Summary
Hier presenteren we de nematode Caenorhabditis elegans als een veelzijdig hostmodel aan de studie van microbiële interactie.
Abstract
We tonen een methode met behulp van Caenorhabditis elegans als een host model aan de studie van microbiële interactie. Microben worden ingevoerd via de voeding de primaire locatie voor ziekte van de darm te maken. De nematode darm structureel en functioneel bootst zoogdieren darmen en is transparant waardoor het vatbaar voor microscopisch onderzoek van de kolonisatie. Hier laten we zien dat ziekteverwekkers leiden ziekte en dood tot kunnen. We kunnen identificeren van de microbiële mutanten die aantonen dat veranderde virulentie. Haar geconserveerde aangeboren reactie op biotische onderstreept maakt C. elegans een uitstekend systeem om te sonderen facetten van gastheer aangeboren immuun-interacties. We laten zien dat hosts met mutaties in het gen dual oxidase geen reactieve zuurstof soorten en zijn niet in staat om te weerstaan microbiële belediging. Wij tonen verder de veelzijdigheid van de bepaling van de gepresenteerde overleven door aan te tonen dat het kan worden gebruikt om het bestuderen van de effecten van remmers van microbiële groei. Deze test kan ook worden gebruikt om schimmel virulentiefactoren als doelen voor de ontwikkeling van nieuwe antischimmel agenten ontdekken, evenals de gelegenheid bieden om de host-microbe interacties verder te ontdekken. Het ontwerp van deze bepaling leent zich goed voor hoge doorvoer geheel-genoom schermen, terwijl de mogelijkheid om cryo-preserve wormen voor toekomstig gebruik het een kosteneffectieve en aantrekkelijk geheel diermodel maakt te bestuderen.
Introduction
C. elegans is gebruikt als een krachtige modelorganisme voor meer dan 50 jaar. In de jaren 1960, een Zuid-Afrikaanse bioloog Sydney Brenner pionier het gebruik van C. elegans om te studeren van neuronale ontwikkeling, de weg vrijmaakt voor een lange lijn van wetenschappers te bestuderen van de verschillende aspecten van de biologie van de cel en dier in nematoden. Dit geslacht omvat Nobelprijswinnaars Craig Mello en Andrew Fire voor hun RNAi werk1, Robert Horvitz en John Sulston voor hun werk op orgel ontwikkeling en apoptosis2,3,4, Martin Chalfie voor zijn werk aan groen fluorescent proteïne5. Hoewel dit model-organisme traditioneel gebruikt is voor het bestuderen van de moleculaire en ontwikkelingstoxiciteit biologie, in de afgelopen 15 jaar, zijn onderzoekers begonnen met het gebruiken van C. elegans om te onderzoeken van de biologie van verschillende menselijke pathogenen waaronder Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella entericaen Serratia marcescens6,7,8,9,10. Deze studies is gebleken dat veel van de mechanismen die betrokken zijn bij de mens-pathogen interactions zijn geconserveerd in nematoden, maar ook dat er zijn sommige immuniteit mechanismen die uniek voor dit model organisme11,12 zijn. In de natuur, heeft C. elegans ontmoetingen een verscheidenheid van bedreigingen van de geconsumeerde ziekteverwekkers aanwezig in de bodem en dit een sterke selectieve druk om te evolueren en handhaven van een verfijnde ingeboren immune systeem in de intestinale lumen. Veel van de genen en de mechanismen die betrokken zijn bij de bescherming van intestinale lumen zijn georkestreerd door zeer geconserveerd elementen die ook bestaan in hogere zoogdieren11,13. C. elegans vertegenwoordigt daarom een groot model te bestuderen van de gastro-intestinale ziekteverwekkers zoals Salmonella enterica14, Shigella boydii15of Vibrio cholera16.
We benadrukken hier de opmerkelijke veelzijdigheid van C. elegans als een host model te bestuderen van infectieuze agentia zoals C. albicans. C. elegans als een host model zorgt voor hoge throughput screening voor virulentie die is minder duurder en tijdrovender dan een muismodel, dat wordt gebruikt bij het bestuderen van candidiasis42.
In deze studie, laten we zien dat dit model en de bijbehorende overleving assay betrouwbaar inzetbaar voor het bestuderen van de host aangeboren immuun effectoren belangrijk om infecties, pathogen determinanten die virulentie rijden, tegen te gaan en farmacologische verbindingen die kunnen ingrijpen in de pathogenese. Ongelijk aan eerder beschreven tests, deze methode biedt een middel van het bestuderen van de blootstelling aan een ziekteverwekker gedurende de levensduur van het dier, van het larvale stadium naar volwassenheid, in plaats van alleen volwassenheid dood43,44. Kortom, onze C. elegans - is C. albicans model een veelzijdige en krachtige tool die gebruikt kan worden, niet alleen om te bestuderen van de genetische basis dat station infectie en immuniteit, maar ook voor het identificeren van nieuwe compounds voor therapeutische interventie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. voorbereiding van Nematode groei Medium (NGM)
- voor 1 L van media, 20 gram agar, 2,5 g organische stikstofbron (b.v., bacto-pepton) en 3 g natriumchloride in een erlenmeyer van 2 L combineren. Voeg 975 mL steriel water.
- Toevoegen in een steriele roer bar. Als gebruik van een automatische media Schenker, de autoclaaf buis en de media gedurende 15 minuten; media moet worden gesteriliseerde met autoclaaf voor meer als een hoger volume bestaat.
- Media ingesteld op roer plaat en laat afkoelen.
