Summary
Tidigare utfördes oftast små djur bestrålning utan förmågan att rikta en väl avgränsad tumör volym. Målet var att efterlikna behandling av mänskliga glioblastoma hos råttor. Använda en liten djur bestrålning plattform, utfört vi MRI-guidad 3D conformal bestrålning med PET-baserade sub volym öka i en preklinisk inställning.
Abstract
I decennier har utfördes små djur strålning forskning mestadels använder ganska rå försöksuppställningar tillämpa enkla enkel-beam tekniker utan förmågan för att rikta en specifik eller väl avgränsad tumör volym. Leverans av strålning uppnås med hjälp av fasta strålkällor eller linjära acceleratorer producerar megavoltage (MV) röntgen. Dessa enheter är oförmögen att uppnå sub millimeter precision krävs för små djur. Dessutom höga doser levererade till friska omgivande vävnad hindrar svar bedömning. För att öka översättningen mellan små studier på djur och människor, var vårt mål att efterlikna behandling av mänskliga glioblastoma i en råtta modell. För att möjliggöra en mer exakt bestrålning i en preklinisk inställning, nyligen, utvecklades precision bild-guidad små djur strålning forskningsplattformar. Liknar mänskliga planeringssystem, dosplanering på dessa mikro-irradiators är baserad på datortomografi (CT). Dock gör låg mjukvävnad kontrast på CT det mycket svårt att lokalisera målen i vissa vävnader, till exempel hjärnan. Därför skulle innehåller magnetisk resonanstomografi (MRT), som har utmärkt mjukvävnad kontrast jämfört med CT, möjliggöra en mer exakt avgränsning av målet för bestrålning. Under senaste fick årtiondet också biologiska avbildningstekniker, såsom positronemissionstomografi (PET) intresse för strålning terapi behandling vägledning. PET möjliggör visualisering av t.ex., glukos förbrukning, aminosyra transport eller hypoxi, närvarande i tumören. Inriktning de mycket proliferativ eller radio-resistenta delarna av tumören med en högre dos kan ge en överlevnadsfördel. Denna hypotes ledde till införandet av de biologiska tumör volym (BTV), förutom konventionell brutto målvolymen (GTV), kliniska målvolymen (CTV) och planerade målvolym (PTV).
Vid prekliniska imaging lab av Gents universitet finns en mikro-irradiator, ett litet djur som husdjur och en 7 T litet djur MRI. Målet var att införliva MRI-guidad bestrålning och PET-guidad sub volym öka i en glioblastoma råtta modell.
Introduction
Höggradigt gliom är den vanligaste och mest aggressiva elakartad hjärntumör hos vuxna med en medianöverlevnad på 1 år trots nuvarande behandlingsmetoder. Standarden på sjukvård omfattar maximal kirurgisk resektion följt av kombinerade extern strålbehandling (RT) och temozolomid (TMZ), följt av underhållsbehandling TMZ1,2,3. Sedan införandet av TMZ nu mer än 15 år sedan, har ingen betydande förbättringar gjorts i behandlingen av dessa tumörer. Genomförandet av nya terapeutiska strategier är brådskande därför men bör undersökas först i små djur cancer behandling modeller (mestadels möss och råttor). Tumör-bärande gnagare modeller kan användas för att undersöka effekten av nya och komplexa strålning protokoll, eventuellt i kombination med andra medel för (ny) behandling, att bedöma strålning svar eller för att utreda radio-skyddande medel. En stor fördel med prekliniska strålning forskning är förmågan att arbeta under kontrollerade experimentella förhållanden med stora kohorter vilket resulterar i snabbare data avkastning på grund av den kortare livslängder av gnagare. De prekliniska fynd bör sedan översättas till en klinisk prövning på ett mycket snabbare och effektivare sätt än i nuvarande praxis4.
