Summary
원고, 우리는 밀매에 관여 하 고 식물 독 소 리 (RTA)의 소 단위는 세포 독성의 프로세스를 죽이고 세포 구성 요소를 식별 하는 효 모 기반 형광 기자 분석 결과 사용 하 여를 설명 합니다.
Abstract
박테리아 및 식물 A B 독 소는 cytosol에서 그들의 세포내 별로 도달 하 고 궁극적으로 죽 진 핵 세포에서 자연 밀매 경로 악용 /. 이러한 A / B 독 소는 효소 활성의 Asubunit (예를 들어, 신은 독 소 (RTA)) 및 하나 이상의 셀 바인딩 Bsubunit(s) 독 소에 특정 바인딩 세포 표면 수용 체에 대 한 책임은 일반적으로 구성. 어떻게 우리의 현재 지식 A / B 독 소 효율적으로 endocytosis 및 세포내 단백질 높은 진 핵 세포에서 정렬 같은 기본적인 세포질 기계 장치를 이해 하기 도움이 셀 과학자를 취하게 할 수 있다. 의료의 관점에서 그것은 마찬가지로 환자에 대 한 적절 한 치료 솔루션을 찾을 수 또는 결국 암 치료에 대 한 치료 독 소-기반 응용 프로그램 개발에 주요 독 소 밀매 경로 식별 하는 것이 중요.
A의 게놈 넓은 분석 이후 / B 독 소 포유류 세포에서 인신 매매는, 시간이 걸리는, 복잡 하 고 비싼, A에 여러 연구 / B 독 소 전송 효 모 모델 유기 체 Saccharomyces cerevisiae에서 수행 되었습니다. 효 모와 더 높은 진 핵 세포에서 덜 복잡 하 고, 기본적인 세포질 과정 임에도 불구 하 고 비슷한과 효 모에 얻은 결과 매우 자주 포유류 상황에 전송할 수 있습니다.
여기, 우리 누 룩에서 RTA의 세포내 매매 분석을 신속 하 고 사용 하기 쉬운 기자 분석 결과 설명 합니다. 새로운 분석 결과의 필수적인 이점을 cytosol에 뿐만 아니라 RTA 복고풍-전 바인딩과 그물 (응급실)에서 조사를 기회 이지만 오히려 endocytosis 퇴행 성 독 소 수송 원형질 막에서 응급실에. 분석 결과 vivo에서 번역 후 녹색 형광 단백질 (GFP)의 형광 방출 통해 RTA 독성의 간접 측정을 허용 하는 기자 플라스 미드의 사용. RTA 28S rRNA depurination에 의해 효율적으로 단백질 생 합성의 개시를 방지, 이후이 분석 결과에서 수 있습니다 호스트 세포 단백질의 식별을 변경의 검색을 통해 세포내 RTA 전송에 관련 된 형광 방출.
Introduction
독 소를 생산 하는 박테리아에 의해 감염에서 고통 받는 환자 효율적인 치료 치료는 여전히 크게 실종 이후 특히 각 사회 의료 시스템에 대 한 심각한 의료 및 금융 부담을 나타냅니다. 새로운 치료 전략, 의학 관련 A의 복잡 한 중독 메커니즘 개발 / B 독 소 콜레라 독 소, 시가 독 소, 또는 리 등 완벽 하 게 구현할 수 있는 새로운 강력한 분석 실험에 따라 분자 수준에서 이해 될 필요가.
최근 몇 년 동안 여러 연구 A를 분석 하려고 / 효 모 및 방사성 독 소 같은 시간이 소요 되 고 비용 집약적인 메서드를 사용 하 여 포유류 세포에서 B 독 소 운송 라벨 siRNA 기반 심사로1,2 3을접근 한다. 경우에 따라 독 소 매매 시각 있다 vivo에서 형광 현미경 검사 법에 의해 fluorophores, 양자 점, 또는 형광 단백질4,5소 단위 개별 독 소의 화학 그리고/또한 유전 결합 후. 불행히도, 이러한 수정 종종 비활성 또는 변경 된 독 소의 자연 속성으로 이어질. 다양 한 과학적인 질문에 직접 답변을 또 다른 우아한 방법은 이다 lacZ, luciferase 등 형광 단백질 효소에 따라 기자 시스템의 사용 (예: GFP 또는 Discosoma sp. 빨간 형광 성 단백질 ( dsRed))입니다.
이 원고는 S. cerevisiae에 extracellularly 적용된 RTA의 세포내 수송에 필요한 세포질 구성 요소를 식별 하는 간단한 프로토콜 설명 합니다. 따라서, GFP 뒤 응급실 가져오기 N 맨끝 신호를 포함 하는 형광 기자 플라스 미드 GFP 형광 방출 후에 vivo에서 RTA 중재 단백질 번역 억제를 직접적으로 측정 하는 단백질 생 합성 센서 역 번역6. 경우는 RTA endocytosis 및 세포내 매매 부정적인 (또는 긍정적인) 영향을 야생-타입에 비해 특정 효 모 삭제 돌연변이에이 GFP 형광 방출6증가 (또는 감소)를 통해 감지할 수 있습니다.