- Media eenmaal warm aan te raken (ongeveer 60 ° C) aseptisch Voeg 1 mL 1 M MgSO 4 ● H 2 O, 1 mL 1 M CaCl 2 KPO 4 25 mL en 1 mL 0,5% cholesterol in ethanol.
- Giet media (met de hand, of door automatische pomp) onder laminaire flow in 35 x 10 mm steriele petrischalen. Laten drogen onder motorkap voor 1-2 dagen vóór gebruik.
Opmerking: Platen moeten worden bewaard bij 4 ° C om verontreiniging te voorkomen.
2. Maken van een Worm Pick
- Knip een stukje van 1,5 cm van aluminium draad. Ongeveer 0,5 cm van deze lengte zorgvuldig invoegen in het puntje van een pipet van Pasteur.
- Met behulp van een bunsenbrander of alcohol lamp, smelten het glas pipette uiteinde door deze te langzaam draaien in de vlam totdat de draad veilig de pipet, zonder afbreuk te doen aan de oorspronkelijke vorm van het uiteinde van de pipet wordt nageleefd.
3. Voorbereiding van E. coli cultuur
- met een steriele lus, één kolonie van E. coli stam OP50 in 200 mL Bouillon Luria beënten. Na een nacht bebroeden met schudden bij 37 ° C.
- De vloeibare cultuur is klaar voor gebruik de volgende dag en kunnen bij 4 ° C wanneer niet in gebruik worden bewaard.
Opmerking: De stam E. coli, OP50, wordt gebruikt als een bron van voedsel voor C. elegans. Deze cultuur kan worden gebruikt voor tot verscheidene maanden, wanneer bewaard bij 4 ° C.
4. Essentiële C. elegans onderhoud
- zaad NGM agar platen met E. coli bereid door ongeveer 50-100 µL van bereid OP50 vloeibare cultuur in het midden van de plaat spotten.
- Dekking van platen en laten drogen bij kamertemperatuur gedurende 24 uur. Eenmaal droog, platen bij 37 ° C's nachts voor snelle groei plaats of houden bij kamertemperatuur, tragere groei is desgewenst.
- Wormen toevoegen aan de plaat door ofwel " chunking, " (zie protocol stap 5 " Chunking en plukken wormen "), wormen individueel plukken of worm eieren rechtstreeks op het bord plaatsen (zie protocol stap 6 " ei voorbereiding ").
5. Chunking en plukken wormen
Opmerking: " Chunking, " verwijst naar een praktijk die is gebruikelijk in C. elegans onderhoud. Dit betekent snijden van een deel van de NGM agarplaat waarin wormen, en overdracht van dit stuk op een nieuwe plaat, dus ook het overbrengen van een groot aantal wormen in het proces. Besmetting kan ook worden gesneden uit de plaat op deze manier. Bij het afhalen van wormen, is het belangrijk om de integriteit van de agar omdat wormen in gaten in de agar kunnen worden verloren. Daarnaast is het belangrijk dat de pick afkoelen voordat het aanraken van de plaat om te voorkomen dat de agar smelten of verbranden van de wormen.
- Om snel grote hoeveelheden van worms op nieuwe borden, Knip een stukje van NGM agar met de geselecteerde wormen met behulp van een spatel. Verwijder de geslepen stuk en leg het gezicht naar beneden in de rand van het gazon voor OP50 op een nieuwe plaat.
- Overdracht wormen individueel zoals hieronder beschreven in protocol stap 8.2, " Survival Assay, " met behulp van een worm kiezen. De draad in de worm pick vlam totdat het rood. Het verwijderen van het vuur en laat het afkoelen gedurende een paar seconden.
- Met behulp van de draad op de pick, voorzichtig schrapen het gazon van de OP50 cultuur geteeld op de nieuwe plaat, die betrekking hebben op de draad op de Kies.
- De viskeuze cultuur die betrekking hebben op het uiteinde van de draad maakt wormen vasthouden aan het uiteinde van de pick, dus voorzichtig pick-up van geselecteerde wormen met behulp van een veeg motie.
- Zodra geselecteerde wormen zijn verzameld, plaats ze op een nieuwe bord door zachtjes veeg cultuur over de agar. Plaats de draad in de vlam te verwijderen van de resterende cultuur op de Kies.
6. Bereiding ei
- ongeveer 20 volwassen dieren (ongeveer 2-3 dagen na het uitkomen als volwassen bij 20 ° C) plaatsen door plukken of chunking zoals beschreven in het protocol stap 5, " Chunking en plukken wormen, " op een bord met 50 agarvoedingsbodem µL van E. coli stam, OP50.
- Voor het verzamelen van de eieren, overgiet de plaat met 10 mL van de M9 buffer na 1-2 dagen. Met behulp van een glazen serologische Pipet, swirl en zachtjes doorroeren de inhoud op de agarplaat vrij te geven van de eieren vast aan OP50 of volwassen dieren. Verzamelen van alle van de vloeistof met de eieren en de volwassenen.
- Transfer M9 en OP50 oplossing in een 15 mL conische buis. Centrifugeer de conische buis 15 mL bij 2100 x g gedurende 2 min.
- Ongeveer 9 mL van het supernatans gecombineerd zonder verstoring van de OP50 pellet.
- Resuspendeer de pellet in 2 mL steriel water 1 mL bleekwater en 1 mL van 0,25 M NaOH.
- Meng zachtjes door inversie totdat het merendeel (ongeveer 70 procent) van de volwassen dieren lysed verschijnen; meestal eieren intact blijven tijdens deze korte bleekmiddel behandeling wegens hun shell. Centrifugeer de conische buis bij 990 x g gedurende 2 min.
