타겟된 치료에 저항을 취득의 드라이버 경로 찾고: 약물 내성 Subclone 생성 및 감도 유전자 때 려 눕에 의해 복원

Summary

이것은 시간 및 비용 effective 생체 외에서 프로토콜의 타겟된 치료제 인수 저항 메커니즘을 조사 하는 암 관리에 높은 미 충족된 의료 필요 이다.

Abstract

지난 2 년간 의료 종양학에서 타겟된 치료 세포 독성 약물에서 변화를 보았다. 타겟된 치료제 더 인상적인 임상 효능과 전통적인 치료법 보다 부작용 최소화에 표시 하는 있지만 약물 저항 그들의 혜택을 주요 제한 되고있다. 임상 연습에 대상된 에이전트에 저항을 취득된의 여러 전 임상/생체 외에서 또는 vivo에서 모델 두 가지 전략을 사용 하 여 주로 개발 되었습니다: 인수 저항, 및 ii) 생체 외에서 의 genotypes 모델링 i) 유전자 조작 / vivo에서 저항 모델의 선택. 현재 작업에서 우리는 기본 메커니즘의 설명에 약물 내성 세포 subclones의 세대에서 시작 타겟된 치료제에 저항을 취득된에 대 한 책임을 조사 통합 프레임 워크를 제안 입을 절차는 억제 물 감도 복원에 사용. 간단한 시간 그리고 비용 effective 이렇게 광범위 하 게 적용 이며 다른 종양 histotypes에 다른 대상된 치료 약물에 저항 메커니즘을 조사를 쉽게 확장할 수 있습니다.

Introduction

분자와 세포 생물학에 있는 중요 한 발견에 따라, 새로운 합성된 항 암 분자 수 선택적으로 종양 종류의 광범위 한 배열에 종양 신호 경로 대상으로 개발 되었습니다. 특히, 타겟된 치료제 종양학에서 독특한 속성의 두 가지 범주, 즉 합성 화학 화합물 및 재조합 단일 클론 항 체, 임상 성공 및 극적으로 변경 된 암 치료에서 달성 하는 것으로 알려져 있습니다. 최근 수십 년간^1,2,3.

그럼에도 불구 하 고, 치료에 그들의 인상적인 초기 대응에도 불구 하 고 암 환자의 대부분 모든 타겟된 치료제, 단일 클론 항 체와 kinase 억제제 약물 저항을 개발 했습니다. 결과적으로, 약물 내성, 고전적인 항 암 약⁴에 대 한 주요 장애물은 여전히 신흥 표적으로 한 치료^5,6에 대 한 큰 도전.

타겟된 치료에 저항을 내장 될 수 있습니다 (즉, 기본) 또는 (즉,....

Protocol

참고:이 프로토콜은 특별히 조정 되었습니다 그녀의 긍정적인 위 암 세포 선의 trastuzumab 인수 저항을 기본 메커니즘의 분석에 대 한. 필요한 모든 실험실 계기는 자료의 테이블에에서 보고 됩니다.

1입니다. 타겟된 치료 저항 Subclones 세대

참고: 이것은 가장 중요 하 고 어려운 사실은 다른 셀 라인 수 전시 하지 다른 감도 타겟된 치료 억제제를 독립적으로 그들의 종양 histotype 또는 약물 농도에서 단계 프로토콜에서을 표준화 하 사용.

1. 문화 NCI N87 셀 RPMI 매체 37 ° C에서 단층으로 송아지 태아 혈 청 (10%)와 글루타민 (2 mM, 1%), 보충에 라인 그리고 25 cm² 문화 플라스 크에 씨앗.
2. 시작 하는 복용량으로 문화 매체 trastuzumab의 각 플라스 크 10 µ g/ml에서를 추가 합니다. 그들은 성장 하 고 다시 시작할 때까지 시작 하는 복용량에 셀을 표시 합니다.
   참고: 대상된 치료 억제제의 시작 하는 복용량의 플라즈마 피크 농도 보다 10 배 낮은 해야 합니다. 플라즈마 피크 농도 약물 농도 일반적으로 다음 표준 치료의 여러 복용량 환자 혈액에서 ....