지금까지, 모든 방법을 분석 하는 효 모 세포에서 RTA 전송 RTA의 응급실 cytosol 복고풍 전 프로세스에 제한 되었습니다. 이러한 인공 시스템에서 RTA는 응급실 가져오기 신호를 포함 하는 자살 형1,7에 결과 유도할 수 있는 발기인에서 표현 된다. 셀 리의 B 소 단위 바인딩 마찬가지로이 원고에 설명 된 실험 설정에서 누락 된 고, 따라서, 완전히 나타내지 않는 신은 holotoxin 중독8의 자연 상황, 독 소 전송 플라즈마에서 응급실에 Golgi 기구 통해 막이 소설 분석 결과와 밀접 하 게 유사 될 수 있습니다. 흥미롭게도, 파일럿 연구에서 얻은 예비 결과 RTA에서 사용 하는 밀매 경로 신은 holotoxin의 중독 경로와 눈에 띄는 유사성을 공개를 나타냅니다.
요약, 설명된 방법 RTA endocytosis에 선택한 세포 단백질 및 효 모에 인신 매매의 특정 역할을 결정 하기 위해 사용할 수 있습니다. 또한,이 실험적인 체제 생산과 다양 한 효 모와 세균 종 zymocin 또는 시가 독 소를 분 비 하는 독 소를 비활성화 다른 리보솜에 쉽게 적응 될 수도 있습니다.
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Protocol
참고: 일반 실험 작업 과정에 대 한 개요는 그림 1에 묘사 된다.
주의: RTA 인 간에 대 한 매우 독성이 있다. 안전 연구소 권한 S2 (biosafety 수준 2에 해당)이 필요 합니다. 전체 실험 동안 장갑을 착용 합니다.
1. 분리 표현의 대장균 에서 RTA의 태그
- 대장균 세포 식 플라스 미드 pET24-RTA(그의) 6 또는 표준 electroporation 프로토콜9,10를 사용 하 여 빈 벡터 pET24a(+) 로 변환 합니다. 셀 빈 플라스 미드를 포함 하는 부정적인 컨트롤 역할을 합니다.
- 대 포함 (µ g/100ml) 파운드 플레이트에 긍정적인 클론의 선택, RTA 식 플라스 미드 또는 5 mL 파운드칸 매체 (파운드 매체 대의 100 µ g/mL와 함께)에 빈 벡터를 포함 하는 세포를 접종 하 고 37 ° C와 24 h에 대 한 220 rpm에서 품 어.
- 5 mL 사전 문화 1 L 파운드칸 매체를 보충 하 고 셀에는 0.8-1.0 (대략 3-4 h)의 OD600 에 도달 했습니다 때까지 37 ° C 그리고 220 rpm에서 세포를 품 어. 그 후, 문화 온도 28 ° C를 줄이고 1 M H2o. 이소프로필-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 재고 솔루션의 준비
- 1 m m의 최종 농도에 IPTG을 추가 하 여 대장균 의 RTA 식 유도.
- 3.5 h 28 ° C 그리고 220 rpm 10000 x g와 10 분, 4 ° C에서 원심 분리 하 여 수확 셀 후 씻어 두 번 바인딩 버퍼 (500 mM NaCl, 10mm 이미, 및 20 m m KH2포4 의 5 mL와 펠 릿 pH = 7.4) 10000 x g와 10 분, 및 5 mL 바인딩 버퍼 펠 릿 resuspend 4 ° C에서.
참고: 프로토콜이이 단계에서 일시 중지 될 수 있습니다 고 셀 몇 일 동안 80 ° C에 저장 될 수 있습니다.
2. 정화 친화성 크로마토그래피를 통해 그의 태그 RTA의
- 얼음 다음 프로토콜을 사용 하 여 셀 sonicate: 15 s 펄스 (20 미크론), 30 s 일시 중지. 5 번이이 단계를 반복 합니다.
- 세포 lysate 21000 x g와 15 분 동안 4 ° C에서 원심 고 상쾌한 멸 균 주사기 필터 시스템 (0.2 µ m 기 공 크기)를 사용 하 여 필터링 합니다.
참고: 성공적으로 sonicated 샘플의 펠 릿 셀 투명 한 테두리를 표시합니다. - Ni2 +5 mL를 갖춘 자동된 정화 시스템을 사용 하 여-는 살 균 필터링 대장균 표면에 뜨는에서 그의 태그 RTA 분수 정화 선호도 열을 기반으로. 일반적으로, 1 mL/min의 속도 차입 사용 하 고 효율적인 비 독 소 바인딩 및 독 소 활동의 손실을 방지 하기 위해 전체 정화 시스템을 냉각.
참고: 효율적인 RTA 정화에 대 한 매개 변수는 표 1에 나열 됩니다. 베 커 외를 참조 하십시오. 대 한 자세한 내용은9.- 간단히, 바인딩 버퍼 저장소 버퍼 제거의 20 mL와 선호도 열 equilibrate. 주사기를 사용 하 여 선호도 열에 상쾌한 살 균 필터링을 적용 합니다.
- 열 바인딩 버퍼 열에서 언바운드 단백질 제거 하의 25-35 mL 씻으십시오. 세척 단계를 수행 하는 280에서 UV 흡 광도까지 nm 초기 UV 값은.
