세포질 구성 요소를 식별 하는 간단한 형광 기반 기자 분석 결과 리 독 소에 필요한 체인 (RTA) 효 모에 인신 매매

요약

원고, 우리는 밀매에 관여 하 고 식물 독 소 리 (RTA)의 소 단위는 세포 독성의 프로세스를 죽이고 세포 구성 요소를 식별 하는 효 모 기반 형광 기자 분석 결과 사용 하 여를 설명 합니다.

초록

박테리아 및 식물 A B 독 소는 cytosol에서 그들의 세포내 별로 도달 하 고 궁극적으로 죽 진 핵 세포에서 자연 밀매 경로 악용 /. 이러한 A / B 독 소는 효소 활성의 Asubunit (예를 들어, 신은 독 소 (RTA)) 및 하나 이상의 셀 바인딩 Bsubunit(s) 독 소에 특정 바인딩 세포 표면 수용 체에 대 한 책임은 일반적으로 구성. 어떻게 우리의 현재 지식 A / B 독 소 효율적으로 endocytosis 및 세포내 단백질 높은 진 핵 세포에서 정렬 같은 기본적인 세포질 기계 장치를 이해 하기 도움이 셀 과학자를 취하게 할 수 있다. 의료의 관점에서 그것은 마찬가지로 환자에 대 한 적절 한 치료 솔루션을 찾을 수 또는 결국 암 치료에 대 한 치료 독 소-기반 응용 프로그램 개발에 주요 독 소 밀매 경로 식별 하는 것이 중요.

A의 게놈 넓은 분석 이후 / B 독 소 포유류 세포에서 인신 매매는, 시간이 걸리는, 복잡 하 고 비싼, A에 여러 연구 / B 독 소 전송 효 모 모델 유기 체 Saccharomyces cerevisiae에서 수행 되었습니다. 효 모와 더 높은 진 핵 세포에서 덜 복잡 하 고, 기본적인 세포질 과정 임에도 불구 하 고 비슷한과 효 모에 얻은 결과 매우 자주 포유류 상황에 전송할 수 있습니다.

여기, 우리 누 룩에서 RTA의 세포내 매매 분석을 신속 하 고 사용 하기 쉬운 기자 분석 결과 설명 합니다. 새로운 분석 결과의 필수적인 이점을 cytosol에 뿐만 아니라 RTA 복고풍-전 바인딩과 그물 (응급실)에서 조사를 기회 이지만 오히려 endocytosis 퇴행 성 독 소 수송 원형질 막에서 응급실에. 분석 결과 vivo에서 번역 후 녹색 형광 단백질 (GFP)의 형광 방출 통해 RTA 독성의 간접 측정을 허용 하는 기자 플라스 미드의 사용. RTA 28S rRNA depurination에 의해 효율적으로 단백질 생 합성의 개시를 방지, 이후이 분석 결과에서 수 있습니다 호스트 세포 단백질의 식별을 변경의 검색을 통해 세포내 RTA 전송에 관련 된 형광 방출.

서론

독 소를 생산 하는 박테리아에 의해 감염에서 고통 받는 환자 효율적인 치료 치료는 여전히 크게 실종 이후 특히 각 사회 의료 시스템에 대 한 심각한 의료 및 금융 부담을 나타냅니다. 새로운 치료 전략, 의학 관련 A의 복잡 한 중독 메커니즘 개발 / B 독 소 콜레라 독 소, 시가 독 소, 또는 리 등 완벽 하 게 구현할 수 있는 새로운 강력한 분석 실험에 따라 분자 수준에서 이해 될 필요가.

최근 몇 년 동안 여러 연구 A를 분석 하려고 / 효 모 및 방사성 독 소 같은 시간이 소요 되 고 비용 집약적인 메서드를 사용 하 여 포유류 세포에서 B 독 소 운송 라벨 siRNA 기반 심사로^{1,2 3을}접근 한다. 경우에 따라 독 소 매매 시각 있다 vivo에서 형광 현미경 검사 법에 의해 fluorophores, 양자 점, 또는 형광 단백질^4,5소 단위 개별 독 소의 화학 그리고/또한 유전 결합 후. 불행히도, 이러한 수정 종종 비활성 또는 변경 된 독 소의 자연 속성으로 이어질. ....

프로토콜

참고: 일반 실험 작업 과정에 대 한 개요는 그림 1에 묘사 된다.

주의: RTA 인 간에 대 한 매우 독성이 있다. 안전 연구소 권한 S2 (biosafety 수준 2에 해당)이 필요 합니다. 전체 실험 동안 장갑을 착용 합니다.