Results

그림 1 실험 절차의 프레임 워크를 설명합니다. 3 위 암 세포-라인 HER2 trastuzumab에 민감한의 높은 수준의 표현 (IC₅₀ < 마약, 그림 2A, 왼쪽된 그래프의 피크 플라즈마 수준) 타겟된 치료 에이전트를 포함 하는 문화 매체에서 성장 했다. 복용량은 10 배 trastuzumab (10 µ g/mL)의 피크 플라즈마 농도 시작 하는 복용량으로 설정 되었고 점차적으로 8-12 개월의 기간 동안 400 µ g/mL로 증가 보다 낮은. 이후에, 우리는 3 subclones를 IC₅₀ 값 trastuzumab (그림 2A, 오른쪽 그래프)의 피크 플라즈마 수준 보다 낮은 안정적인 저항 표현 형 특징을 얻었다. 특히, 가장 저항 subclone, HR NCI.......

Discussion

맞춤 및 타겟 치료 성장 열정을 elicited 있다, 전통적인 화학 요법 약물, 즉, 약물 내성의 신속 하 고 예측할 수 없는 인수 같은 주요 장애물을 직면 하는이 소위 '스마트' 치료. 타겟된 치료의 결과 개선 하기 위해, 그들을 일으키는 원인이 되는 메커니즘의 더 나은 이해를 통해 약물 저항 문제를 해결 해야 합니다. 여기, 우리는 방법론을 광범위 하 게 액세스할 수 있는 시험관에 암 세포 선 모델에서 타겟된 치료 약물에 저항을 취득된의 메커니즘을 조사을 제시.