- 20-35 ml 차입 버퍼의 바운드 RTA 분수 elute (이미 500 m m, 500 m m NaCl, 20mm KH2포4, pH = 7.2) 얼음 (그림 2A , 그림 2B)에 샘플을 계속 하 고.
참고: RTA 분수의 차입 증가 UV 흡수에 의해 표시 된다. 일반적인 바인딩 단백질 오염을 방지 하기 위해이 분수를 독점적으로 수집을 note 하십시오. - Eluted 샘플 20 µ L를 사용 하 여 수행 Coomassie 파란 얼룩이11 또는 서쪽 오 점 분석12,13 (선택 사항). 사용 하 여 기본 반 그의 항 체 (1:1, 000) 보조 안티-mouse-IgG-HRP (1:10, 000) RTA를 감지 하 여 샘플 순도 (그림 3)를 확인 합니다.
- 5 mL 염 열에 eluted RTA 분수 desalt 고 0.8 M 톨에 샘플을 equilibrate.
- 염 열에 의해 정화 시스템의 선호도 열을 장착 하 고 처음 0.8 M sorbitol의 20 mL와 함께 열을 equilibrate.
- 주사기를 통해 열에 eluted RTA 분수를 적용 합니다. 0.8 M sorbitol의 100 mL와 열 세척 하 고 즉시 UV 흡수 증가 (그림 2C)를 시작으로 15 mL 튜브에 desalted RTA 분수 elute.
- 4 ° c.에 eluted RTA 분수를 저장
참고: 직접 전도도 증가 소금 오염을 피하기 위하여 때 RTA 분수 샘플링을 중지 합니다. 염 절차에 대 한 매개 변수는 표 1에 나열 됩니다.
- 10000 x g와 4 ° C 10 kDa 컷오프 스핀 열 1-2 mL의 최종 볼륨을 사용 하 여 30-180 분 eluted RTA 분수를 집중 하 고 3-4 주 4 ° C에서 샘플을 저장할.
주의: RTA 활동의 완전 한 손실에 대 한 단서를 동결 이후 샘플을 동결 하지 않습니다. - 단백질 농도 기존의 단백질 결정 키트를 사용 하 여 결정 합니다. 단백질 농도 1-1.5 mg/mL의 범위에 있어야 합니다.
참고: RTA 단백질 농도가 너무 높은 경우를 침전 하는 경향이 있다 (> 5 mg/mL).
3. 효 모 세포 벽 제거 및 변환
- 야생-타입 또는 선택 된 효 모 삭제 돌연변이는 GFP 기자 플라스 미드 pRS315-K28SP-GFP6 표준 리튬 아세테이트 변환 방법14를 사용 하 여 변환. 셀 신 드롭 아웃 (d/o)를 품 어 긍정적인 클론 선택에 대 한 2-3 일 동안 30 ° C에서 포도 당 플레이트 (2% 포도 당, 한 천 1.5%, 0.5% 염화 황산 염, 0.17% 효 모 질소 기지 (YNB), 및 0.087 %d / o 혼합 신 없이).
- 각 접시에서 3 다른 효 모 클론을 선택 하 고 220 rpm 및 30 ° C OD600 ~ 신 d/o 유 매체 (2% 유, 황산 암모늄 0.5%, 0.17 %YNB, 0.087 %d / o 신 없이 혼합) 100 mL에 클론을 접종 = 1.0-2.0 (2-4 x 107 셀/mL)입니다.
참고: 다른 효 모 삭제 긴장의 세포 성장이 다르다. 모니터 세600 는 분 광 광도 계를 통해입니다. - OD600 값을 계산 하려면 OD600 샘플 희석 0.1-0.3 = (1:5 1:10 희석) OD600 는 분 광 광도 계에서 측정. 참고로, H2O 신 d/o raffionose 매체의 해당 금액으로 보완을 사용 합니다.
- 마무리 단계 3.5, 496 µ L spheroplasting 버퍼 (약 2 × 106 spheroplasts) spheroplasted 50ml 문화 4 µ L를 혼합 하 고 400 x g에서 10 분 원심 후.
- Resuspend 펠 릿 10 mL H2O에서에서 증 류, 소용돌이 샘플 30 s, 및 10 µ L 신 d/o 포도 접시 (2% 포도 당, 한 천 1.5%, 0.5% 염화 황산, 0.17 %YNB, 및 신 없이 0.087 %d / o 혼합)에 샘플의 밖으로 접시.
- 30 ° c.에 3 일에 대 한 셀을 품 어 접시에 성장된 셀 식민지의 총 수를 계산 합니다. 데이터 평가 사용 하 여 샘플만 효율 98% 이상 (총 셀 식민지 수 < 40 식민지/접시).
4. GFP 96 잘 접시에 기자 시험 측정
- 효 모 세포 spheroplasts 96 잘 접시 (200 µ L/잘)로 3.7 단계에서 얻은 개 씨.
- 70 µ L 안정된 신 d/o 유 매체 부정적인 컨트롤 포함을 추가 (eluate의 Ni2 +-선호도 순화 된 세포 lysate 빈 벡터 표현 IPTG 유발 대장균 세포에서) 또는 5 µ M (최종 RTA 농도에 RTA를 정화 RTA 160 g/l에 해당)에 각 잘.
