicago truncatula genome array, 1 x 1 M Agilent G4123A
Medicago truncatula FN6191 (mutant) In house FN6191
Medicago truncatula Jemalong A17 (reference) In house A17
Sulfuric acid Sigma-Aldrich 320501
DNeasy Plant Mini Kit Qiagen 69104
Nanodrop Spectrophotometer Thermo Scientific 1000D
SureTag DNA Labeling Kit Agilent 5190-3400
Random primer Agilent 5190-3399
Acetonitrile Sigma-Aldrich 271004-1L
Thermocycler MJ research PTC-200
Centrifuge Labnet international Inc Spectrafuge 24D
Stabilization and Drying Solution Agilent 5185-5979
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit Agilent 5188-5380
Hybridization Chamber gasket slides Agilent G2505
Human Cot-1 DNA Agilent 5190-3393
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and 2 Agilent 5188-5221
Hybridization Chamber, stainless Agilent G2534A
Hybridization oven Agilent G2545A
Purification Columns Agilent 5190-3391
Laser scanner Roche MS200
NimbleScan 2.6 Roche Nimblegen 5225035001
Signal Map 1.9 Roche Nimblegen Signalmap1.9

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tang, H., et al. An improved genome release (version Mt4.0) for the model legume Medicago truncatula. BMC Genomics. 15, 312 (2014).
  2. Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses. Nature. 480 (7378), 520-524 (2011).
  3. Wang, H., Li, G., Chen, R. Fast neutron bombardment (FNB) induced deletion mutagenesis for forward and reverse genetic studies in plants. Floriculture, Ornamental and Plant Biotechnology: Advances and Topical Issues. da Silva, J. T. , 1st ed, Global Science Books. Isleworth, UK. 629-639 (2006).
  4. Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G. Deletion-based reverse genetics in Medicago truncatula. Plant Physiol. 151 (3), 1077-1086 (2009).
  5. Alonso, J. M., et al. Five components of the ethylene-response pathway identified in a screen for weak ethylene-insensitive mutants in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (5), 2992-2997 (2003).
  6. Silverstone, A. L., Ciampaglio, C. N., Sun, T. The Arabidopsis RGA gene encodes a transcriptional regulator repressing the gibberellin signal transduction pathway. Plant Cell. 10 (2), 155-169 (1998).
  7. Li, X., Lassner, M., Zhang, Y. Deleteagene: a fast neutron deletion mutagenesis-based gene knockout system for plants. Comp Funct Genomics. 3 (2), 158-160 (2002).
  8. Bolon, Y. T., et al. Phenotypic and genomic analyses of a fast neutron mutant population resource in soybean. Plant Physiol. 156 (1), 240-253 (2011).
  9. Men, A. E., et al. Fast Neutron Mutagenesis of Soybean (Glycine soja L.) Produces a Supernodulating Mutant Containing a Large Deletion in Linkage Group H. Genome Letters. 1 (3), 147-155 (2002).
  10. Hoffmann, D., Jiang, Q., Men, A., Kinkema, M., Gresshoff, P. M. Nodulation deficiency caused by fast neutron mutagenesis of the model legume Lotus japonicus. J Plant Physiol. 164 (4), 460-469 (2007).
  11. Li, X., et al. A fast neutron deletion mutagenesis-based reverse genetics system for plants. Plant J. 27 (3), 235-242 (2001).
  12. Bourcy, M., et al. Medicago truncatula DNF2 is a PI-PLC-XD-containing protein required for bacteroid persistence and prevention of nodule early senescence and defense-like reactions. New phytol. 197 (4), 1250-1261 (2013).
  13. Chen, J., et al. Control of dissected leaf morphology by a Cys(2)His(2) zinc finger transcription factor in the model legume Medicago truncatula. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (23), 10754-10759 (2010).
  14. Ge, L., et al. Increasing seed size and quality by manipulating BIG SEEDS1 in legume species. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), 12414-12419 (2016).
  15. Kalo, P., et al. Nodulation signaling in legumes requires NSP2, a member of the GRAS family of transcriptional regulators. Science. 308 (5729), 1786-1789 (2005).
  16. Oldroyd, G. E., Long, S. R. Identification and characterization of nodulation-signaling pathway 2, a gene of Medicago truncatula involved in Nod actor signaling. Plant Physiol. 131 (3), 1027-1032 (2003).
  17. Peng, J., et al. Regulation of compound leaf development in Medicago truncatula by fused compound leaf1, a class M KNOX gene. Plant Cell. 23 (11), 3929-3943 (2011).
  18. Tsujimoto, Y., et al. Arabidopsis TOBAMOVIRUS MULTIPLICATION (TOM) 2 locus encodes a transmembrane protein that interacts with TOM1. EMBO J. 22 (2), 335-343 (2003).