- Aspirate bovendrijvende vloeistof zonder de pellet te verstoren. Resuspendeer de pellet in 10 mL M9 buffer.
- Centrifugeren de conische buis in 990 x g voor 2 min. Aspirate bovendrijvende vloeistof zonder storende pellet. Resuspendeer pellet met 200 µL van M9 buffer.
Opmerking: Ei voorbereiding mogelijk meerdere proeven. Eieren kunnen worden vernietigd als zij als bleekmiddel te lang worden blootgesteld. Als geen eitjes, daling van de concentratie van het bleekmiddel in oplossing of afname van de duur van blootstelling aan het bleekmiddel.
7. Infectie plaat Set-up
- afzien in een steriele reageerbuis 3-5 mL van de YPD en het inoculeren met een één kolonie van Candida albicans met behulp van een steriele lus.
- De buis te plaatsen op een hiervoor trommel voor ongeveer 16-18 h bij 30 ° C.
- Label een 1,5 mL microfuge buis bevat C. albicans, en andere OP50 bevatten. Het gewicht van elke lege buis.
- Plaats 500 µL van de overnachting C. albicans cultuur in buis label C. albicans en 1.500 µL van de nachtelijke OP50 cultuur (uit stap 3.1) in de buis met het label OP50.
- Centrifuge voor 10 min op 16,100 x g. Aspirate bovendrijvende vloeistof zonder storende pellet.
- Resuspendeer elke pellet met 500 µL van steriel water. Centrifugeer gedurende 5 min op 16.100 x g.
- Aspirate bovendrijvende vloeistof zonder de pellet te verstoren. Het uiteindelijke gewicht van microfuge buizen.
- Bepalen het gewicht van elke pellet door af te trekken van het begingewicht van de microfuge buizen van het uiteindelijke gewicht.
- Met steriel water, resuspendeer de pellet C. albicans tot 10 mg/mL en de OP50 pellet tot 200 mg/mL. Maken van een basispagina infectie Meng door het combineren van 10 µL van een oplossing van 50 mg/mL streptomycine, 2.5 µL van OP50 cultuur en 0,5 µL van C. albicans cultuur 7 µL van steriel water.
- Voor controle platen, maak een master mix door vervanging van het volume van C. albicans cultuur met steriel water. Zaad van 20 µL van infectie mix of OP50 control-oplossing op de platen van de centrum van NGM met behulp van een micropipet.
Opmerking: Ongeveer 100 wormen zijn nodig voor het bepalen van de statistische significantie tijdens de analyse. Deze test wordt meestal uitgevoerd in drievoud. Dus, een 3.2 x infectie mix en een 3.2 x control-oplossing wordt gemaakt. Deze mixen zijn gemaakt om iets meer dan 3 x het origineel om ervoor te zorgen dat een volledige 20 µL is uitgezaaid op elke plaat, waardoor ruimte voor fouten. Deze master mix wordt gemaakt omdat de keelholte van de worm te klein tijdens de eerste larvale stadia (L1-L3 is) te consumeren C. albicans. Voor blootstelling aan farmacologisch agentia zoals fluconazol ( figuur 3B), is de agent ingevoerd om het mengsel van de infectie. De concentratie van de agent is empirisch bepaald. Bijvoorbeeld in figuur 3B, 50 µM Fluconazol is vertegenwoordigd, maar 0, 12,5, 25, 50 en 100 µM fluconazol waren ook getest met behulp van hetzelfde protocol.
- Voor controle platen, maak een master mix door vervanging van het volume van C. albicans cultuur met steriel water. Zaad van 20 µL van infectie mix of OP50 control-oplossing op de platen van de centrum van NGM met behulp van een micropipet.
8. Analyse van de vervormd anale regio (Dar) fenotype en Survival Assay
- visualiseren het fenotype Dar
Opmerking: Dar is beste gevisualiseerd in de L3-stadium en daarbuiten. Dar presenteert als een klein uitsteeksel in de post anale regio van de worm ( figuur 2A), die meer op de voorgrond na verloop van tijd wordt.- Bevestigen als een dier heeft Dar door snel te tikken op de plaat in het werkgebied van de dissectie-Microscoop; dieren zonder Dar wil verplaatsen achteruit onmiddellijk, terwijl de dieren met Dar zal beide noodzaak herhaald rondes van te onttrekken om te keren hun richting, of ze zal niet doen helemaal.
- Survival assay
- volledige ei voorbereiding zoals eerder beschreven in protocol stap 6, " ei voorbereiding ". Tellen de eieren onder het toepassingsgebied van de dissectie en de ei-oplossing met M9 verdund tot een concentratie van ongeveer 5-6 gezonde eieren per µL is bereikt. Met behulp van een precisiepipet, afzien 20 µL monster met ongeveer 30 eieren op bereid NGM bord, in het gebied tussen de bacteriecultuur en de zijkant van de plaat (worm Tüte, OP50, zijn op twee verschillende plekken).
- Incubate platen bij 20 ° C gedurende 48 uur. Onder een Microscoop dissectie, tellen het aantal levende en dode volwassen wormen op elke plaat, alsmede het aantal wormen met Dar. Opnemen van het percentage met Dar.
- Overwegen een dier dood als het reageert niet op afgeluisterd op het hoofd door een aluminium draad of op de plaat te onttrekken.
- Om de andere dag, overdracht van resterende volwassen wormen door plukken zoals beschreven in het protocol stap 5, " Chunking en plukken wormen, " op een nieuwe infectie of besturingselement bord. Op dit punt, indien nodig, een survival-test uitvoeren door het bijhouden van het aantal ontbrekende, levende en dode wormen elke dag.