- 30 µ L 안정 갈 락 토스 솔루션 (30% 갈 락 토스, 0.8 M sorbitol) GFP 식 유도 이후에 측정을 시작 하는 즉시 추가 합니다.
참고: 실험 당 적어도 3 기술 복제를 수행 하 고 효 모 스트레인 당 3 생물 복제 합니다. - 마무리 샘플 준비 (단계 4.1 4.3), 후 형광 판독기에 96 잘 접시를 넣어 하 고 측정을 시작 합니다. GFP 형광 검출에 필요한 설정 475/509 nm 필터를 사용 합니다. 30 ° C, 120 rpm에서 20 h (10 분 간격으로 측정)의 시간 창에 1mm의 동요 직경 측정을 수행 합니다.
참고: GFP 필터 집합은 일반적으로 모든 리더 시스템에서 사용할 수 있는. 온도, 시간 창, 간격, 및 RTA 농도 측정 자신의 필요를 위해 조정할 수 있습니다. 대표 결과 그림 4에 나와 있습니다. - 선택 사항: 측정에 추가 내부 컨트롤을 사용 하 여 품질 관리에 대 한. 30% 갈 락 토스 (GFP 유도 없음) 대신 30 µ L 안정된 신 d/o 유 매체를 추가 하 여 부정적인 제어를 준비 합니다. 또한, 0.8 M sorbitol 안정 G418 솔루션 (300 µ g/mL)의 70 µ L를 추가 합니다. 그것은 효 모에 GFP 식 방지 단백질 번역 억제제 G418 단백질 억제에 대 한 긍정적인 제어로 제공 합니다.
- 다음 방정식에 따르면 h는 20 시간 포인트에 대 한 % 상대 GFP 형광 계산 ( 그림 4A참조):
어디 NC는 부정적인 컨트롤
- 각 측정 지점에 대 한 상대적인 GFP 형광 또는 결정 (이 경우 10 분에서 참고 단계 4.4) 위의 수식을 사용 하 여. 그림 4B같이 시간 (x 축)에 GFP 형광 강렬 (y 축)를 blotting으로 그래프를 만듭니다.
어디 NC는 부정적인 컨트롤
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Representative Results
이 원고에 설명 된 프로토콜의 일반적인 워크플로 그림 1, 대략 성공적인 RTA 정화 및 후속 GFP 기자 분석 결과 실험에 대 한 단일 단계 요약에 나와 있습니다. 각 개별 단계에 대 한 더 자세한 설명은 프로토콜에서 찾을 수 있습니다. 그림 2 는 친화성 크로마토그래피 (그림 2A)와 빈 벡터 제어 (그림 2B)에 의해 성공적인 RTA 정화의 예상된 결과를 보여 줍니다. 그림 2C 단백질 피크 (파란색)와 소금 eluted 피크 (갈색)의 이상적인 분리를 보여주는 염 실험의 대표적인 결과 보여 줍니다. 효과적인 RTA 정화 Coomassie 스테인드 SDS-젤 그림3에서의 형태로 제공 됩니다. 마지막으로, 그림 4 는이 간단 하 고 강력한 GFP 기반 기자 시험 방법6일부 원래 결과 요약 합니다. 그림 4A 설립된 GFP 기자 분석 결과 신뢰할 수 있는 결과 생산할 수 이며이 연구에 사용 된 GFP 기자 플라스 미드를 개요로 묘사를 보여 줍니다. 그래프에서 효 모 spheroplasts RTA 취급 및 처리 비 조건에서의 상대 GFP 형광 서로 비교 됩니다. 예상 대로 비 유도 G418 치료 세포 거의 없다 GFP 형광을 표시 합니다. 치료 비 및 부정적인 제어 치료 (빈 벡터) 셀에 GFP 식에 영향을 받지 않습니다 그리고 두 샘플 사이 큰 차이가 관찰 되지 않는 했다. 반면, RTA 치료 활동을 억제 하는 리보솜에 의해 중재 예상된 GFP 형광 감소에 지도 한다. 그림 4B, RTA 유도 GFP 형광 억제의 시간 곡선 표시 됩니다. 데이터 프레 젠 테이 션의이 종류는 GFP 식 (90 분 갈 락 토스 유도 후) 및 RTA (210 분 후 야생-타입 셀 응용 프로그램)에 의해 변환 억제의 출발점의 타이밍에 대 한 추가 정보를 포함합니다. RTA 중재 형광 감소 가능성이 지연 이해 속도 cytosol에 RTA의 세포내 수송 반영합니다. 그림 4C 20 h RTA-치료 후 선택한 효 모 돌연변이에서 얻은 고 RTA 치료에 비해 야생-타입 셀 RTA 취급에 비해 상대적인 GFP 형광을 보여 줍니다. Hrd1p 및 Der1p ERAD 구성 요소는 적합 한 긍정적인 컨트롤 이전 연구는 이미 두 단백질 효 모1에서 RTA의 응급실 cytosol retrotranslocation에 관련 된 증명 하기 때문에 선정 됐다. 따라서, 두 돌연변이 야생-타입 셀에 비해 GFP 형광에 예상 된 증가 보여줍니다. 대조적으로, Δyos9 및 Δnup120 셀의 상대적인 GFP 형광 값 크게 다른 되지 않습니다. 그것은 이미 어 품질 관리 lectin Yos9p의 부족 없으며 핵 숨 구멍 단백질 Nup20p 부족 RTA 독성과 전송1에 영향을 설명 하고있다. 특정 선호도 크로마토그래피와 담 매개 변수 목록은 표 1에서 찾을 수 있습니다.