  19. Wang, D., et al. A nodule-specific protein secretory pathway required for nitrogen-fixing symbiosis. Science. 327 (5969), 1126-1129 (2010).
  20. Bejjani, B. A., Shaffer, L. G. Application of array-based comparative genomic hybridization to clinical diagnostics. J Mol Diagn. 8 (5), 528-533 (2006).
  21. Emerson, J. J., Cardoso-Moreira, M., Borevitz, J. O., Long, M. Natural selection shapes genome-wide patterns of copy-number polymorphism in Drosophila melanogaster. Science. 320 (5883), 1629-1631 (2008).
  22. Gong, J. M., et al. Microarray-based rapid cloning of an ion accumulation deletion mutant in Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (43), 15404-15409 (2004).
  23. Guryev, V., et al. Distribution and functional impact of DNA copy number variation in the rat. Nat Genet. 40 (5), 538-545 (2008).
  24. Haun, W. J., et al. The composition and origins of genomic variation among individuals of the soybean reference cultivar Williams 82. Plant Physiol. 155 (2), 645-655 (2011).
  25. Infante, J. J., Dombek, K. M., Rebordinos, L., Cantoral, J. M., Young, E. T. Genome-wide amplifications caused by chromosomal rearrangements play a major role in the adaptive evolution of natural yeast. Genetics. 165 (4), 1745-1759 (2003).
  26. Jones, M. R., Maydan, J. S., Flibotte, S., Moerman, D. G., Baillie, D. L. Oligonucleotide Array Comparative Genomic Hybridization (oaCGH) based characterization of genetic deficiencies as an aid to gene mapping in Caenorhabditis elegans. BMC Genomics. 8, 402 (2007).
  27. Lakshmi, B., et al. Mouse genomic representational oligonucleotide microarray analysis: detection of copy number variations in normal and tumor specimens. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11234-11239 (2006).
  28. Mitra, R. M., et al. A Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase required for symbiotic nodule development: Gene identification by transcript-based cloning. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (13), 4701-4705 (2004).
  29. Rios, G., et al. Characterization of hemizygous deletions in citrus using array-comparative genomic hybridization and microsynteny comparisons with the poplar genome. BMC Genomics. 9, 381 (2008).
  30. Skvortsov, D., Abdueva, D., Stitzer, M. E., Finkel, S. E., Tavare, S. Using expression arrays for copy number detection: an example from E. coli. BMC Bioinformatics. 8, 203 (2007).
  31. Werner, J. D., et al. Quantitative trait locus mapping and DNA array hybridization identify an FLM deletion as a cause for natural flowering-time variation. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2460-2465 (2005).
  32. Xi, J., Chen, Y., Nakashima, J., Wang, S. M., Chen, R. Medicago truncatula esn1 defines a genetic locus involved in nodule senescence and symbiotic nitrogen fixation. Mol Plant Microbe Interact. 26 (8), 893-902 (2013).
  33. Schnabel, E., Journet, E. P., de Carvalho-Niebel, F., Duc, G., Frugoli, J. The Medicago truncatula SUNN gene encodes a CLV1-like leucine-rich repeat receptor kinase that regulates nodule number and root length. Plant Mol Biol. 58 (6), 809-822 (2005).
  34. Horvath, B., et al. Loss of the nodule-specific cysteine rich peptide, NCR169, abolishes symbiotic nitrogen fixation in the Medicago truncatula dnf7 mutant. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15232-15237 (2015).
  35. Kim, M., et al. An antimicrobial peptide essential for bacterial survival in the nitrogen-fixing symbiosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15238-15243 (2015).
  36. Noble Research Institute. Medicago truncatula Mutant Database. , Available from: https://medicago-mutant.noble.org/mutant/FNB.php (2017).
  37. Burton, R. SNP genotyping with the next generation of CGH microarray. MLO Med Lab Obs. 45 (7), (2013).

Tags

Genetik sag 129 Medicago truncatula hurtig neutron bombardement mutanter matrix-baserede komparativ genomisk hybridisering kopiere nummer variation mutation afsløring mutation
En Array-baserede komparativ genomisk hybridisering Platform for effektiv påvisning af kopi antal variationer i hurtig Neutron-induceret <em>Medicago truncatula</em> mutanter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, Y., Wang, X., Lu, S., Wang,… More

Chen, Y., Wang, X., Lu, S., Wang, H., Li, S., Chen, R. An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants. J. Vis. Exp. (129), e56470, doi:10.3791/56470 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter