Generatie van discriminatoire menselijke monoklonale antistoffen uit zeldzame antigeen-specifieke B-cellen in bloed circuleert

Summary

Beschrijven we een methode voor de productie van menselijke antilichamen specifiek voor een antigeen van belang vanaf zeldzame B-cellen die in menselijk bloed circuleren. Generatie van deze natuurlijke antilichamen is efficiënt en snel, en de verkregen antilichamen kunnen onderscheid maken tussen sterk verwante antigenen.

Abstract

Monoclonal antilichamen (mAbs) zijn krachtige instrumenten nuttig voor zowel fundamenteel onderzoek en medische biologie. Hun hoge specificiteit is onmisbaar wanneer het antilichaam moet onderscheid worden gemaakt tussen sterk verwante structuur (b.v., een normaal eiwit en een gemuteerde versie ervan). De huidige manier van het genereren van dergelijke discriminerende mAbs omvat uitgebreide screening van meerdere B Ab-producerende cellen, die is zowel duur en tijdrovend. Wij stellen hier een snelle en kosteneffectieve methode voor de generatie van discriminatoire, volledig mens mAbs vanaf menselijk bloed circuleren van B-lymfocyten. De originaliteit van deze strategie is te wijten aan de celselectie specifiek antigeen bindende B gecombineerd met de contra selectie van alle andere cellen, met behulp van gemakkelijk beschikbare perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC). Zodra bepaalde B-cellen geïsoleerd zijn, worden cDNA (bijkomende deoxyribonucleic acid) sequenties codering voor de overeenkomstige mAb verkregen met behulp van eencellige Reverse transcriptie-polymerasekettingreactie (RT-PCR) technologie en vervolgens uitgedrukt in mens cellen. Binnen zo weinig als 1 maand is het mogelijk om te produceren milligram van hoogst discriminatoire menselijke mAbs gericht tegen vrijwel elke gewenste antigeen natuurlijk gedetecteerd door de B-cel-repertoire.

Introduction

De hier beschreven methode kan de snelle en veelzijdige productie van volledig menselijke monoklonale antistoffen (mAbs) tegen een gewenste antigeen (Ag). mAbs zijn essentiële instrumenten in veel basisonderzoek toepassingen in vitro en in vivo: stroom cytometry, histologie, westelijke bevlekken en blokkerende experimenten bijvoorbeeld. Bovendien worden mAbs gebruikt meer en meer in de geneeskunde voor de behandeling van auto-immuunziekten, kanker, en zo de besturing van transplantatie afwijzing¹. Bijvoorbeeld, werden de anti-CTLA-4 en anti-PD-1 (of anti-PD-L1) mAbs onlangs gebruikt als immuun checkpoint-remmers in kanker behandelingen².

De eerste mAbs werden geproduceerd door immunoglobuline (Ig)-afscheidende hybridomas verkregen uit de milt cellen van geïmmuniseerde muizen of ratten. Echter, de sterke immuunrespons tegen RattenUitrustingen of rat mAbs belemmert hun therapeutisch gebruik bij de mens, als gevolg van hun snelle goedkeuring en de waarschijnlijke inductie van overgevoeligheid reacties³. Om dit probleem aan te pakken, zijn dierlijke eiwitten sequenties van mAbs gedeeltelijk vervangen door menselijke degenen voor het genereren van zogenaamde Chimeer muis-mens of gehumaniseerd antilichamen. Deze strategie vermindert echter slechts gedeeltelijk immunogeniciteit, terwijl zowel de kosten en de tijd-schaal van de productie aanzienlijk te verhogen. Een betere oplossing is het genereren van menselijke mAbs rechtstreeks uit menselijke B-cellen en verschillende strategieën daarvoor zijn beschikbaar. Een van hen is het gebruik van bacteriofaag of gist display. Hierbij weergeven van variabele domeinen vanuit een combinatorische bibliotheek met willekeurige menselijke Ig zware en lichte kettingen op bacteriofagen of gisten en het uitvoeren van een selectie stap met behulp van het specifieke antigeen van belang. Een groot nadeel van deze strategie is dat zware en lichte kettingen willekeurig gekoppeld zijn, leidt tot een zeer grote toename in de diversiteit van de gegenereerde antilichamen. Antilichamen verkregen zijn onwaarschijnlijk overeen moeten komen met degenen die uit een natuurlijke immuunrespons tegen een bepaalde Ag voortvloeien zou. Bovendien, menselijke eiwitvouwing en posttranslationele modificaties zijn niet systematisch gereproduceerd in prokaryoten of zelfs in gisten. Een tweede menselijke mAb productiemethode is de immortalization van natuurlijke menselijke B cellen, door Epstein - Barr virusinfectie of expressie van de anti-apoptotic factoren BCL-6 en BCL-XL⁴. Echter, deze methode is alleen van toepassing op geheugencellen B en is inefficiënt, vereisen screening van talrijke mAb-producerende vereeuwigd B cellen te identificeren van de weinig (eventuele) mAb-klonen met de gewenste antigene specificiteit. De methode is dus zowel dure en tijdrovende.

Onlangs werd een nieuw protocol voor de productie van menselijke mAbs van geïsoleerde één B cellen⁵beschreven. Zij beroept zich op een geoptimaliseerde eencellige Reverse transcriptie-polymerasekettingreactie (RT-PCR) voor versterking van zowel de zware - en licht-keten segmenten van een enkele cel voor gesorteerde B-codering. Dit wordt gevolgd door het klonen en de uitdrukking van deze segmenten in een eukaryoot expressie systeem, waardoor de wederopbouw van een volledig mens mAb. Dit protocol is gebruikt met succes vanaf B cellen van gevaccineerde donoren. Cellen zijn enkele weken na de vaccinatie verkrijgen van hogere frequenties van B-cellen die gericht is tegen de gewenste Ag, en dus het beperken van de tijd die nodig is voor het screenen van⁶geoogst. Er zijn ook andere volledig menselijk mAbs verkregen uit HIV⁺ (Human Immunodeficiency Virus) besmette patiënten⁷ en melanoom patiënten⁸. Ondanks deze vooruitgang is er nog steeds geen procedure beschikbaar waarmee het isolement van de Ag-specifieke B cellen onafhankelijk van hun geheugen fenotype of frequentie.