그림 1: RTA 정화와 기자 GFP 기반 분석 결과의 일반적인 워크플로. RTA 정화 (왼쪽) 식 또는 재배와 IPTG 유도 RTA 식 빈 벡터 대장균 의 변환으로 시작 합니다. 세포 세포의 용 해, 여과 멸 균 후는 상쾌한 Ni2 + 친화성 크로마토그래피를 통해 정제 하 고 샘플 순도 Coomassie 얼룩 또는 서쪽 오 점을 통해 확인 됩니다. Eluted RTA 분수 GFP 기자 분석 결과 실험에 사용할 준비가 되기 전에, 분수 desalted을 집중, 고 단백질 농도 결정 해야 합니다. GFP 기자 분석 결과 실험 (오른쪽) GFP 식 구조와 야생-타입 또는 선택한 효 모 삭제 돌연변이의 변환으로 시작합니다. 재배 후 세포 벽 RTA vivo에서 통풍 관을 허용 하도록 효소 처리에 의해 제거 됩니다. 다음, 효 모 세포 spheroplasts의 GFP 형광 형광 판독기에 시간이 지남에 독 소 치료와 치료 비 조건 하에서 측정 된다 (475/509 nm). 마지막으로, 상대 GFP 형광 단계 4.6에서에서 표시 하는 수식을 사용 하 여 결정 하 고 그림 4에서 볼 수 있듯이 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 대표 친화성 크로마토그래피 및 애완 동물-RTA(그의) 6 또는 빈 벡터 제어를 포함 하는 대장균 셀의 결과 담. RTA(그의) 6 벡터 pET24-RTA(그의) 6에서 표현 된 대장균 세포 lysate 샘플의 (A) 전형적인 정화 그래프. 파란 곡선은 나타냅니다 280에 UV 흡수 Trp, Tyr, 그리고 Cys 아미노산의 향기로운 반지에 의해 발생 및 단백질 표시기 역할. 열 로드 하는 동안 언바운드 단백질은 자형 (0-10 mL)에서 검색 됩니다. 바인딩 버퍼와 세척 하 여 언바운드 단백질을 제거한 후 차입 버퍼 농도 증가 0에서 100% (빨간 곡선) 하 고 바인딩된 단백질은 즉시 eluted 열에서. 25 그리고 30 mL 사이 파란 곡선의 피크 바인딩된 그의 태그 RTA (블랙 박스)의 비율을 나타냅니다. (B) 일반적인 정화 그래프는 대장균 lysate 빈 벡터 제어를 표현 하는 세포에서. (A)와 같이 같은 정화 프로토콜. 블랙 박스 같이 아무 단백질은 eluted 부정적인 컨트롤에 열에서. (C)의 친 화력 정화 후 대장균 pET24 RTA(그의) 6 샘플 Desalting 다이어그램. 다이어그램 보여줍니다 RTA 단백질 분수 (20-30 mL 사이 280 nm 흡수의 피크)의 분리 및 소금 분수 (30 mL 후 전도성 피크 증가).이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 친 화력 정화 전후 다른 샘플의 대표 서쪽 분석. 20 µ L 세포 lysate (차선 2-4) 또는 SDS 페이지와 Coomassie 파란 얼룩 분석 (수정 되지 않은 RTA는이 연구에 사용 되었다) 다른 RTA 변종의 정화 샘플 (레인 5-7). 레인 1, 단백질 사다리; 레인 2, 수정 되지 않은 RTA; 레인 3, RTAHDEL; 레인 4, RTAKDEL; 레인 5, 수정 되지 않은 RTA; 레인 6, RTAHDEL; 레인 7, RTAKDEL. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: RTA 취급 야생-타입 및 선택한 효 모 삭제 돌연변이 대 한 기자 시험에 의해 얻은 대표적인 결과. 야생-타입의 (A) 상대 GFP 형광은 기자 플라스 미드 pRS315-K28SP를 포함 하는 효 모 spheroplasts-GFP (오른쪽)에서 유도 (3% 갈 락 토스, GFPind.) 및 비 유도 (2% 유, GFPrepr.) 후 20 h GFP 조건 감 응 작용입니다. RTA 존재 상대 GFP 형광 분석 또한 (5 µ M), G418 (300 µ g/mL) 또는 부정적인 제어 (NC). 단백질 번역 억제제 G418 긍정적인 통제 역할을 효 모에 GFP 식. 평균값과 표준 편차 (SD) 표시 됩니다. (B) 상대 GFP 시간 코스 이상의 20 h로 표시과 (A)에서 형광. 이 다이어그램 RTA; 여 GFP 표현과 번역 억제의 타이밍에 대 한 추가 정보를 제공합니다. 곡선 동작 하는 cytosol RTA 통풍 관 및 세포내의 활동 직접적으로 반영 한다. 참여 (Hrd1p 및 Der1p) 또는 하지 것으로 알려진 세포질 단백질에 선택한 효 모 돌연변이 결함 (C) 대표 결과 (Yos9p 및 Nup120p) RTA 효 모1,6에 거래에 참여. 점선은 긍정적인 제어 종자로 얻은 형광 방출에 근거 하는 의미의 임계값을 나타냅니다 (추가 설명을 위한 참조6참조). 평균값과 표준 편차 (SD) 표시 됩니다. 그림 베 커 외 에서 수정 된 6 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 선호도 chromotography 매개 변수 | ||