Opmerking: Deze test werkt voor twee weken, beginnend met ei voorbereiding. Bovendien, de ei-oplossing moet niet achterwege worden gelaten op de bacteriële cultuur, zoals de oplossing kan sporen bevatten van bleekmiddel die de OP50 kan doden. De oplossing moet ook worden afgezien van ongeveer 0,5 cm van de rand van de plaat, zoals eieren tussen de zijkanten van de plaat en de agar geplakt kunnen worden. Bovendien, als gevolg van de snelle verspreiding van wormen, overdracht van volwassenen op nieuwe borden is van cruciaal belang om ze te scheiden van hun nageslacht.
- Analyseren Survival
- analyseren van de resultaten met behulp van software van de analyse van de kromme van overleving (Zie materiaallijst).
- Vergelijk survival krommen met behulp van de methode Grehan-Breslow-Wilcoxon (ervan uitgaande dat de gegevens uit de vroege tijden van overleving nauwkeuriger dan latere tijden zijn, gewicht de gegevens dienovereenkomstig) evenals Logrank statistische hulpmiddelen 45.
Opmerking: Bijvoorbeeld in figuur 4B -C, het voortbestaan van wormen met mutant C. albicans behandeld wordt vergeleken met degenen behandeld met isogene wild-type besturingselementen of complementarystrains.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een pathogenese assay (Figuur 1) met C. albicans en C. elegans is eerder beschreven door onze lab17,18 en andere labs19,20. We tonen de inschikkelijkheid van het gebruik van C. elegans om te studeren C. albicans virulentie waaruit bleek dat C. albicans cellen snel door de wormen zijn ingenomen en zich ophopen in de intestinale lumen veroorzaakt tragere motoriek, vervormd anaal regio (Dar) (figuur 2A), zwelling van de vulva (figuur 2B), distentie van de darm (figuur 3A), en de letaliteit (Figuur 3, Figuur 4). Wij meten ook de levensduur van besmette wormen als een kwantitatieve meting van fitness. C. elegans besmet met C. albicans leeft bijvoorbeeld 10-12 dagen, vergeleken met 20-22 voor niet-geïnfecteerde besturingselementen. In C. elegans besmet met het C. albicans dubbele knock out mutant, efg1/efg1 cph1/cph1, die twee belangrijke Virulentiefactoren die nodig zijn voor infectie in muis, ratten en mens epitheliale modellen21, 23, nematoden overleefde aanzienlijk langer dan besturingselementen (figuur 3B). Deze experimenten suggereren dat sommige van de lessen die wij in dit eenvoudiger model over C. albicans virulentie leren geldig in hogere zoogdieren en vice versa blijven kan.
We laten ook zien dat de nematode modelsysteem kunnen farmacologisch gemoduleerde (figuur 3B). In aanwezigheid van fluconazol, de meest voorgeschreven antischimmel drug, overleefde de wormen uitgedaagd met C. albicans aanzienlijk langer dan de besturingselementen. Dit bewijs van beginsel experiment suggereert dat de nematode model kan worden gebruikt voor kleine molecuul screening. Inderdaad, onze C. elegans model was instrumenteel in het identificeren van filastatin, een klein molecuul remming van verschillende aspecten van schimmel virulentie24.
Ziekte fenotypes en microscopische analyse van C. elegans infectie
C. elegans waren blootgesteld aan C. albicans gedurende een periode van zes dagen en waargenomen voor tekenen van infectie, progressie van de ziekte, en dood. Het Dar fenotype is meest zichtbare op dag 4 van de overleving assay, zoals opgemerkt door een uitstekende anale gebied, dat is niet zichtbaar in het niet geïnfecteerde dier (figuur 2A). Wormen geïnfecteerd door C. albicans zijn ook bekend te vertonen zwelling in het vulva gebied (figuur 2B). In beide gevallen is de worm niet in staat om de infectie na het bereiken van deze etappe. Om te visualiseren kolonisatie van C. albicans in de intestinale lumen, werden wormen gevoed wild-type C. albicans gelabeld met RFP, waardoor gebieden van kolonisatie te lichten rood (figuur 3A). Om deze beelden te produceren, waren wormen verdoofd op een 2% agarose pad met 0,01 M natriumazide. Wormen waren blootgesteld aan wild-type C. albicans of RFP-gelabeld C. albicans, en omgezet in 5 µM M9 buffer op de agarose pad. De agarose pad was vervolgens bedekt met een dekglaasje aan. Wormen werden beschouwd op 200 X en 400 X vergroting met behulp van een omgekeerde Microscoop met fluorescent microscopie mogelijkheden. Afbeeldingen ontstonden onder differentiële interferentie contrast (Nomarski) en epifluorescence optica. De fluorescerende beelden waren verbeterd met behulp van software (figuur 3A). Tijd serie microfoto van besmette wormen bepaald dat C. albicans de intestinale lumen gekoloniseerd door de derde dag van de assay-17. Geïnfecteerde wormen bleek ernstiger intestinale zwelling dan waargenomen in het niet-geïnfecteerde besturingselement.