De procedure beschreven hier leidt tot efficiënte ex vivo isolatie van menselijke circulerende B cellen op basis van hun BHG specificiteit, gevolgd door de productie van volledig menselijk antigeen-specifieke mAbs in hoog rendement en met een tijd van lage screening. De methode is niet beperkt tot de geheugencellen B of antilichaam-afscheidende B cellen na een immuunrespons veroorzaakte, maar kan ook worden toegepast op het repertoire van de B-cel menselijke naïef. Dat het werkt zelfs vanaf Ag-specifieke B-cellen aanwezig bij zeer lage frequenties is een goede indicatie van de efficiëntie. Het uitgangspunt van de methode is als volgt: perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) zijn gekleurd met twee tetramers het antigeen van belang presenteren, elk gemarkeerd met een verschillende fluorescerende (b.v.Phycoerythrin (PE) en Allophycocyanin (APC)), en een derde tetrameer presenteren een verwant antigeen geconjugeerd met een derde fluorescerende (bijvoorbeeldBrillant Violet 421 (BV421)). Om te verrijken voor antigeen-bindende cellen, cellen worden vervolgens geïncubeerd met kralen met anti-PE gecoat en anti-APC Abs, en in cel scheiding kolommen gesorteerd. De Fractie van de cel PE⁺ APC⁺ is geselecteerd, gekleurd met een scala aan mAbs specifiek voor verschillende PBMC celtypes toe te staan van de identificatie van B-cellen, en onderworpen aan stroom cytometry cel sorteren. B-cellen die PE⁺ en APC⁺, maar briljante Violet^-, zijn geïsoleerd. Deze stap selecteert tegen cellen die geen B-cellen of niet binden aan de tetramerized antigeen, maar binden aan PE of APC (deze cellen zullen PE^{+ -} APC of PE^- APC⁺) of aan het deel van de niet-antigeen van de tetramers gebruikt (deze cellen zullen BV421⁺). B-cellen niet zeer specifiek voor de epitoop van belang zijn ook contra geselecteerd bij deze stap (deze cellen zullen ook BV421⁺). Dus, kan deze methode zeer specifieke B-cellen, uiting van B-cel receptoren (BCRs) te discrimineren tussen twee zeer nauw verwante antigenen kunnen zuiveren. Enkele specifieke B-cellen worden verzameld in buizen en hun PCR-versterkte Ig cDNAs (complementaire deoxyribonucleic zuren) wordt gekloond en wordt geuit door een menselijke cellijn als secreted IgG mAbs.

Als een proof of concept, deze studie beschrijft de efficiënte generatie van menselijke mAbs, die herkennen een peptide gepresenteerd door een grote histocompatibility complex klasse ik (MHC-ik) molecuul en kan onderscheid maken tussen dit peptide en andere peptiden geladen op dezelfde MHC-ik allel. Hoewel het niveau van complexiteit van deze Ag is belangrijk, kunt met deze methode (i) hoge opbrengst herstel van Ag-specifieke mAbs; (ii) de productie van mAbs staat te discrimineren tussen twee structureel sluit Ags. Deze aanpak kan worden uitgebreid tot gevaccineerde en besmette patiënten zonder enige wijziging van het protocol, en ook al met succes is uitgevoerd in een gehumaniseerd rat systeem⁹. Deze studie beschrijft dus, een veelzijdige en efficiënte aanpak voor het genereren van volledig menselijk mAbs die kunnen worden gebruikt in basisonderzoek en immunotherapie.

Protocol

Alle perifere bloedmonsters werden anonieme volwassen donoren verkregen na de geïnformeerde toestemming, volgens de plaatselijke ethische Commissie (Etablissement Français du Sang, EFS, Nantes, procedure PLER NTS-2016-08).

1. isolatie van perifere bloed mononucleaire cellen

Opmerking: Grondstof kunnen totale perifere bloed of cytapheresis monsters. Monsters mag niet ouder zijn dan 8 h en aangevuld met anticoagulantia (b.v., heparine).

1. Verdun bloed met 2 delen (perifere bloed) of 5 volumes (monster cytapheresis) van RPMI (Roswell Park Memorial Instituut) medium.
2. Zorgvuldig laag 35 mL verdunde celsuspensie op 15 mL van de kleurovergang medium dichtheid in een conische buis van 50 mL. Breng zo veel buizen waar nodig voor het distribueren van alle het verdunde bloed. Centrifugeer bij 1290 x g gedurende 25 minuten bij kamertemperatuur in een swingende-emmer rotor met rem af.
3. Zorgvuldig gecombineerd de mononucleaire cellaag op het raakvlak tussen het verloop medium dichtheid en de plasma laag, en de cellen naar een nieuwe conische tube van 50 mL.
4. Vullen van de buis met RPMI medium, meng samen en centrifugeer bij 1290 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder voorzichtig het supernatant.
5. Resuspendeer de pellet cel in 20 mL van RPMI medium en centrifuge bij 200 x g gedurende 10 minuten te verwijderen van de bloedplaatjes. Verwijder voorzichtig het supernatant. Herhaal deze stap eenmaal.
6. Resuspendeer de pellet cel in RPMI medium met 10% foetale boviene Serum (FBS).
   Opmerking: Ga direct naar tetrameer labeling of houden cellen bij 4 ° C's nachts bij een concentratie van 10⁷ cellen/mL.

2. tetrameer-geassocieerde magnetische verrijking van Ag-specifieke B-cellen

1. Ag-tetramers voor te bereiden door het toevoegen van beide PE of APC-geëtiketteerden premium grade streptavidine of BV421-label daar bij een molaire verhouding van 1:4 tot en met biotinyleerd antigeen monomeren. Voeg de juiste hoeveelheid daar-conjugate in drie aparte gedeelten, één aliquot iedere 10 minuten bij kamertemperatuur toevoegen.
2. Distribueren van cellen (maximaal 3 x 10,⁸ per buis) in 15 mL conische buisjes samen en centrifugeer bij 460 x g gedurende 5 min.
   Opmerking: Het volgende protocol is voor één buis.
3. Resuspendeer de pellet cel in 200 µL van PBS (Phosphate Buffered Saline) met 2% FBS. PE-, APC- en BV421-geconjugeerde tetramers, elk met een eindconcentratie van 10 µg/mL toevoegen. Meng goed en laat 30 minuten bij kamertemperatuur inwerken.
4. Bereiden van ijskoude cel scheiding buffer (SB) met behulp van PBS met 0,5% BSA (bovien serumalbumine) en EDTA (ethyleendiamminetetra zuur) 2 mM.
5. Voeg 10 mL SB. Pellet cellen door centrifugeren bij 460 x g gedurende 5 min.
6. Resuspendeer de cellen in 500 µL van ijskoude SB. toevoegen 50 µL van anti-PE en 50 µL van anti-APC magnetische microbeads.
7. Meng goed en incubeer gedurende 20 min bij 4 ° C.
8. Herhaal stap 2.5 tweemaal.
9. Het supernatant zorgvuldig elimineren andresuspend de cel pellet bij een concentratie van 2 x 10⁸ cellen/mL in ijs koud SB.
10. Een grote magnetische kolom geplaatst op een magneet met 3 mL SB equilibreer.
11. Overdracht celsuspensie van 2.9 op de bovenkant van de equilibrated kolom en laat ze uitlekken volledig. KRITIEKE stap: Voorkom samendoen van de kolom, passeren cellen een 70 µm nylon gaas.
12. Spoel de buis die de cellen met 3 mL ijs koud SB en overdracht van de buffer rechtstreeks op de kolom (in geval van filtratie, spoel de 70 µm nylon gaas).
13. De buffer is volledig gedraineerd in de kolom, voeg een andere 3 mL van ijs koud SB naar de kolom.
14. Herhaal stap 2.13 voor een andere 3 mL wassen.
15. Verwijder de kolom uit de magneet en plaats over een conische verzamelen buis 15 mL.
16. Voeg 5 mL van de koude SB ijs op de top van de kolom en onmiddellijk spoelen de cellen uit de kolom met behulp van de zuiger. Herhaal deze stap eenmaal.
17. Centrifugeer de verzamelde cellen (verrijkte relevante tetrameer positieve cel Fractie) bij 460 x g gedurende 5 min en ga naar extra antilichaam kleuring.
    Opmerking: Zwembad bijeengezocht cellen uit alle buizen, indien van toepassing.