| 매개 변수 측정 | 자외선 (280 nm), 차입 버퍼 농도, 전도성 | |
| 설정 | 변수/단위 | 값 |
| 흐름 율 | mL/min | 1 |
| 최대 열 압력 | MPa | 0.35 |
| 파장 | nm | 280 nm |
| 바인딩 버퍼 | 위치를 펌프 | A |
| 차입 버퍼 | 위치를 펌프 | B |
| 시작 농도 차입 버퍼 | % | 0 |
| 시스템 볼륨 보상 | mL | 10 |
| 열 평형 | mL | 20 |
| 샘플 superloop/주사기를 통해 주입 | mL | 세포 lysate 볼륨 |
| 세척 단계 | mL | 20-35 |
| 차입 단계 | mL | 20-35 |
| 차입 중 농도 차입 버퍼 | % | 100 |
| 재 열 20 %EtOH | mL | 50 |
| 매개 변수를 담 | ||
| 매개 변수 측정 | 자외선 (280 nm), 전도도 | |
| 설정 | 변수/단위 | 값 |
| 흐름 율 | mL/min | 4 |
| 최대 열 압력 | MPa | 0.35 |
| 파장 | nm | 280 nm |
| 바인딩 버퍼 | 위치를 펌프 | A |
| 차입 버퍼 | 위치를 펌프 | B |
| 시작 농도 차입 버퍼 | % | 0 |
| 시스템 볼륨 보상 | mL | 10 |
| 열 평형 | mL | 20 |
| 샘플 superloop/주사기를 통해 주입 | mL | 세포 lysate 볼륨 |
| 염 버퍼 주입 (0.8 M sorbitol) | mL | 100 |
| 재 열 20 %EtOH | mL | 50 |
표 1: 매개 변수 열 기반 친 화력 정화 및 담 사용. 모든 관련 열 설정 (예를 들어, 유량, 차입 버퍼 농도, 평형 및 세척 단계 기간) 및 (예를 들어, 전도도 또는 UV 흡수) 측정 된 매개 변수 목록입니다.
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Discussion
위의 프로토콜을 수행할 때 실험의 성공적인 결과 달성 하기 위해 다음 제안 사항을 권장 합니다.
분리 단백질 식, 1 mM의 IPTG 농도 초과 하지 중요 하다. IPTG 농도 > 1mm 억제 발기인 유도 RTA 표현과 독 수익률 낮은 리드. 또한, 셀 수 없습니다 재배 포함 체 형성, 비효율적인 폴딩, 및 독 소 비활성화를 방지 하기 위해 28 ° C 보다 높은 온도에서. RTA 식 (예를 들어, 20-28 ° C) 낮은 온도에서 가능 하 고 또한 생물 학적 활성 독 소의 생산 리드. 그러나, 추가 온도 감소 RTA 활동/접이식 크게 개선 되지 않습니다와 28 ° C (데이터 표시 되지 않음)에 비해 낮은 총 독 소 수율 결과.
친화성 크로마토그래피 (표 1)의 정화 매개 변수 자동된 정화 시스템의 사용에 대 한 5 mL Ni2 + 선호도 열을 갖춘 경우 다른 집에서 만든 또는 상업적 열 시스템을 조정 해야 최적화 된 RTA 순도 수율은 최적의입니다. 최적의 RTA 순도 (Coomassie 스테인드 SDS 젤에서 추가 단백질의 모양으로 표시), 경우 바인딩 버퍼의 이미 농도 증가 일반적으로 충전 된 단백질의 불특정 바인딩 감소는 열, 전체 RTA 순도 높인다입니다. 최적의 RTA 수율, 추가 sonification 단계 (4-8 펄스), 시간 (5 시간) 이상 보육 또는 더 큰 문화 볼륨의 경우 (> 1 L) 전반적인 독 소 수율을 향상 하는 데 도움이 수 있습니다. 그러나, 또한 성공적으로 RTA 스핀 열 기반 시스템 (데이터 표시 되지 않음)를 통해 정화 기회는 자동화 시스템 연구실에서 사용할 수 없는 경우.
염 단계는 전도도 상승 시작 하자마자 샘플링 절차를 건너뛰고 중요 하다. 소금, 특히 이미 오염 영향 단백질 농도 측정, GFP 기자 시험에 사용 된 RTA 콘텐츠를 직접 영향을 미치는 부정확 한 RTA 농도 결정의 결과로.