Små djur strålning experiment under de senaste decennierna har vanligtvis uppnåtts med fasta strålning källor5,6,7, t.ex., 137Cs och 60Co, isotoper, eller linjär acceleratorer avsedd för mänskliga kliniska, tillämpa ett enda strålfält med MV röntgen6,8,9,10,11. Dessa enheter når dock inte sub millimeter precision, vilket krävs för små djur12. Dessutom har MV röntgen egenskaper som är olämpliga för bestråla små mål, såsom en dos uppbyggnad på gränssnittet luft-vävnad i regionen entré i balken med en grad i storleksordningen djuret storlek själv4,6 ,8,9,10,11. Det senare gör det ganska utmanande att leverera en enhetlig dos till en tumör och skona kring hjärnans normala vävnaden4,8,9,10,11. Därför är det oklart i vilken utsträckning nuvarande Djurstudier är fortfarande relevanta för moderna RT praktiken12. I detta sammanhang nyligen utvecklade tredimensionella (3D) conformal små djur mikro-irradiators är lovande att överbrygga teknikklyftan mellan avancerade 3D bild-guidad RT tekniker såsom intensitet moduleras strålterapi (IMRT) eller conformal bågar används i människor och nuvarande små djur bestrålning4,13. Dessa plattformar gör användningen av en kilovoltage (kV) röntgen källa att få skarpa penumbras och undvika dos uppbyggnad. Dessa plattformar omfattar en datorstyrd scen för djur som positionering, en kV röntgen källa för imaging och strålbehandling, en roterande gantry församling att tillåta strålning leverans från olika vinklar, och ett kollimerande system att forma strålknippet 4. under 2011, en mikro-irradiator installerades vid preklinisk imaging lab av Gents universitet (figur 1). Detta system liknar moderna mänskliga strålbehandling praxis och möjliggör en mängd olika prekliniska experiment, såsom samverkan mellan strålning med andra terapier, komplexa strålning system och bild-guidad delmål boost studier.
Dosplanering på dessa mikro-irradiators är baserad på CT, vilket motsvarar mänskliga planering system14,15. För CT imaging används en on-board röntgen detektor i kombination med samma kV röntgenröret som används under behandling. CT-avbildning används eftersom det möjliggör precisionspositionering djur och ger nödvändig information för enskilda strålning dosberäkningar via segmentering. Dock på grund av låg mjukvävnad kontrasten i CT kan inte imaging, tumörer i hjärnan av små djur, såsom höggradigt gliom, enkelt avgränsas. Införlivandet av multimodalitet imaging är därför nödvändig för ett korrekt mål volym avgränsning. Jämfört med CT, ger MRI överlägsen mjukvävnad kontrast. Detta gör det mycket lättare att visualisera lesion gränser som kommer att resultera i en mycket bättre avgränsning av målvolymen, hjälper till att förbättra bestråla lesionen och undvika omgivande vävnad, som illustreras i figur 24, 16. Ytterligare en fördel är att MRI använder icke-joniserande strålning, till skillnad från CT som använder joniserande strålning. De stora nackdelarna med MRI är relativt lång anskaffningstid och höga driftskostnader. Det är viktigt att notera att Magnettomografi inte kan användas för dosberäkningar, eftersom de inte ger krävs elektronen täthet informationen, även om framsteg har gjorts på detta område, också med den senaste utvecklingen av herr-LINJÄRACCELERATORER. Som sådan, är en kombinerad CT/MRI datamängd metoden för val av planering bestrålning av malignt gliom, som innehåller både den information som krävs för inriktning (MRI-baserade volymer) och dosberäkningar (CT-baserade elektrontätheten).
För att minska klyftan mellan små djur bestrålning och klinisk rutin, måste MRI klart integreras i arbetsflödet av det mikro-irradiator, som kräver en korrekt registrering mellan MRT och CT, vilket är långtifrån trivial. I detta papper, våra protokoll för MRI-guidad 3D conformal bestrålning av F98 glioblastoma råttor diskuteras, publicerats som har nyligen17.
Även införliva CT och Mr i arbetsflödet för den mikro-irradiator är ett tydligt steg framåt i små djur bestrålning forskning, att dessa anatomiska avbildningstekniker inte alltid en fullständig definition av målvolymen. Patologiska förändringar i hjärnan på CT och Mr kännetecknas av ökad vattenhalt (ödem) och läckage av blod - hjärnbarriären eller kontrastförstärkning. Både kontrastförbättring och hyper-intensiva områden på T2-viktade MRI är dock inte alltid en korrekt bild av tumör grad.Tumörceller har upptäckts långt utanför marginalerna kontrastförbättring12. Ingen av dessa tekniker också, kan identifiera de mest aggressiva delarna inom tumören, som kan vara ansvariga för terapeutiska motstånd och tumören återkommer. Därför ytterligare information från molekylära avbildningstekniker som husdjur kan ha ett mervärde för RT rikta volym definition eftersom dessa tekniker möjliggör för att visualisera biologiska spridningsvägar i vivo12,18, 19.