1. 분리 표현의 대장균 에서 RTA의 태그

1. 대장균 세포 식 플라스 미드 pET24-RTA_{(그의) 6} 또는 표준 electroporation 프로토콜^9,10를 사용 하 여 빈 벡터 pET24a⁽⁺⁾ 로 변환 합니다. 셀 빈 플라스 미드를 포함 하는 부정적인 컨트롤 역할을 합니다.
2. 대 포함 (µ g/100ml) 파운드 플레이트에 긍정적인 클론의 선택, RTA 식 플라스 미드 또는 5 mL 파운드_칸 매체 (파운드 매체 대의 100 µ g/mL와 함께)에 빈 벡터를 포함 하는 세포를 접종 하 고 37 ° C와 24 h에 대 한 220 rpm에서 품 어.
3. 5 mL 사전 ....

결과

이 원고에 설명 된 프로토콜의 일반적인 워크플로 그림 1, 대략 성공적인 RTA 정화 및 후속 GFP 기자 분석 결과 실험에 대 한 단일 단계 요약에 나와 있습니다. 각 개별 단계에 대 한 더 자세한 설명은 프로토콜에서 찾을 수 있습니다. 그림 2 는 친화성 크로마토그래피 (그림 2A)와 빈 벡터 제어 (그림 2B)에 의해 성공적인 RTA 정화의 예상된 결과를 보여 줍니다. 그림 2C 단백질 피크 (파란색)와 소금 eluted 피크 (갈색)의 이상적인 분리를 보여주는 염 실험의 대표적인 결과 보여 줍니다. 효과적인 RTA 정화 Coomassie 스테인드 SDS-젤 그림<.......

토론

위의 프로토콜을 수행할 때 실험의 성공적인 결과 달성 하기 위해 다음 제안 사항을 권장 합니다.

분리 단백질 식, 1 mM의 IPTG 농도 초과 하지 중요 하다. IPTG 농도 > 1mm 억제 발기인 유도 RTA 표현과 독 수익률 낮은 리드. 또한, 셀 수 없습니다 재배 포함 체 형성, 비효율적인 폴딩, 및 독 소 비활성화를 방지 하기 위해 28 ° C 보다 높은 온도에서. RTA 식 (예를 들어, 20-28 ° C) 낮은 온도에서 가능 하 고 또한 생물 학적 활성 독 소의 생산 리드. 그러나, 추가 온도 감소 RTA 활동/접이식 크게 개선 되지 않습니다와 28 ° C (데이터 표시 되지 않음)에 비해 낮은 총 독 소 수율 결과.

친화성 크로마토그래피 (표 1)의 정화 매개 변수 자동된 정화 시스템의 사용에 대 한 5 mL Ni^{2 +} 선호도 열을 갖춘 경우 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Bacterial and yeast strains
E. coli BL21 DE3(Gold)	Aligent Technologies	230130
S. cerevisiae BY4742	Euroscarf	Y10000
S. cerevisiae BY4742 삭제 돌연변이	Dharmacon		YSC1054 전체 컬렉션
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
Plasmids used in this protocol
pET24a(+) (Novagen)	Millipore	69772-3
pET-RTA(His6)	Becker et al. (2016)3
Name	Company	>카탈로그 번호	Comments
Reagents
Zymolyase 20T	USBio	Z1000.250	세포벽용 용해 효소 제거
LB 육수 매체	Thermo Scientific	10855021	15g 한천이 추가되었습니다
YNB	Thermo Scientific	DF0335-15-9
황산암모늄	Sigma-Aldrich	A4418-100G
류신이 없는 효모 드롭아웃 믹스 supplemts Sigma-Aldrich		Y1376-20G
한천	Sigma-Aldrich	05040-100G
D-포도	시그마-알드리치	G8270-100G
DTT	시그마-알드리치	10197777001
D-라피노스	시그마-알드리치	83400-25G
D-소르비톨	시그마-알드리치	S1876-1KG
D-갈락토스	시그마-알드리치	G0750-10MG
G418	써모티픽
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758-1G
Imidazole	Roth	3899.1
PAGE 눈금자 사전 염색	발효	26616	단백질 사다리 서양 분석에 사용
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
>RTA 정제, 탈염 및 리더 측정용 재료
분광도계 Ultrospec 2100 pro	Amersham
Soniprep 150	MSE		구형 모델, 다른 모델 사용 가능
Fluoroskan Ascent	Thermo Scientific	5210470	구형 모델, 더 이상 사용할 수 없음
& 오믈; KTAPurifier	Thermo Scientific	28406266	제품은 단종되었으며 대체
HisTRAP HP 칼럼	GE Healthcare	17-5248-02
HiTRAP 탈염 칼럼	GE Healthcare	11-0003-29
Midisart 멸균 필터	Sartorius	16534K	0.2 µ m 기공 크기
BCA 단백질 분석 키트	Pierce	23225
660nm 분석 키트	Thermo Scientific	22660
96웰 플레이트	Thermo Scientific	260860
Name	Company	카탈로그 번호	Comments
항체 (선택적)
Anti-Tetra-His	Qiagen	34670	1차 항체; 1:1,000 희석
Anti-mouse-HRP	Sigma-Aldrich	A9044-2ML	2차 항체, 1:10,000 희석

플레이트 생산을 위해. 당 11811031되었습니다.