4 ° C에서 순화 된 RTA를 저장 하 고 동결 방지에 필수적 이다. 냉동된 샘플 표시 RTA의 감소 활동 XTT 기반 셀에 활력 분석 HeLa 세포 (데이터 표시 되지 않음). 약 3-4 주 전에 그들의 생물 학적 활동은 지속적으로 감소에 대 한 정화 샘플을 보관할 수 있습니다. RTA 보여줍니다 0.8 M sorbitol에서 침전 하는 경향이 있기 때문에 또한, 스핀 열 농도 후 높은 RTA 농도 (≥5 mg/mL)는 중요 합니다.
방법의 단점은 RTA 그대로 효 모 세포에 의해 채택 되지 일반적으로 사실입니다. 신뢰할 수 있는 결과 얻기 위해 효 모 세포 벽은 완전히 효소 처리에 의해 제거 될 필요가 있다. 따라서, 단계 3.4-3.5에에서 설명 된 방법으로 spheroplast 각 효 모 긴장의 형성 효율을 확인이 필수적입니다. 최적의 spheroplast 준비의 경우 부 화 시간과 용균성 효소 농도 최적화와 있어야 단계 대조 현미경 검사 법을 통해 모니터링 합니다. Overdigestion (유령 형성) 반대 접근 부족 한 소화 시 필요한 반면 용균성 효소 농도 및 부 화 시간을 줄여 예방할 수 있습니다. 부족 한 세포 벽 제거와 긴장에서 데이터 데이터 평가에서 제외 해야 합니다.
그것은 또한 실험적인 체제 신은 자연 중독 과정에 완전히 모방을 하지 않는 언급 되어야 합니다. 신은 (RTB)의 셀 바인딩 B 소 단위는 일반적으로 효율적인 독 소 바인딩 포유류 세포15의 세포 표면에 갈 락 토스 잔류물에 대 한 책임은 없습니다. 이론적으로,이 제한의 A와 B 소 단위를 포함 하는 순화 리 holotoxin와 함께 실험을 수행 하 여 극복할 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 효 모 세포는 갈 락 토스 잔류물 RTB8;의 바인딩 중재 수 있는 그들의 세포 표면에가지고 있지 않습니다. 이 사실은 또한 그대로 효 모 세포에 대 한 리를 구분 하지 않습니다 설명 합니다. 따라서, RTB 것 효 모 모델에서 셀 바인딩 구성 요소 역할을 하는 경우에 불분명 하다. 흥미롭게도, 이전 연구는 이미 RTA의 셀 B 소 단위16바인딩 없이 포유류 세포의 cytosol에 도달할 수는 설명 했다. 이 현상을 이해 하 우리 독 소는 cytosol에 플라즈마 막에서 인신 매매를 촉진 하는 효 모에 세포질 구성 요소를 식별 하는 실험적인 체제에만 RTA를 사용 하기로 결정 했습니다. 놀랍게도, RTA 효 모에 인신 매매에 관련 된 구성 요소 포유류 세포6효율적인 리 holotoxin 전송에 필요한 구성 요소를 눈에 띄는 유사성을 보여준다. 이러한 결과 바탕으로, 그것은 수 수 추측 RTB 이전 가정 보다 세포내 리 전송에서 작은 역할을 담당 하 고 포유류 세포 표면에 처음 접촉에 대 한 중요 한만.
반면, 포유류 세포에 siRNA 기반 시스템 완벽 하 게 자연 독 소 상황을 반영 하지만 어렵고 비싼3. 또한, 효 모 삭제 돌연변이 사용 하 여 곰 중요 한 이점이 있는 반면 siRNA 기반 시스템 일반적으로 단백질 레벨의 감소로 이어질 돌연변이, 관심사의 단백질의 완전 한 노크 아웃을 표시. 경우에 따라 잔여 단백질 수준의 독 소 전송 그것에 의하여 아무 변경 된 표현 형을 관찰 하 고, 따라서, 특정 단백질의 관련 siRNA 기반 시스템에 표시 되지 않습니다에 대 한 충분 한 될 수 있습니다.
비록만 중요 하지 않은 효 모 삭제 종자는 원래 연구6, 온도 민감한 긴장에서에서 사용 되었다 뿐 아니라 풍부 mRNA 섭 동 (습기) 컬렉션 긴장17 (에센셜 감소 식 수준 감소 단백질)은 마찬가지로 미래에 방법의이 종류를 위해 적당 한. 일반적으로, 필수 단백질의 역할 수 없습니다 따라서 분석 결과 시스템의 한계를 나타내는, 생존의 그들의 부족 때문에이 분석 결과와 조사.
그러나, 새로운 기자 분석 결과 모델 유기 체 S. cerevisiae의 RTA 교통을 분석 하 여 기존의 방법에는 우아하고 대안 전략을 나타냅니다. 기존 연구 세포내 플라스 미드 기반의 러시아 식 시스템을 사용 하 고 cytosol1,7에 응급실에서 레트로-전 좌의 분석에 제한 됩니다. Extracellular RTA 응용 프로그램의 성공적인 구현 가능성 뿐만 아니라 ER retrotranslocation 공부 뿐만 아니라 직접 분석 하지는 오후에서 RTA 전송 하지만 응급실에 Golgi 열립니다.세포질 기능 및 효 모에의 대부분의 지역화 유전자 요즘 발견 하 고 데이터베이스에서 사용할 수 있는 확인 된 후보 단백질 특정 구획에 직접 할당할 수 경로 전송.