타겟된 치료 저항 subclones의 생성은 가장 중요 하 고이 프로토콜을 사용, 셀 라인 사이 고 약 감도의 그들의 다른 학위를 내장 유전이 성분 때문에 단계를 표준화 하기 어렵습니다. 이러한 이유로, 저항 subclones를 얻는 데 필요한 시간이 달라질 수 있습니다. 항 암 분자 에이전트에 만성 노출은 일반적으로 강력한 종양 성장 저해를 발생합니다. 그러나, 기간 후에 가변의 지.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trizol 시약	Invitrogen	15596026	TRIzol 시약은 다양한 생물학적 시료에서 고품질 전체 RNA를 분리하거나 RNA, DNA 및 단백질을 동시에 분리하기 위한 시약입니다
ISCRIPT CDNA SYNTHESIS KIT	Bio-Rad	1708891	iScript cDNA synthesis kit는 real-time qPCR을 사용한 유전자 발현 분석을 위한 민감하고 사용하기 쉬운 1차 가닥 cDNA 합성 키트입니다.
TaqMan 유전자 발현 어세이	Life Technologies	4331182	Applied Biosystems TaqMan 유전자 발현 어세이는 한 쌍의 라벨링되지 않은 PCR 프라이머와 5' 말단에 Applied Biosystems FAM 또는 VIC 염료 라벨이 있고 3' 말단에 Minor Groove Binder(MGB) 및 Nonfluorescent quencher(NFQ)가 있는 TaqMan 프로브로 구성됩니다.
M-PER 포유류 단백질 추출 시약	Thermo Scientific	78501	Thermo Scientific M-PER 포유류 단백질 추출 시약은 배양된 포유류 세포에서 매우 효율적인 총 용해성 단백질 추출을 제공하도록 설계되었습니다.
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)	Thermo Scientific	78440	Thermo Scientific Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)은 세포 및 조직 용해물에 대한 완전한 단백질 시료 보호 기능을 갖춘 단일 솔루션의 편리함을 제공합니다.
Pierce BCA 단백질 어세이 키트	Thermo Scientific	23225	Thermo Scientific Pierce BCA 단백질 어세이 키트는 단백질 표준물질과 비교하여 (A562nm)의 총 단백질 농도를 측정할 수 있는 2액형, 고정밀, 세제 호환 어세이 시약 세트입니다.
4x Laemmli 샘플 버퍼	Bio-Rad	1610747	SDS PAGE용 샘플 준비를 위해 4x Laemmli 샘플 버퍼를 사용합니다. 시료 감소를 위해 시료와 혼합하기 전에 2-메르캅토에탄올과 같은 환원제를 완충액에 첨가하십시오.
4– 20% Mini-PROTEAN TGX 프리캐스트 단백질 겔	Bio-Rad	456-1094	Long-life TGX(Tris-Glycine eXtended) 겔은 새로운 제형을 가지고 있으며 표준 변성 단백질 분리와 천연 전기영동 모두에 사용할 수 있습니다.
Precision Plus Protein WesternC 블로팅 표준물질	Bio-Rad	1610376	Precision Plus Protein Prestained 표준물은 Dual Color, All Blue, Kaleidoscope 및 Dual Xtra 형식으로 제공됩니다. 4개 모두 3개의 고강도 reference band(25, 50 및 75 kD)를 가진 동일한 gel migration pattern을 가지고 있습니다.
10x Tris/Glycine/SDS	Bio-Rad	1610732	10x Tris/glycine/SDS는 단백질 샘플을 SDS-PAGE로 분리하기 위한 사전 혼합 실행 버퍼입니다.
Trans-Blot Turbo Mini PVDF 트랜스퍼 팩	Bio-Rad	1704156	Trans-Blot Turbo Mini PVDF 트랜스퍼 팩은 Trans-Blot Turbo Transfer System을 사용하여 미니 겔에서 단백질을 빠르고 효율적으로 전달합니다. 진공 밀봉되어 바로 사용할 수 있는 각 전사 팩에는 2개의 완충액 포화 이온 저장소 스택과 사전 습윤 PVDF 멤브레인이 포함되어 있습니다.
정밀 단백질 StrepTactin-HRP Conjugate	Bio-Rad	1610381	StrepTactin-Horseradish Peroxidase (HRP) 콘주게이트는 웨스턴 블롯에서 Precision Plus Protein Unstained Protein 표준물 또는 Precision Plus Protein WesternC 단백질 표준물의 화학발광 또는 비색 검출을 위한 것입니다.
Immun-Star WesternC 용액	Bio-Rad	5572	Immun-Star WesternC 용액은 단백질 검출 방법으로, 단백질의 중간 펨토그램 양을 검출합니다.
Universal Negative Control	Invitrogen	12935300	Negative Control siRNA는 마우스, 랫트 또는 인간 유전자 염기서열과 유의미한 염기서열 유사성이 없습니다. 이 대조군은 또한 세포 기반 스크리닝에서 테스트되었으며 세포 증식, 생존력 또는 형태에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 입증되었습니다.
Opti-MEM Glutamax Medium	Thermo Fisher Scientific	51985026	Opti-MEM Medium은 성장률이나 형태의 변화 없이 소 태아 혈청 보충제를 최소 50%까지 줄일 수 있는 개선된 최소 필수 배지(MEM)입니다.
소음기 선택 사전 설계 & 검증된 siRNA	Ambion	4390824	RNA 간섭(RNAi)은 다양한 세포 유형에서 단백질 기능을 연구하기 위해 유전자 발현을 효과적으로 녹다운하는 가장 좋은 방법입니다.
리포펙타민 RNAiMAX 트랜스펙션 시약	Invitrogen	13778075	Lipofectamine RNAiMAX 트랜스펙션 시약은 siRNA 전달을 위한 효율적인 고급 솔루션을 제공합니다. 다른 어떤 siRNA 특이적 transfection 시약도 일반적인 세포 유형, 줄기 세포 및 일차 세포뿐만 아니라 전통적으로 transfection이 어려운 세포 유형을 포함한 다양한 세포주에서 쉽고 효율적인 siRNA 전달을 제공하지 않습니다.
마우스 anti-IQGAP1	Invitrigen	33-8900	작업 농도 : 1:400 5 % 우유 용액
염소 안티 마우스 IgG-HRP : sc-2005	Santa Cruz	sc-2005	작업 농도 : 1 : 10000 5 % 우유 용액
PMSF	Sigma Aldrich	P 7626	세린 프로테아제 및 아세틸 콜린 에스 테라 제
Thermocycler		PTC-200 Thermal Cycler	는 온도 균질성과 최대 3°C의 램핑 속도를 허용합니다. C/초 이 프로토콜은 다른 thermalcycler,
Real Time RT-PCR 기기	Applied Biosystems	7500 RT-PCR 시스템	. 이 플랫폼은 형광 기반 중합효소연쇄반응(PCR) 시약을 사용하여 비교 CT 분석 유형을 사용하여 상대적 정량화를 제공하는 5색 플랫폼입니다. 이 프로토콜은 다른 열순환기와 함께 수행할 수 있습니다
Microvolume Spectrophotometer	, Thermo Scientific	Nanodrop	소량의 시료를 사용하여 정확하고 빠른 산 핵 측정을 제공합니다
Blotting 시스템	Bio-Rad, Trans-Blot	Turbo 시스템	몇 분 내에 semy-dry 전달,
이미지 획득 시스템 및 겔 문서	Bio-Rad	Chemidoc 이미지 체계	: 화학발광 검출에 사용하기 쉽습니다