År 2000 införde Ling et al. begreppet biologisk målvolymen (BTV) genom att integrera strålbehandling arbetsflödet, vilket leder till vad de kallade flerdimensionella konform strålbehandling20anatomiska och funktionella imaging. Detta skapar möjligheten att förbättra dos inriktning genom att leverera en icke-uniform dos till en målregion med till exempel PET-bilder. Mest använda PET tracer för tumör staging och för att övervaka behandlingen svar är fluor-18 (18F) märkt fluorodeoxyglucose (FDG), som visualiserar glukos metabolism21. I huvud och hals cancer, har tidigare studier visat att användning av 18F-FDG PET ledde till en bättre uppskattning av den faktiska tumör volymen, som definieras av patologiska exemplaren, jämfört med CT och Mr22. I primära hjärnan har tumörer, där FDG inte är användbara på grund av mycket stark bakgrund signalen från den normala hjärnan, aminosyror, såsom 11C-metionin och mer nyligen 18F-fluoroetthyltyrosine (FET), undersökts för GTV avgränsning med ofta markanta skillnader mellan aminosyror PET och MRI-baserade GTVs23. Dock har ingen prospektiv prövning undersöka innebörden av detta konstaterande inte utförts ännu. I denna studie valde vi den aminosyra tracer 18F-FET och hypoxi tracer 18F-fluoroazomycin-arabinoside (18F-FAZA). 18 F-FET och 18F-FAZA valdes eftersom ett ökat upptag av aminosyror är starkt korrelerad med den spridning i GB tumörer, medan upptag av en hypoxi PET-tracer är korrelerad med resistens mot (cellgifter) strålbehandling18 , 23. sub volym öka med hjälp av mikro-irradiator optimerades genom att ge en extra stråldos till en PET-definierad del av F98 GB tumören hos råttor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studien godkändes av den etiska kommittén för djurförsök (ECD 09/23 och ECD 12/28). Alla kommersiella Detaljer kan hittas i Tabellen av material.
1. F98 GB råtta Cell modell
- Kultur F98 GB cellerna, erhålls från ATCC, i enskiktslager använder Dulbeccos modifierade Eagle Medium, 10% kalvserum, 1% penicillin, streptomycin 1%, 1% L-glutamin och 0,1% amfotericinB, och placera i en CO2 inkubator (5% CO2 och 37 ° C).
- Inokulera gliom cellerna i hjärnan hos honråttor Fischer F344 (kroppsvikt 170 g).
- Använd sterila instrument och bära sterila handskar vid alla tidpunkter.
- Söva råttorna genom att injicera en blandning av 74 mg/kg ketamin och 11 mg/kg xylazin intrapertioneally (IP) med en insulinspruta (1 mL, 29 G). Bekräfta anesthetization genom avsaknad av svar till tillbakadragande reflexen av lemmen. Immobilisera råttorna i en stereotaktisk enhet med fästpunkter för näsa och öron. Plats en karbomer eye gel för att förhindra torrhet i ögon medan under narkos.
- Raka råtta från ögonhöjd på baksidan av skallen och desinfektera huden med povidonjod.
- Exponera skallen genom ett mittlinjen hårbotten snitt av 2 cm, och göra en 1 mm hål (diamond drill) 2 mm posteriort och 2,5 mm laterala till bregma på höger frontal halvklotet.
- Infoga en stereotactically guidade insulin nål (29 G) och injicera 5 µL cellsuspension (20.000 F98 GB celler) 3 mm djup med en mikrosprutan pump controller (inställningar: injicera (I50), Betygsätt 1 nL/s (001 SDN)).
- Ta ut sprutan långsamt och Stäng snitt med ben vax. Suturera huden och desinficera med povidonjod.