Genetische en farmacologische tools om de infectie te bestuderen
Vervolgens testten wij het model met behulp van genetische en farmacologische modulatie. We testten ook eerder gedocumenteerd Virulentiefactoren die regelen hyphal overgang van C. albicans25 en is gebleken dat als belangrijk in vivo infecties van muizen en nematoden20,26 . We testten het vermogen van de wormen te overleven van de infectie veroorzaakt door C. albicans efg1/efg1 cph1/cph1 dubbele mutant. Efg1 is een zeer geconserveerd transcriptiefactor en een essentieel onderdeel van het cyclisch ADENOSINEMONOFOSFAAT/proteïne kinase A (PKA) metabolische weg. In C. albicans regelt dit traject hyphal morfogenese27, wit-dekkend schakelen28, en een arsenaal aan belangrijke virulentiefactoren. Deze virulentiefactoren omvatten Hwp1 en Hwp2, twee celwand gist-specifieke eiwitten die betrokken zijn bij hechting en biofilm vorming, Eap1, een celwand antistoffen die betrokken zijn bij de binding aan de menselijke epitheliale cellen29, en Sap5, een hydrolytische enzymen die betrokken zijn bij epitheelweefsel invasie30. Cph1 is een transcriptiefactor die vele stofwisselingsprocessen, waaronder paring, filamentation, en de vorming van de biofilm regelt en is aangetoond dat het spelen een cruciale rol in de schadelijke epitheliale cellen31 en menselijke gereconstrueerde epitheel21 . Verstoring van een van deze genen heeft een grote invloed op de virulentie en gelijktijdige verstoring van beide in cph1/cph1efg1/efg1 resultaten in virulentie van de dramatische afname van verschillende diermodellen, met inbegrip van muizen25, Drosophila 32, zebravis33,34 en nachtvlinder34. De cph1/cph1efg1/efg1 dubbele mutant wordt beschouwd door de Gemeenschap C. albicans als de avirulente stam door de definitie en de gouden standaard voor de validatie van nieuwe modelsystemen. De efg1Δ en cph1Δ interne mutanten toonde verminderde Dar (~ 10% en ~ 50%, respectievelijk) vergeleken met het cognaat wild type, terwijl de efg1Δ cph1Δ dubbele mutant mislukt te ontlokken de Dar reactie17. Deze resultaten recapituleren het patroon van virulentie bij muizen, waar de cph1∆ mutant enigszins verzwakt is, is de mutant efg1∆ significantly verzacht en de dubbele mutant is volledig Avirulente25. Wormen geïnfecteerd met cph1/cph1 efg1 / efg1C. albicans dubbele mutant leefde statistisch significant langer dan controles (p < 0,01 voor zowel Log rang en Breslow statistische test, n = 60) suggereert dat deze twee genen vereist voor C. zijn albicans virulentie tegen C. elegans (figuur 3B).
We getest om te verkennen van de mogelijkheid van het gebruik van onze C. elegans -model voor potentiële drug screening, het effect van de toevoeging van fluconazol op het uiteindelijke resultaat van de infectie. Wij gebruikte een verscheidenheid van verschillende concentraties van fluconazol en vond dat 50 µM gaf ons de meest significante resultaten. Wormen geïnfecteerd met C. albicans en 50 µM Fluconazol (figuur 3B) leefde statistisch significant langer dan controles (p < 0,01 op zowel Log rang en Breslow statistische test, n = 60). Deze concentratie werd empirisch bepaald (Zie de opmerking aan het einde van protocol stap 7, "infectie plaat instellen"). Deze bewijs van beginsel experimenten is gebleken dat onze nematode model kan worden gebruikt voor kleine molecuul antischimmel screening. Het model was in feite behulpzaam bij de ontdekking van filastatin, een klein molecuul remming van verschillende aspecten van schimmel virulentie die momenteel verder Preklinische studies24 ondergaat. Dienovereenkomstig, onze assay is geschikt voor het verkennen van de strategieën van de virulentie van C. albicans en farmacologische agenten.
Studie van aangeboren host reactie
Vervolgens wilden we bestuderen de wederzijdse host verdedigingen tegen ziekteverwekkers, omdat aspecten van deze aangeboren immuniteit zijn bewaard in zoogdieren11,35. Het is algemeen bekend dat C. elegans ROS op beide bacteriële en schimmelinfecties18,36,,37 als onderdeel van haar afweermechanisme produceert. ROS een biocide effect hebben op organismen invasie en een belangrijke rol spelen in het aangeboren immuniteit. zcf15/zcf15 hyper gevoeligheid voor ROS in vitro leidde ons om te veronderstellen dat de verminderde virulentie in C. elegans was te wijten aan een verminderde capaciteit om te weerstaan dat van de host gegenereerd ROS. Wij vastbesloten om onze hypothese te testen, het vermogen van zcf15/zcf15 te doden van wild-type wormen of wormen met een verminderde capaciteit voor de productie van ROS. Representatieve C. albicans mutant zcf15 die gevoelig is voor reactieve zuurstof soorten (figuur 4A) toonde verminderde virulentie in wild-type C. elegans. C. elegans reageert op inname van pathogen door overlegging van de extracellulaire ROS in de intestinale lumen via Ce-Duox1, een NADPH oxidase gecodeerd door de gene bli-3. Tijdens de productie van ROS produceren de intestinale cellen ook intracellulaire antioxidanten via DAF-16 ter bescherming van zijn eigen weefsels van de ROS schadelijke effecten36,38. CE-Duox1 is een eiwit met een N-terminal peroxidase-domein, een C-terminal superoxide-genererende NADPH-oxidase domein en twee centrale Calmoduline-bandplaatsen39. Na microbiële infectie gebruikt dit eiwit cytosolische NADPH te genereren extracellulaire giftige ROS in de intestinale lumen om de infectie tegen te gaan. Gedurende een reeks van biochemische tests in een studie van 2009 toonde Jain et al. ROS overvloedig na infectie worden geproduceerd en dat bli-3 verlies van functie via bli-3(e767) drastisch vermindert het vermogen van nematoden te produceren ROS. Zoals blijkt uit figuur 4B, wormen uitgedaagd met zcf15/zcf15 overleefde aanzienlijk langer dan wild type of aangevuld stammen (p < 0,01 door de log-rank test) die aangeeft dat ZCF15 vereist voor virulentie is. Echter wanneer we uitgedaagd ROS-deficiënte C. elegansbli-3(e767), we verkregen kinetiek van moorden die vergelijkbaar tussen zcf15/zcf15, wild type en aangevuld stam (figuur 4C waren). Dit bewijs geeft aan dat zcf15/zcf15 niet aan het doden van nematoden, tenzij de host's vermogen om te produceren ROS in het gedrang komt. Samen genomen, suggereren deze resultaten dat ZCF15 vereist voor volledige virulentie is en ROS dat dit gen waarschijnlijk betrokken is bij het pathogene agens oplevert kunnen weerstaan host worden gegenereerd. Tot de beste van onze kennis is dit de eerste keer dat ZCF15 is aangetoond te worden betrokken bij de pathogeniteit en ROS weerstand.