3. verkleuring van de Ag-specifieke menselijke B-cellen en cel sorteren

1. Resuspendeer de pellet van de cel met een cocktail van anti-menselijke antilichamen tegen CD3 (eindverdunning: 1:20), CD19 (1:20), CD14 (1:50), CD16 (1:50), en 7AAD (1:1000) in een eindvolume van 100 µL van PBS met 2% FBS. Incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
2. Voeg 10 mL PBS naar cellen, centrifuge op 460 x g gedurende 5 minuten, en elimineren de bovendrijvende substantie. Herhaal deze stap eenmaal. Resuspendeer de pellet cel in 200 µL van PBS, filter op 70 µm nylon gaas.
3. Ga verder met het sorteren van bepaalde B-cellen op het niveau van de eencellige op de sorter cytometer van een cel met een 100 µm-mondstuk en een druk van 20 psi zonder meer dan 1000 evenementen/s⁹.
   Opmerking: De gating strategie gebruikt is afgebeeld in Figuur 1. Cellen werden voor het eerst gated op CD14^-CD16^-7AAD^- cellen monocyten, NK, en dode cellen (niet afgebeeld in Figuur 1) te sluiten. Vervolgens CD19⁺ B cellen werden geselecteerd voordat het gating op dubbele gekleurde cellen door PE en APC relevante Ag-tetramers. Niet-specifieke B-cellen werden uitgesloten door het gating op BV421 negatieve cellen (onbevlekt door irrelevante Ag-tetrameer).
4. Één B-cellen in 8-strip PCR buizen eerder gevuld met 10 µL van 1 x PBS en 10 eenheden van RNAse remmer en geplaatst op een rek voor 96 slangen verzamelen. Onmiddellijk bevriezen de PCR-buizen bij-80 ° C.
   Opmerking: De soort maskers gekozen op het cytometer-instrument zijn opbrengst masker: 0, zuiverheid masker: 32, en fase masker: 0. deze eencellige borg kon worden aangepast aan een 96 - of 384-well PCR plaat, indien nodig. Één B-cellen zo spoedig mogelijk moeten worden bevroren en kunnen worden overgelaten aan-80 ° C voor enkele weken, indien nodig.

4. eencellige RT-PCR

1. Lyse cellen door rechtstreeks de bevroren monsters in PCR strips bij 70 ° C gedurende 5 minuten in een droge bad Verwarming.
2. Overdracht van strips om ijs en overgaan tot reverse transcriptie (RT) door toevoeging van 10 µL per buis van een 2 x master mix buffer met 1 mM dNTP, 25 µg Mo/mL oligod(T) inleidingen, 5 µM willekeurige hexamers, 20 eenheden van RNAse remmer en 400 eenheden van reverse-transcriptase.
   Opmerking: Na cel ontdooien, RT moet worden uitgevoerd snel om te voorkomen dat de aantasting van het RNA.
3. Incubeer bij 25 ° C gedurende 5 minuten om willekeurige hexamers te vermengen, Incubeer gedurende 1 uur bij 50 ° C, en eindig met een incubatie bij 95 ° C gedurende 3 minuten om te stoppen met de reactie.
4. Ga verder met twee rondes van geneste PCR versterking voor elk van de regio's-codering voor variabele zware (vH) en de kappa (vLκ) of de lambda lichte kettingen (vLλ).
   Opmerking: Als alternatief, RT monsters kunnen worden bevroren bij-20 ° C en gedurende één week.
   1. Voor de eerste ronde van PCR, voeg 3 µL van cDNA voor een 40 µL eindvolume met 1,5 mM MgCl₂, 0,25 mM dNTPs, 2,5 eenheden van de Polymerase van DNA en 200 nM buitenste inleidingen (Zie Figuur 2 en Tabel van materialen voor primer sequenties).
      Opmerking: Samenstelling van de buitenste inleidingen mix. Voor zware ketting versterking: 4 inleidingen (5' LVH mix) vooruit en 2 achteruit inleidingen (3' CµCγ mix). Voor lichte kappa keten versterking, 3 toekomen inleidingen (5' LV | mix) en 1 achteruit primer (3' Cκ543-566). Voor lichte lambda ketting versterking, 7 vooruit inleidingen (5' LVl mix) en 1 achteruit primer (3' Cl).
      Opmerking: Primers zijn ontworpen door Tiller, et al. voor versterking van alle de zware en lichte keten familie genen⁵.
   2. De volgende fietsen voorwaarden: 94 ° C gedurende 4 minuten, gevolgd door 40 cycli van 30 bij 94 ° C, 30 s s bij 58 ° C voor VH VLκ (60 ° C voor VLλ) en 55 bij 72 ° C, met een definitieve rek s stap bij 72 ° C gedurende 7 minuten.
   3. Voor de tweede ronde PCR, 3 µL van het eerste amplificatie product te gebruiken voor een eindvolume van 40 µL met 1,5 mM MgCl₂, 0,25 mM dNTPs, 2,5 eenheden van de polymerase van DNA en 200 nM van innerlijke primers met restrictie-enzym sites over klonen in expressie vectoren (Zie Figuur 2 en Tabel van materialen voor primer sequenties).
      Opmerking: Samenstelling van innerlijke inleidingen mix. Voor zware ketting versterking: 9 inleidingen (5' AgeIVH mix) vooruit en 3 achteruit inleidingen (3' SalIJH mix). Voor lichte kappa keten versterking, 9 toekomen inleidingen (5' AgeIV | mix) en 3 omgekeerde inleidingen (3' BsiWIJκ mix). Voor lichte lambda ketting versterking, 6 vooruit inleidingen (5' AgeIVl mix) en 1 achteruit primer (3' XhoICl).
      Opmerking: Primers zijn ontworpen door Tiller et al., voor versterking van alle van de zware en lichte keten familie genen⁵.
   4. De volgende fietsen voorwaarden: 94 ° C gedurende 4 minuten, gevolgd door 40 cycli van 30 bij 94° C, 30 s bij 58 ° C voor VH LCκ (60 ° C voor LCλ) en 45 s s bij 72 ° C met een definitieve rek stap bij 72 ° C gedurende 7 minuten.
5. Positieve wells identificeren door migreren 5 μL van PCR producten van vH, vLκ en vLλ op een 1,5% agarose gel (500 bp producten voor variabele zware ketting coderen segmenten) en een 350 bp product voor variabele lichtketting codering segmenten.
6. De resterende 35 µL PCR producten resterende positieve putjes met behulp van ultrafiltratie membranen ontworpen voor zuivering van PCR producten te zuiveren.
7. Elueer PCR producten met 60 µL van H₂O.