- Stabilisera kroppstemperaturen hos djur efter operationen med en röd lampa. Övervaka uppvaknandet av råtta tills den har återfått tillräcklig medvetande för att upprätthålla sternala koordinationsrubbning. Inte tillbaka djuret till företaget av andra djur tills återhämtat sig helt. Hålla alla djur under miljömässigt kontrollerade förhållanden (12 h normal ljus/mörk cykler, 20-24 ° C och 40-70% relativ fuktighet) med mat och vatten ad libitum. Se till att noga följa djuren genom att övervaka sin kroppsvikt, mat, vattenintag, och deras aktivitet och normalt beteende. Använd en dödlig dos av pentobarbital natrium för att avliva djuren (160 mg/kg) om en minskning med 20% kroppsvikt observeras eller när den normala beteenden allvarligt försämras (t.ex., brist på grooming).
2. bekräftelse av tumörtillväxt
Obs: Utvärdera tumör tillväxt 8 dagar efter inympningen med T2-viktade MRI, dynamisk kontrastförstärkt MRT (DCE-MRI) och kontrastförstärkt T1-vägd MRI. När tumören når en storlek på 2,5 x 2,5 x 2,5 mm3, Välj råtta för terapi.
- Anslut först en 30 G nål till en 60 cm lång slang, som placeras intravenöst i laterala svans venen. Söva råttorna genom en Kona med 2% isofluran blandas med syre (0,3 L/min). Bekräfta anesthetization när råttorna inte svarar på tillbakadragande reflexen av lemmen. Täcka råttorna med en uppvärmd filt och placera dem i MRI sängen. Använda en karbomer ögongel för att förhindra torrhet.
- Placera sängen i hållaren med en fast råtta hjärnan ytan spole och placera sängen i en 72 mm råtta hela kroppen sändare spole.
- Genomsökning av localizer följt av en T2-viktade spin-echo-skanning för att bedöma tumörens tillväxt. T2-MRI sekvens Detaljer: 109 µm isotropiskt i-plane upplösning, 4 medelvärden, slice tjocklek 600 µm, TR/TE 3661/37,1 ms, TA 9 min 45 s.
- Om tumören är bekräftat på T2-viktade förvärvet, injicera ett gadoliniuminnehållande kontrastmedel intravenöst placeras slangen (MRI kontrastmedel, 0,4 mL/kg) 30 s efter starten av DCE-MRI förvärvet. Förvärva DCE-MRI under 12 min med en snabb-låg vinkel skott (FLASH) sekvens i en cirkelsektor (1 mm skiva tjocklek). Använda en i-plane spatial upplösning (312 µm2) och en temporal upplösning på 1,34 s.
- Använda verktyget bild sekvens, Välj en region av intresse (ROI) inom regionen misstänkt tumör att rita signalintensitet över tid. Därefter analysera formen på kurvan resulterande DCE för att bekräfta närvaron av glioblastom (figur 3).
- Slutligen, förvärva en kontrastförstärkt T1-viktade spin-echo-sekvens. T1-MRI sekvens Detaljer: TR/TE 1539/9,7 ms, 117 µm isotropiskt i-plane upplösning, slice tjocklek 600 µm, 3 medelvärden, TA 4 min 15 s. typiska kontrastförstärkt MR T1-viktade bilder visas i figur 2.
- Efter slutbehandlingen T1-viktad sekvens, kan djuret vaknar under kontinuerlig övervakning, tills det återfår fullt medvetande.
3. multimodalitet Imaging för val av mål-volym
Obs: För att kunna utföra MRI-guidad 3D conformal bestrålning av F98 GB råtta modell med PET-guidad sub volym öka, 3 imaging villkoren behöver utföras. Först injicera radiotracer, därefter utföra MRI under upptag av spårsubstans, därefter utför en statisk PET-förvärv och en dosplanering CT.
- Söva djuren med en Kona med 2% isofluran blandas med syre (0,3 L/min). Bekräfta anesthetization när råttorna inte svarar på tillbakadragande reflexen av lemmen. Använda en karbomer ögongel för att förhindra torrhet under anestesi.
- Infoga en kateter (26 G) i svansen ven, aktivera injektion av 37 MBq av PET radioaktivt spårämne upplöst i 200 µL saltlösning. Injicera antingen 18F-FET eller 18F-FAZA, 30 min eller 2 h före PET förvärv, respektive.