Figuur 1: Een schematische voorstelling van C. elegans infectie. C. elegans zijn blootgesteld aan een mix van E. coli stam OP50 en een ziekteverwekker en gemeten over een periode van 4 dagen na het bereiken van volwassenheid voor tekenen van infectie en de progressie van de ziekte.
Figuur 2: ziekte fenotypen. (A) Deformed anale regio (Dar) is zichtbaar (aangegeven met een pijl) als een zwelling in de post anale regio van besmette wormen (rechtervenster) vier dagen na blootstelling. De wormen op het linker paneel zijn niet-geïnfecteerde en dienen als een besturingselement. (B) een subset (~ 15%) van de besmette wormen Toon een zwelling van de vulva (juiste paneel, aangegeven met een pijl) t.o.v. niet-geïnfecteerde controle wormen (linkerdeel) waarmee gedissemineerde infectie resulteert in de matricidal dood. Alle beelden werden genomen zoals beschreven in de representatieve resultaten18.
Figuur 3: Het C. albicans - C. elegans model is vatbaar voor microscopische manipulatie, en kan worden farmacologisch en genetisch gemoduleerd. (A) C. albicans gelabeld met RFP accumulatie in de nematode intestinale lumen dag 3 post infectie. Gistcellen snel door de wormen zijn ingenomen en zich ophopen in de intestinale lumen volledig intact, waaruit blijkt dat ze kunnen overleven het mechanische neerslaan van de keelholte. Beelden werden genomen zoals beschreven in de representatieve resultaten18. (B) Kaplan-Meier overleving curven van nematoden uitgedaagd met wild-type C. albicans, cph1/cph1efg1/efg1 dubbele mutant of wild-type C. albicans + 50 µM van fluconazol vergeleken met niet-geïnfecteerde controle wormen.
Figuur 4. ZCF15 is vereist om te weerstaan aan C. elegans gegenereerd ROS. (A) ZCF15 is verantwoordelijk voor een wild type weerstand tegen paraquat, waarvan bekend is dat het genereren van reactieve zuurstof soorten. Wild type, knock-out of aangevuld stammen werden geteeld in vloeibare cultuur overnachting en geresuspendeerde aan OD = 1. Culturen waren elke verdunde 1:5 en vergulde op YPD of YPD met 1 mM paraquat. C. elegans produceren ROS via bli-3 ter bestrijding van ziekteverwekkers die de intestinale lumen38binnenvallen. (B) Kaplan-Meier overleving krommen tonen dat ZCF15 schrapping het doden van wild-type wormen beperkt. (C) de Kaplan-Meier overleving curve toont vergelijkbare tarieven van overleving tussen zcf15/zcf15, wild type en aangevuld stam wanneer ROS-deficiënte C. elegansbli-3(e767) waren besmet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De methoden voor de keuring van C. elegans infectie en overleving over levenslange blootstelling aan C. albicans die wij hebben beschreven kunnen worden aangepast voor het testen van een ander pathogeen. Vloeibare culturen van andere bacteriën of schimmels kunnen worden gemaakt en geschikt voor vervoedering aan C. elegans op een vergelijkbare manier. Bovendien, seriële infecties kunnen worden bepaald door eerst de larve tot een pathogeen bloot te stellen zoals beschreven, en vervolgens de dieren op een nieuw bord met een aparte pathogen na het bereiken van volwassenheid.
Terwijl het uitvoeren van deze test, is het belangrijk zorgvuldig aandacht besteden aan timing. Eerst, bij het voltooien van voorbereiding ei eieren voor de bepaling van de oogst, het is cruciaal voor het beperken van de hoeveelheid tijd die de eieren zijn blootgesteld aan het bleekmiddel. De hoeveelheid tijd die nodig is om te ontbinden volwassenen in de bleekwater oplossing om de eieren los varieert. Onmiddellijk na de bleekwater oplossing beheert, moet de worm-oplossing nauw onder een Microscoop dissectie worden bekeken. Zodra ongeveer 70% van de wormen hebben uiteengevallen, moet de oplossing worden gecentrifugeerd. Als ei voorbereiding geen levensvatbare eieren oplevert, verminderen de concentratie van het bleekmiddel of de duur van blootstelling aan het bleekmiddel. Bij de voltooiing van deze test, is het ook van cruciaal belang dat aandacht wordt besteed aan de overdragende volwassen wormen op nieuwe borden zo nodig om te voorkomen dat verwarrend onderzoek onderwerpen met hun nakomelingen. Beperking van het aantal eieren uitplaten aan het begin van de test op 25-30 eieren moet dit ook voorkomen. Ten slotte, overdracht van volwassen wormen op nieuwe borden vaak ook vermindert de kans op wormen kruipen omhoog de kanten van de petrischaal en sterven.