5. weergave klonen

1. Bereiden van Inserts
   Opmerking: Verteren 60 µL van elke gezuiverde PCR product in een eindvolume van 100 µL met de juiste restrictie-enzym-buffer.
   1. Voor vH PCR producten, 50 eenheden van AgeI en 50 eenheden van SalI toevoegen en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C.
   2. Voor vLλ PCR producten, voeg 50 eenheden van AgeI en 50 eenheden van XhoI, en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C.
   3. VLκ PCR producten, toevoegen van 50 eenheden van AgeI en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C. Zuiveren van geklaard met behulp van 96 PCR membranen en elueer met 60 µL van H₂O. Digest het 60 µL eluaat in een eindvolume van 100 µL BsiWI restrictie-enzym buffer, toevoegen van 50 eenheden van BsiWI en incubeer gedurende 1 uur bij 55 ° C.
   4. Inactivering van de enzymen door verwarming bij 80 ° C gedurende 15 minuten.
2. Voorbereiding van het uiten van vectoren
   Opmerking: vH PCR producten zijn gekloond in een vector met expressie (HCγ1) met de constante zware ketting Cγ1 van IgG1. vLκ PCR producten zijn gekloond in een vector met expressie (LCκ) met de constante lichtketting Cκ. vLλ PCR producten zijn gekloond in een vector met expressie (LCλ) met de constante lichtketting Cλ.
   1. De spijsvertering van het volgende uitvoeren:
      1. Meng 1 µg uitdrukking HCγ1 vector met 10 eenheden van AgeI en 10 eenheden van SalI enzym in een totaal volume van 20 µL van het restrictie buffer door de fabrikant aanbevolen en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C.
      2. Meng 1 µg expressie vector LCκ met 10 eenheden van enzym van de beperking van de AgeI in een totaal volume van 20 µL van het restrictie buffer door de fabrikant aanbevolen en incubeer gedurende 1 uur bij 37° C. Voeg 10 eenheden van restrictie-enzym BsiWI toe en incubeer gedurende 1 uur bij 55 ° C.
      3. Meng 1 µg expressie vector LCλ met 10 eenheden van AgeI en 10 eenheden van XhoI enzym in een totaal volume van 20 µL van het restrictie buffer door de fabrikant aanbevolen en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C
   2. Verwarm elk mengsel van de spijsvertering bij 65 ° C gedurende 10 min naar de inactivering van de enzymen van de beperking.
   3. Uitvoeren van afbinding van 5 µL van het PCR-product verteerd met 2 µL (100 ng) van overeenkomstige gelineariseerde expressie vector in een totaal volume van 20 µL 1 x DNA ligase buffer met 1 eenheid van T4 DNA-Ligase door incubatie 's nachts bij 4 ° C.
      Opmerking: U kunt ook Afbinding wordt uitgevoerd gedurende 3 uur bij 4° C.
3. Klonen
   1. Electroporate 1 µL van het mengsel afbinding 20 µL in 45 µL van zelfgemaakte electrocompetent TOP10 E. coli (huidige protocollen in moleculaire biologie, sectie 1.8.4-1.8.8). Onmiddellijk Voeg 500 µL van 2 X YT medium en in een waterbad bij 37 ° C gedurende 30 min. verspreiding getransformeerd bacteriën op 2 x YT ampicilline platen uit te broeden. Na een nacht bebroeden bij 37 ° C.
   2. Scherm voor elke transformatie, acht kolonies door PCR.
      1. Instellen van een premix van de reactie als volgt op het ijs: 45 µL van 5 x 10 µL van voorwaartse primer (voorraad 10 µM) kwekers in de vector-reeks (primer Ab-vec-gevoel), PCR Buffer, 12 µL van MgCl₂ (25 mM), 4 µL van dNTPs (uit een voorraad met 10 mM van elk) , en 10 µL van omgekeerde primer (voorraad 10 µM) gericht op de constante zware of lichte keten regio (Zie Tabel van materialen voor primer sequenties). Vul aan tot een eindvolume van 200 µL met H₂O. Voeg vervolgens 4 µL van het enzym DNA-polymerase (5 U/µL).
      2. Distribueren van 25 µL van reactie premix per 8-strip PCR buis op ijs.
      3. Gebruik een steriel tandenstoker te halen van afzonderlijke kolonies. Strijk de tandenstoker op een 2 x TY ampicilline bord vormen een repliceren bord en dompel het vervolgens in een PCR reactiebuis.
      4. Uitvoeren van de screening PCR de volgende fietsen voorwaarden: 94 ° C gedurende 10 min, gevolgd door 25 cycli van 30 bij 94 ° C, 30 s s bij 55 ° C en 50 s bij 72 ° C.
      5. Positieve bacteriën identificeren door migreren 5 µL van het PCR producten op een 1,5% agarose gel.
         Opmerking: Positieven kolonies geven een PCR product ongeveer 850 bp voor de zware ketting vector en 600 bp voor de lichtketting vector.
   3. Inoculeer vier positieve kolonies van de repliceren plaat in 2 mL van LB medium en na een nacht bebroeden bij 37 ° C met schudden bij 200 omwentelingen per minuut.
   4. Pak plasmiden uit vloeibare culturen met behulp van een plasmide zuivering kit, zoals aangegeven door de fabrikant.
   5. Controleer of de juiste invoeging van variabele domeinen door Sanger sequencing van de plasmiden met de Ab-vec-zin-primer.
      Opmerking: Plasmiden met de juiste invoegen (het coderen van de HC en de bijbehorende LC) zijn cotransfected in de 293A cellen van secretie. De specificiteit van kleine schaal geproduceerde mAbs is bepaald door ELISA. Grootschalige productie wordt vervolgens uitgevoerd indien van toepassing.