- Injicera MRI kontrastmedel (0,4 mL/kg) intravenöst i svansen anda med katetern 15 min innan PET förvärv.
- Placera råttorna på en egen gjort multimodalitet säng och säkra använda krok-och-loop fästelement, att upprätthålla en fast position under imaging och mikro-bestrålning (figur 1).
- Fixa tre multimodalitet markörer (kapillärerna fylld med vatten) under, ovan och till höger av skallen. Placera råtta, fortfarande fast på multimodalitet sängen, i djur innehavaren av magnetkameran, fixa råtta hjärnan ytan spolen och placera detta upplägg i en 72 mm råtta hela kroppen sändare spole. Genomsökning av localizer följt av en kontrastförstärkt T1-viktade spin-echo-sekvens.
- Transportera djuret för att utföra en 18F-FET eller 18F-FAZA PET förvärv. Förvärva en 30 min statiska PET scan i lista-läge. Scan bör förvärvas antingen 30 min efter 18F-FET injektion eller 2 h efter 18F-FAZA injektion.
4. RT dosplanering
- Använd den prekliniska dosplaneringssystem (PCTPS) för dosplanering. Importera planering CT till PCTPS och manuellt segmentera denna CT bild i tre olika vävnad klasser: Ben, mjukvävnad och luft. Denna manuella segmentering är baserad på definiera tre olika grå-tröskelvärden på planering CT. Dessa manuellt valda grå-tröskelvärden bör väljas så att luften i hjärnan är frånvarande och att Ben tjocklek av skallen är noll. När tröskelvärdena definieras, tilldelas materiella tätheter av PCTPS för ben och mjuk vävnad luft (figur 4).
- Om bara MRI vägledning behövs, Ladda MRI scan och samtidig registrera med planering CT med hjälp av PCTPS.
- Använd styvt förkroppsligar transformationer (tre översättningar och tre rotationer), multimodalitet markörer och skallen. Markeringsområde med ökad signal intensiteten i skallen på CT med svart signal på MRI, en exakt fusion kan uppnås (figur 5).
- Välj mål för bestrålning i mitten av kontrast-förbättra tumören på T1-viktade MRI, se figur 6 och figur 7.
- När ytterligare PET information måste inkluderas, inkludera en CT/MRT/PET samtidig registrering med hjälp av biomedicinsk avbildning kvantifiering programvara (BIQS).
- Använd verktyget contouring i BIQS för att uppnå PET/Mr bild fusion (figur 8). Efter samtidig registrering, Välj mål i mitten av det ökade upptaget av spårsubstans PET i BIQS (figur 9) och ange koordinaterna manuellt i den PCTPS som använder de följande omvandlingarna: X → -X, Y → Z och Z → -Y.
- Välj den ordinerade dosen, antal bågar, arc position, rotation utbud av bågarna och kollimator storlek (figur 10).
- Använd följande inställningar för MRI-guidad RT,: en föreskriven dos av 20 Gy, 3 bågar placerad vid soffan-45 °, 0 ° och 45 ° med arc rotationer av 120 °, och en kollimator storlek 5 x 5 mm.
- Använd följande inställningar för PET-Mr-guidad RT,: en föreskriven dos av 20 Gy med 3 bågar och en 5 x 5 mm kollimator och extra 5 Gy för sub volym öka med 3 icke-plana bågar och en 1 x 1 mm kollimator. Välj en rotation av 120 ° för alla bågar när du byter position i soffan (-45 °, 0 ° och 45 °).
- Beräkna dosen fördelningen inom djuret och parametrarna beam leverans att leverera den ordinerade dosen till målet med hjälp av PCTPS. Innan själva bestrålning, testa arc rotationer vid olika soffan positioner att förhindra någon kollision under bestrålningen.
- Faktiska bestrålningsanläggningar, Välj ett 0,15 mm koppar filter, ange röntgen spänningen till 220 kV, ange röntgen nuvarande 13 mA och ställning den rätt kollimator på utlastningsanordningen. Utföra RT genom att överföra lämpliga beam leverans parametrar från PCTPS till den mikro-irradiator.