전반적으로, 도입된 기자 시험 방법 후보 단백질의 세포내 독 소 또는 단백질 번역에서 vivo에는 (예를 들어, RTA) 독 소 subunits의 매매에 관련 된 식별 하는 간단 하 고 강력한 접근을 나타냅니다. 상대적으로 낮은 표준 편차 (1-10%)으로 원래 연구에 높은 데이터 재현성이이 문을 확인 합니다. 96-잘 플레이트 형식으로 다양 한 효 모 돌연변이의 빠른 심사 독 소 정화 후 하루 안에 가능 하다.
미래에, 효 모 삭제 라이브러리의 높은 처리량 검열에 대 한 메서드를 사용 하는 가능성이 있다. 현재 설정에서 적용 된 RTA 농도 (5 µ M) 50% 상대 GFP 형광을 줄일 수 있다. 이러한 조건에서 메서드 삭제 돌연변이 네거티브 (증가 GFP 형광)와 긍정적인 (감소 GFP 형광) 효과 RTA 전송에 식별 이점을 제공 합니다. 높은 처리량 검사에 대 한 치료와 치료 비 샘플 더 강한 차이 때로는 도움이 됩니다. RTA 높은 농도 사용 하 여 및/또는 측정 간격 (예를 들어, 48 h) 증가, GFP 식의 훨씬 더 발음된 블록 달성 해야 합니다.
이 방법은 효 모에 extracellular 적용된 RTA의 중독 과정 분석 하만 제한 되지 않습니다 하지만 또한 RTA의 응급실 가져오기가 GFP 기자 긴장에 플라스 미드를 통해 RTA를 표현 하 여 분석 하는 기회는 강조 될 것 이다 (데이터 하지 표시). 또한, 심사 방법은 마찬가지로 미래에 zymocin18 같은 단백질을 억제 다른 단백질 생 합성의 세포내 수송 경로 공부 적응 수 있다. Zymocin의 특징이 잘 죽이 모드, 달리 상대적으로 작은 밀매 경로 cytosol19,20으로 효율적인 독 전송에 대 한 책임에 대 한 알려져 있다. 따라서, zymocin zymocin 효 모 세포에 의해 채택 자연스럽 게 미래 연구에 대 한 최적의 후보를 나타냅니다. 따라서, 세포 벽의 제거 생략할 수 있습니다 (시간 및 비용)에 관하여 GFP 기자 시험의 전반적인 성능이 향상 됩니다. 이 강력한 기자 분석 결과의 도움으로, 그것은 효 모에 zymocin의 세포내 수송 노동자를 부 수는 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 연구의 부분을 친절 하 게 도이치 가운데 (SFB 1027, A6)에서 교부 금에 의해 지원 했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacterial and yeast strains | |||
| E. coli BL21 DE3(Gold) | Aligent Technologies | 230130 | |
| S. cerevisiae BY4742 | Euroscarf | Y10000 | |
| S. cerevisiae BY4742 deletion mutants | Dharmacon | YSC1054 | whole collection |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids used in this protocol | |||
| pET24a(+) (Novagen) | Millipore | 69772-3 | |
| pET-RTA(His6) | Becker et al. (2016)3 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Zymolyase 20T | USBio | Z1000.250 | lytic enzyme for cell wall removal |
| LB broth medium | Thermo Scientific | 10855021 | 15 g agar was added for plate production |
| YNB | Thermo Scientific | DF0335-15-9 | |
| Ammonium sulfate | Sigma-Aldrich | A4418-100G | |
| Yeast drop-out mix supplemts without leucine | Sigma-Aldrich | Y1376-20G | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040-100G | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| DTT | Sigma-Aldrich | 10197777001 | |
| D-raffinose | Sigma-Aldrich | 83400-25G | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-1KG | |
| D-galactose | Sigma-Aldrich | G0750-10MG | |
| G418 | Thermo Scientific | 11811031 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Imidazole | Roth | 3899.1 | |
| PAGE ruler prestained | Fermentas | 26616 | protein ladder used for Western analysis |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for RTA purification, desalting and reader measurements | |||
| Spectrophotometer Ultrospec 2100 pro | Amersham | ||
| Soniprep 150 | MSE | old model, other models available | |
| Fluoroskan Ascent | Thermo Scientific | 5210470 | old model, not available anymore |
| ÄKTAPurifier | Thermo Scientific | 28406266 | Product is discontinued and replaced |
| HisTRAP HP column | GE Healthcare | 17-5248-02 | |
| HiTRAP desalting column | GE Healthcare | 11-0003-29 | |
| Midisart sterile filter | Sartorius | 16534K | 0.2 µm pore size |
| BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| 660 nm assay kit | Thermo Scientific | 22660 | |
| 96 well plates | Thermo Scientific | 260860 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies (optional) | |||
| Anti-Tetra-His | Qiagen | 34670 | primary antibody; 1:1,000 dilution |
| Anti-mouse-HRP | Sigma-Aldrich | A9044-2ML | secondary antibody, 1:10,000 dilution |
References
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