6. produktie van mAbs

1. Kleinschalige productie voor de controle op specificiteit
   1. Eergisteren de transfectie, zaad 15.000 menselijke embryonale nier 293A (HEK 293A) cellen in 200 µL van Dulbecco van bewerkt Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% FBS per putje in 96-wells-platen. Na een nacht bebroeden in een CO₂ incubator (5% CO₂) bij 37 ° C.
   2. Cotransfect van 293A cellen in DMEM medium met 10% FBS met behulp van een lineaire polyethylenimine derivaat als transfectiereagens.
      Opmerking: Voer de transfectie in triplicates. Het volgende protocol is voor één putje van een vlakke onderkant 96-wells-plaat.
      1. Verdun de 0,5 µL van DNA transfectiereagens in 10 µL van 150 mM NaCl. Verdun 0,125 µg voor vH en vL waarin vectoren 0,125 µg in 10 µL van 150 mM NaCl. Vortex elke verdunning voor 10 s.
      2. Voeg toe 10 µL verdund DNA transfectiereagens in de 10 µL DNA oplossing. Vortex 15 s en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Voeg de mix 20 µL drop-wise op 293A cellen, en meng door zachtjes zwenken van de plaat.
   3. Vervang de middellange 16 h na transfectie en cultuur cellen voor 5 dagen in serumvrij medium.
      Opmerking: Gebruik serumvrij medium om te voorkomen dat serum Igs besmetten de geproduceerde antistoffen.
   4. Cellen en puin te elimineren door middel van centrifugeren bij 460 x g gedurende 5 min.
   5. Oogst supernatant door aspiratie met een meerkanaals-pipet en ze vervolgens overbrengen naar een V-bodem 96-wells-plaat.
   6. Jas relevante Ag's nachts bij 4 ° C in 100 µL per putje van gereconstitueerde ELISA/ELISPOT coating buffer 1 x op een eindconcentratie van 2 µg/mL in 96-wells-platen voor ELISA. Zie voorbeelden in ⁹.
   7. Blok putjes met 10% FBS DMEM medium voor 2 uur bij 37 ° C
   8. Voeg 50 µL van supernatant van 293A transfected cellen uit stap 6.1.5 en incubeer gedurende 2 uur op RT.
   9. Voeg 100 µL van een anti-menselijke IgG Ab geconjugeerd met horseradish peroxidase (HRP) enzym bij 1 µg/mL en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Voeg 50 µL chromogenic substraat (TMB), en incubeer gedurende 20 min.
   10. Lezen van optische dichtheid bij 450 nm in een spectrofotometer.
       Opmerking: De specifieke mAbs geopenbaard door analyse ELISA verder kan worden geproduceerd op grote schaal en gezuiverd op eiwit een kolom presenteren affiniteit voor menselijke IgG.
2. Grootschalige productie en zuivering van specifieke mAbs
   1. Eergisteren de transfectie, zaad 6 x 10⁶ menselijke embryonale nier 293A (HEK 293A) cellen in 175 cm² flacons met 25 mL DMEM aangevuld met 10% FBS. Na een nacht bebroeden in een CO₂ incubator (5% CO₂) bij 37 ° C.
      Opmerking: De cellen moet 70% heuvels wanneer transfected.
   2. Cotransfect van 293A cellen in DMEM medium met 10% FBS met behulp van een lineaire polyethylenimine derivaat als transfectiereagens.
      1. Verdun 50 µL van DNA transfectiereagens in 450 µL van 150 mM NaCl. Verdun 10 µg voor vH en vL waarin vectoren 10 µg in 500 µL van 150 mM NaCl. Vortex 10 s elke verdunning.
      2. Verdunde DNA transfectiereagens aan de oplossing van DNA toevoegen. Vortex 15 s en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. De 1 mL mix drop-wise toevoegen aan de cellen, en meng door de erlenmeyer voorzichtig te zwenken.
   3. Vervang de middellange 16 h na transfectie en cultuur cellen voor 5 dagen in serumvrij medium.
   4. Oogst medium door zuigen met een precisiepipet 25 mL.
   5. Cellen en puin te elimineren door middel van centrifugeren bij 460 x g gedurende 5 min.
   6. Zuiveren van de antilichamen met behulp van een 1 mL kolom bekleed met EiwitA op een snelle proteïne vloeistofchromatografie (FPLC) systeem bij 4 ° C.
      1. Equilibreer het eiwit een kolom sepharose met 20 mM fosfaatbuffer (pH 7).
      2. Filter het kweekmedium cel van 6.2.5 met behulp van een 1,22 µm filter, dan is het een 0,45 µm filter.
      3. Het laden van het gefilterde medium op de kolom.
      4. Wassen met 20 mM fosfaatbuffer (pH 7) en elueer met een 0,1 M citraat buffer (pH 3.5).
      5. Lezen van optische dichtheden op 280 nm op een absorptie spectrofotometer en onmiddellijk neutraliseren eiwithoudende breuken met 1 M Tris buffer (pH 9).
   7. Dialyze gezuiverde Ab's nachts bij 4 ° C in een cassette met een 3, 5 K moleculair gewicht cutoff tegen PBS buffer (pH 7.4).
   8. Steriliseren door 0,2 µm filtratie en controle zuiverheid in grootte-uitsluiting chromatografie, zoals aangegeven door de fabrikant.

Representative Results

Vanaf PBMC van gezonde donoren, dit project presenteert de generatie van menselijke mAbs, die de peptide Pp65_{495 herkennen} (Pp65, van menselijke cytomegalovirus) gepresenteerd door de grote histocompatibility complex klasse ik (MHC-ik) molecuul HLA - A * 0201 () HLA-A2). Deze mAbs kan onderscheid maken tussen deze complex en complexen die andere peptiden geladen op de dezelfde MHC-ik molecuul.

PBMC werden gekleurd met HLA-A2/Pp65-PE, HLA-A2/Pp65-APC en HLA-A2/MelA2-BV421 tetramers zoals beschreven in het bovenstaande protocol. Na immunomagnetic cel verrijking van PE - en APC-tetrameer positieve cellen, werden de eluted cellen gekleurd met extra mAbs. Op de stroom cytometry cel sorter, magnetisch verrijkt cellen werden eerst gated op levensvatbare CD14^-CD16^-CD3^-CD19⁺ onderhemden (B-cellen). Figuur 1 toont de gating strategie gebruikt om te isoleren van de B-cellen uiten van BCRs staat te discrimineren tussen HLA-A2/Pp65 en andere gerelateerde HLA-A2/peptide complexen. Selectie van B-cellen van belang werd uitgevoerd na het gating op HLA-A2/Pp65 PE⁺ en HLA-A2/Pp65 APC⁺ dubbel-positieven, om uit te sluiten van fluorescerende specifieke B-cellen die afzonderlijk werden gekleurd PE⁺ of APC⁺. Tot slot, hoogst specifieke B-cellen werden geïdentificeerd door het gating op HLA-A2/MelA2-BV421 negatieve cellen. Hierdoor is de identificatie van B-cellen uiten van BCRs kunnen binden HLA-A2/Pp65, in een peptide en HLA-A2-afhankelijke manier, discrimineren tussen deze B-cellen en die gericht is tegen β2 microglobulin, biotine, HLA-A2 of die geen onderscheid maken tussen peptiden in de MHC bindende groef. Alle cellen van deze laatste zullen de positieve cellen BV421. Zoals eerder te zien en verder gedocumenteerd met andere soorten Ag, is deze strategie van uitsluiting belangrijker als gevolg van de stijging van het discriminerende vermogen van de B-cellen voor de Ag-⁹.