- Under dessa förfaranden, råtta hålls under kontinuerlig isofluran anestesi (2% isofluran, blandas med syre 0,3 L/min). Efter genomförandet av den sista bågen, kan djuret vaknar under kontinuerlig övervakning, tills det återfår fullt medvetande.
5. dos volym histogram (DVHs)
Obs: För att jämföra den faktiska dosen levereras till tumör mål volymerna och den omgivande normal hjärnvävnaden, beräkna DVHs.
- Rita en volym-of-intresse (VOI) runt tumören och normala hjärnan på T1-viktade kontrastförstärkt MR bilderna att beräkna medelvärde, högsta och lägsta dosen (figur 11).
- Som ett surrogat för maximal beräkna menar, och minimal dos att ljudvolymen i tumören och den normala hjärnan vävnad, den D2, D50och D90. D står för den dosen av x % av volymen, betecknas med nedsänkt och kan härledas från den resulterande DVH.
6. TMZ och Sham kemoterapi
- För att efterlikna behandling av glioblastoma hos patienter, administrera samtidig kemoterapi använder IP-injektioner av 29 mg/kg TMZ upplöst i saltlösning med 25% dimetylsulfoxid (DMSO) en gång dagligen i 5 dagar börjar på dagen av bestrålning24, 25. Använd 1 mL, 29 G insulinspruta att administrera injektionen.
- För kontrollgruppen, administrera injektionen från steg 6.1 utan TMZ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att efterlikna mänsklig behandling metoden för bestrålning av glioblastoma i en preklinisk modell, var införandet av MRI-guidad strålbehandling nödvändigt. Använda PCTPS och mikro-irradiator gränssnittet kunde vi bestråla F98 glioblastoma hos råttor med flera conformal icke-plana bågar inriktning kontrastförstärkt regionen på T1-viktade MRI17. Rigid-kroppen transformationer i kombination med en multimodalitet säng användes för bildregistrering mellan MRT och planering CT. Isocenter för bestrålning valdes i centrera av regionen kontrastförstärkt tumör på T1-viktade MRI (figur 7).
Dos-distributioner och kumulativa DVHs för medelvärdet, minimal och maximal dos av målvolymen och hjärnans normala vävnaden volymen beräknades för fem olika djur (figur 12). Baserat på likheten med protokollet kliniska bestrålning och en optimal dos distribution, valdes en dos plan med tre icke-plana bågar. 90% av målvolymen tillämpa den senare, och fick den önska dosen, samtidigt minimera dosen till hjärnans normala vävnaden17.
Efter bekräfta genomförbarheten av MRI-guidad bestrålning av F98 råtta glioblastoma modellen, försökte vi införliva PET-baserade sub volym öka i prekliniska arbetsflödet för RT planering. Vi har kunnat kombinera 3 avbildningsmetoder, utför först MRI och PET, och slutligen CT medan råttan är fast på en egen gjord multimodalitet säng (figur 1). För samtidig registrering av dessa modaliteter använde vi den BIQS, möjliggör mycket mer verktyg för styv matchande (figur 8). Tillämpa en enkel omformning, både MR och PET baserat isocenter (figur 9) skulle kunna överföras till PCTPS. I figur 13visas både MRI och PET-baserade isocenter för bestrålning efter dos beräkning i PCTPS. För att bestråla hela kontrast förbättrar volymen vi valt en 5 x 5 kollimator och tre bågar roterande 120 °. För att öka den mest metaboliskt aktiva tumör delen på 18F-FET PET identifierade eller den mest hypoxisk tumör del identifieras på 18F-FAZA PET, en dos av 5 Gy valdes och levereras med en kollimator med 1 mm diameter. Igen, 3 bågar roterande 120 ° tillämpas.