We hebben Caenorhabditis elegans als een host veelzijdig model voor het bestuderen van pathogene of commensale relaties tussen microben of een microbe en haar gastheer gebruikt. Ons systeem kan worden gebruikt als hulpmiddel voor de studie van microbiële of host-microbe interactie op de cellulaire en moleculaire niveau met behulp van voorwaartse en omgekeerde genetische benaderingen, maar ook voor het verkennen van nieuwe moleculen voor therapeutische interventie. We hebben laten zien van de veelzijdigheid van dit systeem door het uitvoeren van een genetische scherm ter identificatie van genen die bijdragen aan de virulentie40, die verband houden met microbiële fitness41, die host reactie op microben17, bemiddelen 18, alsmede met behulp van het model voor hoge doorvoer toepassingen voor drug discovery24. Dit is een goed model voor gebruik door studenten, want het hoeft niet duur infrastructuur om koloniën, gezien het feit dat dieren kunnen cryo-bewaard voor toekomstige toepassingen. Ten slotte, biedt dit een perfecte "bemiddelaar" in vitro studies en lymfkliertest modellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd uitgevoerd en ondersteund door Worcester Polytechnic Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar (granulated, bacterilogical grade) | Apex BioResearch Products | 20-248 | |
| Aluminum Wire (95% Pt, 32 Gauge) | Genesee Scientific | 59-1M32P | |
| Axiovision Zeiss Inverted Microscope | Axiovision Zeiss | ||
| Bacto-Peptone | Fisher BioReagants | BP1420-500 | |
| C. elegans strain Bli-3 | Caenorhabditis Genetics Center | Bli-3(e767) CB767 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP51-250 | |
| Cholesterol, Sigma Grade, minimum 99% | Sigma | C8667-25G | |
| Disposable Culture Tubes (20 x 150 mm) | FIsherBrand | 14-961-33 | |
| Dissection Microscope (NI-150 High Intensity Illuminator) | Nikon Instrument Inc. | ||
| E. coli | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| GraphPad Prism (Survival Curve Analysis Software) | GraphPad Software | ||
| LB Broth (Miller's) | Apex BioResearch Products | 11-120 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | 10034-99-8 | |
| Medium Petri Dishes (35 X 10 mm) | Falcon | 353001 | |
| Potassium Phosphate monobasic | Sigma | P0662-500G | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium Phosphate | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Wildtype C. albicans SC5314 | ATCC | SC5314 | |
| Wildtype C. elegans | Caenorhabditis Genetics Center | N2 |
References
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Ellis, H. M., Horvitz, H. R. Genetic control of programmed cell death in the nematode C. elegans. Cell. 44 (6), 817-829 (1986).
- Hengartner, M. O., Ellis, R. E., Horvitz, H. R. Caenorhabditis elegans gene ced-9 protects cells from programmed cell death. Nature. 356 (6369), 494-499 (1992).
- Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans. Dev Biol. 56 (1), 110-156 (1977).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Kong, C., Yehye, W. A., Abd Rahman, N., Tan, M. W., Nathan, S. Discovery of potential anti-infectives against Staphylococcus aureus using a Caenorhabditis elegans infection model. BMC Complement Altern Med. 14, 4 (2014).
- Marsh, E. K., May, R. C. Caenorhabditis elegans, a model organism for investigating immunity. Appl Environ Microbiol. 78 (7), 2075-2081 (2012).
- Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nat Rev Drug Discov. 5 (5), 387-398 (2006).
- Sem, X., Rhen, M. Pathogenicity of Salmonella enterica in Caenorhabditis elegans relies on disseminated oxidative stress in the infected host. PLoS One. 7 (9), e45417 (2012).
- Irazoqui, J. E., et al. Distinct pathogenesis and host responses during infection of C. elegans by P. aeruginosa and S. aureus. PLoS Pathog. 6, e1000982 (2010).
- Kim, D. H., et al. A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity. Science. 297 (5581), 623-626 (2002).
- Bae, T., et al. Staphylococcus aureus virulence genes identified by bursa aurealis mutagenesis and nematode killing. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (33), 12312-12317 (2004).
- Couillault, C., et al. TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM. Nat Immunol. 5 (5), 488-494 (2004).
- Aballay, A., Drenkard, E., Hilbun, L. R., Ausubel, F. M. Caenorhabditis elegans innate immune response triggered by Salmonella enterica requires intact LPS and is mediated by a MAPK signaling pathway. Curr Biol. 13 (1), 47-52 (2003).
- Kesika, P., Balamurugan, K. Studies on Shigella boydii infection in Caenorhabditis elegans and bioinformatics analysis of immune regulatory protein interactions. Biochem Biophys Acta. 1824 (12), 1449-1456 (2012).
- Cinar, H. N., et al. Vibrio cholerae hemolysin is required for lethality, developmental delay, and intestinal vacuolation in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 5 (7), e11558 (2010).
- Jain, C., Pastor, K., Gonzalez, A. Y., Lorenz, M. C., Rao, R. P. The role of Candida albicans AP-1 protein against host derived ROS in in vivo models of infection. Virulence. 4 (1), 67-76 (2013).
- Jain, C., Yun, M., Politz, S. M., Rao, R. P. A pathogenesis assay using Saccharomyces cerevisiae and Caenorhabditis elegans reveals novel roles for yeast AP-1, Yap1, and host dual oxidase BLI-3 in fungal pathogenesis. Eukaryot Cell. 8 (8), 1218-1227 (2009).