Zodra één specifieke B-cellen wordt gesorteerd, cDNAs codering voor zwaar en licht Ig-kettingen werden versterkt door RT-PCR. Paren van zwaar en licht keten codering segmenten werden verkregen in ongeveer 50% van één B cellen getest (tabel 1). Variabele domein sequenties werden vervolgens gekloond in expressie vectoren met bijbehorende constante domein sequenties (zware constante 1 en lichte constante κ of λ). Menselijke embryonale nier cellen (HEK, 293A cellen) werden cotransfected met zware en lichte keten vectoren. De secreted mAbs van IgG1 isotype zijn geoogst uit de cultuur supernatant van 293A cellen 5 dagen na de transfectie (Zie Figuur 3 voor de globale strategie van volledig menselijk mAbs productie). Dit met succes geproduceerd een HLA-A2/Pp65 specifieke antilichaam vanaf 3 enkele B-lymfocyt cellen opbrengst van paren van zwaar en licht keten codering segmenten (tabel 1). ELISA testen duidelijk aangetoond dat dit mAb beide MHC - en peptide-afhankelijk voor zijn binding aan HLA-A2/Pp65 complexen (figuur 4A was), en verscheidene milligram van mAb waren gemakkelijk geproduceerd voor verdere analyse (bijvoorbeeld, affiniteit analyses, Functionele assays). Haar bindende affiniteit, bepaald door de oppervlakte plasmon resonantie (SPR), was ongeveer 7 x 10^-6 M (figuur 4B).

Dus dit artikel beschrijft een combinatie van gevoelige en efficiënte methoden waardoor i) detectie van relevante Ag-specifieke B-cellen, zelfs wanneer bij zeer lage frequenties in het bloed van gezonde donoren en ii) de generatie van hoogst discriminatoire menselijke mAbs te presenteren.

Figuur 1: Detectie van HLA-A2/Pp65 B cellen van menselijke PBMC.
3 x 10⁸ PBMC werden gekleurd met HLA-A2/Pp65-PE, HLA-A2/Pp65-APC en HLA-A2/MelA2-BV421 tetramers. Na immunomagnetic cel verrijking van PE - en APC-tetrameer positieve cellen, werden de eluted cellen gekleurd met extra mAbs. Op een stroom cytometry cel sorter, werden cellen gated eerst op levensvatbare singlet CD14^-CD16^- lymfocyten (niet afgebeeld), klik vervolgens op CD19⁺CD3^- cellen. Vervolgens werden B cellen gekleurd met zowel HLA-A2/Pp65-PE en HLA-A2/Pp65-APC tetramers omheinde. De HLA-A2/MelA-BV421 tetrameer werd gebruikt om uit te sluiten van B-cellen die HLA-A2/Pp65, niet in een peptide en MHC-afhankelijke manier herkende.

Figuur 2: strategie voor de versterking en klonen van Ig genen. Lichte en zware Ig-keten coderen genen werden versterkt door geneste RT-PCR. Eerste PCRs werden uitgevoerd met een mix van voorwaartse inleidingen kwekers de leider regio en omgekeerde primers specifiek voor constante regio's van de passende zware, lichte kappa, of lichte lambda kettingen. Tweede PCRs werden uitgevoerd met inleidingen met beperkingsplaatsen, voorwaartse en omgekeerde inleidingen werden respectievelijk specifiek voor het begin van V segmenten en voor het einde van J segmenten. PCR producten werden sequenced, verteerd met restrictie-enzymen en gekloonde in expressievectoren met juiste constante domeinen. CMV: cytomegalovirus promotor; AmpR: resistentie gen voor ampicilline.

Figuur 3: Algemene strategie van wederopbouw van recombinante menselijke mAbs.
Een tetrameer gebaseerde sorteren strategie maakt de ontdekking van de B-cellen van belang. Zeer specifieke B-cellen zijn eencellige gesorteerd. Lichte en zware Ig-keten coderen segmenten werden versterkt met behulp van de RT-PCR. Variabele domein sequenties werden gekloond in aparte Eukaryotische expressievectoren in frame met gene segmenten codering constant lichte en zware regio's. De overeenkomstige volledig menselijk mAbs werden uitgedrukt door Transient-transfected HEK 293A cellen en gezuiverd uit de cultuur bezinken. Dit cijfer werd van Ouisse et al. gewijzigd (2017) ⁹.

Figuur 4: Karakterisering van een representatieve hoogst discriminatoire mAb tegen HLA-A2/Pp65 gegenereerd op basis van perifere bloed circuleren van B-cellen.
A) specificiteit van mAb PC1.02 tegen HLA-A2/Pp65 getest door ELISA. Platen waren bedekt met relevante (HLA-A2/Pp65) of irrelevant HLA-A2 complexen met HLA-A2-beperkte peptiden: MelA, NS3 (HCV-1), en GagP17 (HIV-1) 2 µg/mL, de mAb PC1.02 is toegevoegd en een anti-menselijke IgG-HRP Ab werd gebruikt voor de detectie. Optische dichtheid (OD) werden gelezen bij 450 nm. B) affiniteit bepaling van het mAb PC1.02 oppervlak Plasmon resonantie (SPR) via verschillende concentraties van HLA-A2/Pp65 complexen over CM5 chip-gebonden mAb stroomt. Dit cijfer werd van Ouisse et al. gewijzigd (2017) ⁹.

	Aantal PBMC	Aantal PE + APC + cellen na verrijking	Aantal uitgesloten (BV421 +) cellen	Aantal gesorteerde afzonderlijke cellen	Aantal geanalyseerde wells	Aantal putjes met HC en LC verbonden (% herstel)	MAbs geproduceerd aantal	Aantal specifieke mAbs
HLA-A2/Pp65 mAb (PC1.02)	3 x 108	818	117	161	7	3 (43%)	3	1

Tabel 1: Analyse van HLA-A2/Pp65 B cellen.
De impact van de strategie van de uitsluiting van aspecifieke B-cellen, de opbrengsten van Ig gene versterking en mAb productie van geïsoleerde HLA-A2/Pp65 B cellen werden geëvalueerd/gemeten.

Discussion

Het voorgestelde protocol is een krachtige methode voor het genereren van menselijke mAbs rechtstreeks vanuit Ag-specifieke B-cellen in het bloed circuleren. Het combineert drie belangrijke aspecten: (i) het gebruik van een tetrameer-geassocieerde magnetische verrijking, waarmee een ex vivo isolatie van zelfs zeldzame Ag-bindende B cellen; (ii) een gating strategie die gebruikmaakt van drie Ag tetramers (twee relevante enen en één irrelevant) geëtiketteerd met drie verschillende fluorochromes te isoleren, door stroom cytometry, alleen de B-cellen die zijn uiting geven aan een specifieke BHG voor de gewenste Ag; (iii) de reconstructie van de overeenkomstige recombinant mAb cDNAs door RT-PCR eencellige niveau en de uitdrukking van de cDNAs in menselijke cellen.

Eerdere studies voorgesteld met behulp van één of twee fluorescerende relevante antigenen op het etiket van menselijke B cellen voordat sorteer- en daaropvolgende productie van mAbs van de geïsoleerde^7,B cellen^6,-⁸. Een analyse bij patiënten met reumatoïde artritis, en één in een auto-immune muismodel, hebt gekoppeld een irrelevant fluorescerende antigeen karakteriseren van autoreactieve B-cellen en bepalen hun frequentie^10,11. Voor zover we weten, gebruik van een combinatie van twee fluorescerende relevante antigeen tetramers en één irrelevant antigeen tetrameer heeft niet eerder zijn beschreven voor de verrijking van bepaalde B-cellen voorafgaand aan hun gebruik voor productie van volledig menselijk mAbs. Deze geoptimaliseerde methode staat volledig menselijk discriminatoire mAbs te worden verkregen in zo weinig als een maand, en kan met succes worden uitgevoerd zelfs bij het starten van een naïef B-cel-repertoire. Dus het heeft geen van de grote nadelen van phage display, menselijke B-cel immortalization, of andere moleculaire biologie gebaseerde mAb wederopbouw procedures voor het eerder beschreven.

Deze cel Sorteren strategie resulteert in een hoge opbrengst herstel van Ag-specifieke menselijke mAbs. Paren van zwaar en licht keten segmenten van enkele geïsoleerde B-cellen worden versterkt met een slagingspercentage van rond de 50%. Lichtketting segmenten zijn bijna altijd versterkt, maar dit is niet het geval voor zware ketting segmenten. RT-PCR-efficiëntie is sterk afhankelijk van de inachtneming van de volgende punten: ik) gesorteerde één B-cellen moeten worden bevroren zo spoedig mogelijk; II) 30 eenheden van RNase remmer toe te voegen en het minimaliseren van de tijd tussen het nemen van de B-cellen uit de vriezer en lancering van de RT-reactie; III) ontdooien alle inleidingen op het ijs; IV) nooit ontdooien invriezen/inleidingen meer dan driemaal; v) kous inleidingen voor maximaal één jaar.

Met betrekking tot de productie-efficiëntie van de overeenkomstige recombinant mAbs met de gewenste specificiteit is het ongeveer 30-40% van het geval voor pMHC specifieke mAbs. Deze bijzondere mAbs moeten erkennen zowel de peptide en de MHC molecule, die is heel veeleisend, en wij hebben eerder getoond dat de totale opbrengst van de terugvordering van specifieke mAbs gericht tegen meer conventionele antigenen is superieur, omhoog tot 100% voor de Β-galactosidase antigeen⁹. Het moet worden benadrukt dat de keuze van een geschikte Ag voor de irrelevante tetrameer belangrijk is om het specifieke karakter van de mAbs geproduceerd.

De affiniteit van de anti-HLA-A2/Pp65 mAb (PC1.02) in het huidige artikel beschreven is relatief laag, ongeveer 7 x 10^-6 M, vergelijkbaar met de affiniteit van een TCR. Dit resultaat werd verwacht, zoals B cel isolatie werd uitgevoerd van naïeve donoren. Meeste tetrameer⁺ B cellen waren IgM⁺IgG^-, waardoor de kans op het verkrijgen van goede Ag-bindmiddelen. Echter kan deze methode ook mogelijk maken de sortering uit cross-reactive geheugen B cellen tegen een gewenste Ag van naïeve donoren, vanwege immunologische verleden van personen¹². Bovendien, deze methode is gemakkelijk toepasbare gevaccineerde en besmette patiënten of geïmmuniseerde gehumaniseerd dieren, zoals beschreven in ⁹, waar in vivo de rijping van de affiniteit kan vergroten dat de affiniteit van de resulterende mAbs om ongeveer 1 x 10^-9 M. verschillende ook zijn procedures ter verbetering van de affiniteit van mAbs in vitro, in het bijzonder door het reproduceren van somatische hypermutation in cellen uiten van het antilichaam (herzien in ¹³) beschreven.