- Tampakakis, E., Okoli, I., Mylonakis, E. A C. elegans-based, whole animal, in vivo screen for the identification of antifungal compounds. Nat. Protoc. 3 (12), 1925-1931 (2008).
- Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M., Mylonakis, E. Candida albicans infection of Caenorhabditis elegans induces antifungal immune defenses. PLoS Pathog. 7 (6), e1002074 (2011).
- Dieterich, C., et al. In vitro reconstructed human epithelia reveal contributions of Candida albicans EFG1 and CPH1 to adhesion and invasion. Microbiology. 148 (Pt 2), 497-506 (2002).
- Chen, C. G., et al. Non-lethal Candida albicans cph1/cph1 efg1/efg1 transcription factor mutant establishing restricted zone of infection in a mouse model of systemic infection. Int J Immunopathol Pharmacol. 19 (3), 561-565 (2006).
- Ricicova, M., et al. Candida albicans biofilm formation in a new in vivo rat model. Microbiology. 156 (Pt 3), 909-919 (2010).
- Fazly, A., et al. Chemical screening identifies filastatin, a small molecule inhibitor of Candida albicans adhesion, morphogenesis, and pathogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (33), 13594-13599 (2013).
- Lo, H. J., et al. Nonfilamentous C. albicans mutants are avirulent. Cell. 90 (5), 939-949 (1997).
- Koh, A. Y., Kohler, J. R., Coggshall, K. T., Van Rooijen, N., Pier, G. B. Mucosal damage and neutropenia are required for Candida albicans dissemination. PLoS Pathog. 4 (2), e35 (2008).
- McDonough, K. A., Rodriguez, A. The myriad roles of cyclic AMP in microbial pathogens: from signal to sword. Nat Rev Microbiol. 10 (1), 27-38 (2011).
- Sonneborn, A., Tebarth, B., Ernst, J. F. Control of white-opaque phenotypic switching in Candida albicans by the Efg1p morphogenetic regulator. Infect Immun. 67 (9), 4655-4660 (1999).
- Li, F., Palecek, S. P. EAP1, a Candida albicans gene involved in binding human epithelial cells. Eukaryot Cell. 2 (6), 1266-1273 (2003).
- Staib, P., Kretschmar, M., Nichterlein, T., Hof, H., Morschhauser, J. Transcriptional regulators Cph1p and Efg1p mediate activation of the Candida albicans virulence gene SAP5 during infection. Infect Immun. 70 (2), 921-927 (2002).
- Korting, H. C., et al. Reduced expression of the hyphal-independent Candida albicans proteinase genes SAP1 and SAP3 in the efg1 mutant is associated with attenuated virulence during infection of oral epithelium. J .Med Microbiol. 52 (Pt 8), 623-632 (2003).
- Chamilos, G., et al. Drosophila melanogaster as a facile model for large-scale studies of virulence mechanisms and antifungal drug efficacy in Candida species. J Infect Dis. 193 (7), 1014-1022 (2006).
- Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth. Eukaryot Cell. 10 (7), 932-944 (2011).
- Brennan, M., Thomas, D. Y., Whiteway, M., Kavanagh, K. Correlation between virulence of Candida albicans mutants in mice and Galleria mellonella larvae. FEMS Immunol Med Microbiol. 34 (2), 153-157 (2002).
- Mallo, G. V., et al. Inducible antibacterial defense system in C. elegans. Curr Biol. 12 (14), 1209-1214 (2002).
- Chavez, V., Mohri-Shiomi, A., Maadani, A., Vega, L. A., Garsin, D. A. Oxidative stress enzymes are required for DAF-16-mediated immunity due to generation of reactive oxygen species by Caenorhabditis elegans. Genetics. 176 (3), 1567-1577 (2007).
- Moy, T. I., Mylonakis, E., Calderwood, S. B., Ausubel, F. M. Cytotoxicity of hydrogen peroxide produced by Enterococcus faecium. Infect Immun. 72 (8), 4512-4520 (2004).
- Hoeven, R., McCallum, K. C., Cruz, M. R., Garsin, D. A. Ce-Duox1/BLI-3 generated reactive oxygen species trigger protective SKN-1 activity via p38 MAPK signaling during infection in C. elegans. PLoS Pathog. 7 (12), e1002453 (2011).
- Meitzler, J. L., Ortiz de Montellano, P. R. Caenorhabditis elegans and human dual oxidase 1 (DUOX1) "peroxidase" domains: insights into heme binding and catalytic activity. J Biol Chem. 284 (28), 18634-18643 (2009).
- Issi, L., et al. Zinc Cluster Transcription Factors Alter Virulence in Candida albicans. Genetics. 205 (2), 559-576 (2017).
- Ford, C. B., et al. The evolution of drug resistance in clinical isolates of Candida albicans. Elife. 4, e00662 (2015).
- Naglik, J. R., Fidel, P. L., Odds, F. C. Animal models of mucosal Candida infection. FEMS microbiology letters. 283 (2), 129-139 (2008).
- Garsin, D. A., et al. A simple model host for identifying Gram-positive virulence factors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (19), 10892-10897 (2001).
- Sifri, C. D., Begun, J., Ausubel, F. M., Calderwood, S. B. Caenorhabditis elegans as a Model Host for Staphylococcus aureus Pathogenesis. Infection and immunity. 71 (4), 2208-2217 (2003).
- Jain, C., Yun, M., Politz, S. M., Rao, R. P. A pathogenesis assay using Saccharomyces cerevisiae and Caenorhabditis elegans reveals novel roles for yeast AP-1, Yap1, and host dual oxidase BLI-3 in fungal pathogenesis. Eukaryotic cell. 8 (8), 1218-1227 (2009).