Tot slot stellen wij voor een veelzijdige strategie voor de hoogst discriminatoire mAbs productie die kan worden gebruikt in verschillende soorten situaties, van een naïef individuele aan een gevaccineerde donor of een patiënt lijdt aan een auto-immuunziekte. Volledig menselijk mAbs gegenereerd op deze manier tegen een gewenste epitoop zou kunnen nuttig zowel voor fundamenteel onderzoek en immunotherapie zijn.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEK 293A cell line	Thermo Fisher scientific	R70507
DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco by life technologies	21969-035	(+) 4,5g/L D-Glucose 0,11g/L Sodium Pyruvate (-) L-Glutmine
RPMI medium1640 (1X)	Gibco by life technologies	31870-025
Bovine Serum Albumine (BSA)	PAA	K45-001
Nutridoma-SP	Roche	11011375001	100X Conc
PBS-Phosphate Buffered Saline (10X) pH 7,4	Ambion	AM9624
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) 0,5M pH=8	Invitrogen by Life Technologies	15575-020
Fetal Bovine serum (FBS)	Dominique Dutscher	S1810-500
Ficoll - lymphocytes separation medium	EuroBio	CMSMSL01-01	density 1,0777+/-0,001
streptavidin R-phycoerythrin conjugate	Invitrogen by Life Technologies	S21388	premiun grade 1mg/ml contains 5mM sodium azide
Streptavidin, allophycocyanin conjugate	Invitrogen by thermoFisher scientific	S32362	1mg/ml 2mM azide premium grade
Brilliant violet 421 streptavidin	Biolegend	405225	conc : 0,5mg/ml
Anti-PE conjugated magnetic MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-801
Anti-APC conjugated magnetic MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-090-855
MidiMACs or QuadroMACS separotor	Miltenyi Biotec	130-042-302/130-090-976
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
CD3 BV510 BD horizon	BD Pharmingen / BD Biosciences	563109	Used dilution 1:20
CD19 FITC	BD Pharmingen / BD Biosciences	345788	Used dilution 1:20
CD14 PerCPCy5.5	BD Pharmingen / BD Biosciences	561116	Used dilution 1:50
CD16 PerCPCy5.5	BD Pharmingen / BD Biosciences	338440	Used dilution 1:50
7AAD	BD Pharmingen / BD Biosciences	51-68981E (559925)	Used dilution 1:1000
FACS ARIA III Cell Sorter Cytometer	BD Biosciences
8-strip PCR tubes	Axygen	321-10-061
Racks for 96 microtubes	Dominique Dutscher	45476
RNAseOUT Ribonuclease Inhibitor (recombinant)	Invitrogen by thermoFisher scientific	10777-019	qty:5000U (40U/ul)
Distilled Water Dnase/Rnase Free	Gibco	10977-035
Oligod(T)18 mRNA Primer	New England BioLabs	S1316S	5.0 A260unit
Random hexamers	Invitrogen by thermoFisher scientific	N8080127	qty : 50uM, 5nmoles
Superscript III Reverse transcriptase	Invitrogen by thermoFisher scientific	18080-044	qty : 10000U (200U/ul)
GoTaq G2 Flexi DNA polymerase	Promega	M7805
dNTP Set, Molecular biology grade	Thermo Scientific	R0182	4*100umol
5LVH1	Eurofins	ACAGGTGCCCACT CCCAGGTGCAG	First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers
5LVH3	Eurofins	AAGGTGTCCAGTG TGARGTGCAG	First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers
5LVL4_6	Eurofins	CCCAGATGGGTCC TGTCCCAGGTGCAG	First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers
5LVH5	Eurofins	CAAGGAGTCTGTT CCGAGGTGCAG	First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers - Forward Prmers
3HuIgG_const_anti	Eurofins	TCTTGTCCACCTT GGTGTTGCT	First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers -Reverse primers for human Ig- Bacteria PCR screening
3CuCH1	Eurofins	GGGAATTCTCACA GGAGACGA	First round of PCR - Amplification of heavy chains - Outer primers -Reverse primers for human Ig
5AgeIVH1_5_7	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC GAGGTGCAGCTGGTGCAG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGGTGGAG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3_23	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGTTGGAG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH4	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTGCAGGAG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH4_34	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTACAGCAGTG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH1_18	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTTCAGCTGGTGCAG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH1_24	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTCCAGCTGGTACAG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH3__9_30_33	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCT GAAGTGCAGCTGGTGGAG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
5AgeIVH6_1	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTACAGCTGCAGCAG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Forward primers
3SalIJH1_2_4_5	Eurofins	TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCAG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Reverse primers
3SalIJH3	Eurofins	TGCGAAGTCGACG CTGAAGAGACGGTGACCATTG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Reverse primers
3SalIJH6	Eurofins	TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCGTG	Second round of PCR - Amplification of heavy chains - Inner primers -Reverse primers
5'LVk1_2	Eurofins	ATGAGGSTCCCYG CTCAGCTGCTGG	First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Forward primers
5'LVk3	Eurofins	CTCTTCCTCCTGC TACTCTGGCTCCCAG	First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Forward primers
5'LVk4	Eurofins	ATTTCTCTGTTGC TCTGGATCTCTG	First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Forward primers
3'Ck543_566	Eurofins	GTTTCTCGTAGTC TGCTTTGCTCA	First round of PCR - Amplification of light chains k - Outer primers -Reverse primers- Bacteria PCR screening
5'AgeIVk1	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCT GACATCCAGATGACCCAGTC	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk1_9_1–13	Eurofins	TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk1D_43_1_8	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTGT GCCATCCGGATGACCCAGTC	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk2	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACCCAGAC	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeIVk2_28_2_30	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACTCAGTC	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_11_3D_11	Eurofins	TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTC	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_15_3D_15	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCA GAAATAGTGATGACGCAGTC	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeVk3_20_3D_20	Eurofins	TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'AgeVk4_1	Eurofins	CTGCAACCGGTGTACATTCG GACATCGTGATGACCCAGTC	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk1_2_4	Eurofins	GCCACCGTACGTT TGATYTCCACCTTGGTC	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk3	Eurofins	GCCACCGTACGTT TGATATCCACTTTGGTC	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
3'BsiWIJk5	Eurofins	GCCACCGTACGTT TAATCTCCAGTCGTGTC	Second round of PCR - Amplification of light chains k - Inner primers -Forward primers
5'LVl1	Eurofins	GGTCCTGGGCCCA GTCTGTGCTG	First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl2	Eurofins	GGTCCTGGGCCCA GTCTGCCCTG	First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl3	Eurofins	GCTCTGTGACCTC CTATGAGCTG	First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl4_5	Eurofins	GGTCTCTCTCSCA GCYTGTGCTG	First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl6	Eurofins	GTTCTTGGGCCAA TTTTATGCTG	First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'LVl7	Eurofins	GGTCCAATTCYCA GGCTGTGGTG	First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5LVl8	Eurofins	GAGTGGATTCTCA GACTGTGGTG	First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
3'Cl	Eurofins	CACCAGTGTGGCC TTGTTGGCTTG	First round of PCR - Amplification of light chains λ - Outer primers -Forward primers
5'AgeIVl1	Eurofins	CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGTGCTGACKCAG	Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl2	Eurofins	CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGCCCTGACTCAG	Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl3	Eurofins	CTGCTACCGGTTCTGTGACC TCCTATGAGCTGACWCAG	Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl4_5	Eurofins	CTGCTACCGGTTCTCTCTCS CAGCYTGTGCTGACTCA	Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl6	Eurofins	CTGCTACCGGTTCTTGGGCC AATTTTATGCTGACTCAG	Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
5'AgeIVl8	Eurofins	CTGCTACCGGTTCCAATTCY CAGRCTGTGGTGACYCAG	Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -forward primers
3'XhoICl	Eurofins	CTCCTCACTCGAG GGYGGGAACAGAGTG	Second round of PCR - Amplification of light chains λ - Inner primers -Reverse primers - Bacteria PCR screening
Ab-vec-sense	Eurofins	GCTTCGTTAGAAC GCGGCTAC	Bacteria PCR screening
QA Agarose-TM, Molecular Biology Grade	MP Bio	AGAH0500
NucleoFast 96 PCR Plate	Macherey Nagel	743.100.100
Enzyme Age I HF	New England Biolabs	R3552L	20000U/ml
Enzyme SalI HF	New England Biolabs	R3138L	20000U/ml
Enzyme Xho I	New England Biolabs	R0146L	20000U/ml
Enzyme BSIWI	New England Biolabs	R0553L	10000U/ml
HCg1 (Genbank accession number FJ475055)
LCk (Genbank accession number FJ475056 )
LCl (Genbank accession number FJ517647)
T4 DNA ligase	Invitrogen by thermoFisher scientific	15224.017	100U (1U/ul)
2X YT medium	Sigma Aldrich	Y1003-500ML
Ampicillin	Sigma Aldrich	10835242001
LB (Luria Bertani) Broth (Lennox)	Sigma Aldrich	L3022-250G
Nucleospin Plasmid DNA, RNA and protein purification	Macherey Nagel	740588.250
Jet PEI DNA transfection reagent	PolyPlus	101-40
Flat bottom96-well plate	Falcon	353072
V-bottom 96-well plate	Nunc/Thermofisher	055142
Nunc easy 175 cm2 flasks	Nunc/Thermofisher	12-562-000
ELISA/ELISPOT coating buffer	eBiosciences	00-0044-59
Nunc maxisorp flat bottom 96 well ELISA plates	Nunc/Thermofisher	44-2404-21	high protein binding
Anti-human IgG Ab conjugated to horseradish peroxidase (HRP)	BD Pharmingen / BD Biosciences	55788
TMB substrate	BD Biosciences	555214
Streptavidin	Sigma	S0677
1 mL-HiTrap protein A HP column	GE Healthcare	17-0402-01
ÄKTA FPLC	GE Healthcare	18190026
Superdex 200 10/300 GL column	GE Healthcare	17517501
NGC Quest 10 Plus Chromatography System	BioRad	7880003