Figur 1: Micro-irradiator integrera en kV röntgenrör, en roterande gantry, en datorstyrd robotic scenen, ett kollimerande system att forma balken och en platta CT detektor. Djuret har placerats på en 4 mm tjock PVC multimodalitet säng att förhindra rörelser mellan flera imaging förvärv, såsom en Mr-undersökning som följt av en planering CT, vilket underlättar bild fusion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Glioblastoma bekräftelse. T1-vägd MRI T2-vägd MRI och DCE-MRI av en F98 GB råtta. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: DCE kurva. Använda verktyget bild sekvens, en ROI kan väljas på DCE-MRI scan to Rita signalintensitet över tid. Därefter är analys av formen på den resulterande DCE-kurvan kan bekräfta förekomsten av glioblastom. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: CT segmentering. Segmentering baserad på CT görs genom att manuellt definiera ett antal tröskelvärden att noggrant skilja luft från lungvävnad, fettvävnad, ben och andra vävnader i bilden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: MRI-CT fusion. Markeringsområde med ökad signal intensiteten i skallen på CT med svart signal på MRI, kan en exakt fusion uppnås. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Cone beam CT Ingen tumör syns på CT, vilket gör det omöjligt att välja isocenter i mitten av tumören. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: kontrastförstärkt T1-vägd MRI. Kontrastförstärkt T1-vägd MRI visualiserar klart en råtta F98 hjärntumör. Mitten av kontrast-förbättringen har valts som isocenter för RT planering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: MRI-PET fusion. Med verktyget contouring i BIQS, uppnås PET/Mr bild fusion.Klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 9: val av MRI-PET mål. Mål för bestrålning är vald i mitten av kontrast-enhancement på T1-viktade MRI (vänster). Målet för sub volym öka väljs i mitten av ökad signalen på 18F-FET PET (höger). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 10: strålbehandling planering. Att beräkna strålbehandling planering, Välj isocenter, föreskriven dos, antal bågar, arc position, rotation utbud av bågarna och kollimator storlek. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 11: DVH beräkning. Rita en volym-of-intresse (VOI) runt tumören på T1-viktade kontrastförstärkt MR bilderna för att beräkna DVH inom denna volym. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 12: dos plan med kontrastförstärkt T1-vägd MRI och tre icke-plana arcsto leverera 20 Gy till målvolymen. Till höger ges den kumulativa dosen volym Histogram (DVH) om tumör volym och normal hjärnvävnad avgränsas på kontrastförstärkt T1-vägd MRI. Denna siffra har ändrats från Bolcaen et al. 20 vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 13: utvalda MRI och PET-guidad isocenter för bestrålning. CT bilden i axiell, koronalt och sagittal se visualiseras med dos planen att leverera 20 Gy till målet (gula regionen). Den isocenter som identifierades på MRI som förbättrar kontrast är synlig (grön) och den isocenter lokaliserade på metaboliskt aktiva tumör delen på 18F-FET PET identifierade är också synliga (röd). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För att uppnå korrekt bestrålning av glioblastoma tumör målet i råtthjärna, var mikro-irradiator's ombord CT vägledning inte tillräcklig. Hjärntumörer är knappt synlig på grund av otillräcklig mjukvävnad kontrast, även om kontrastförbättring skulle användas. Som sådan, måste MRI inkluderas för att tillåta mer exakt bestrålning. Med en sekventiell herr förvärv på ett 7 T-system och en datortomografen på de micro-irradiator vi kunde rikta dosen till kontrast förbättrar tumörvävnad i hjärnan och beräkna en dos plan använder planering CT. Detta var möjligt efter bild fusion och dos beräkningar med hjälp av PCTPS17. Det bör dock hållas i åtanke att MRI är benägna att geometriska förvrängningar som inte korrigeras i detta protokoll. Dessutom innan översätta detta bestrålning protokoll till andra delar av kroppen, behövs ytterligare forskning. Vikten av en korrekt vävnad segmentering på grund av användningen av kV lågenergetiska fotoner övervägas. Medan segmentering i tre vävnad klasser kan vara tillräcklig i råtthjärna, behöver mer vävnad klasser anges i regionen bröstkorg eller buk i råttor att tillhandahålla korrekta dosberäkningar. För att undvika rörelse under transport mellan de olika bildgivande system, vi gjord använda av multimodalitet säng vilket minimerar förflyttning av huvudet (figur 1). Dock krävs en extra ansträngning vid tillämpningen av detta protokoll till andra delar av kroppen, antingen bröstkorg eller buk regioner. Särskilt små djur bestrålning av organ påverkas av respiratoriska rörelse eller intestinal transitering är fortfarande utmanande.
Införlivandet av PET-guidad sub volym öka visade också att vara möjligt, trots ett arbetsintensiva protokoll. En fördel med nukleära avbildningstekniker, såsom PET, är förmågan att bild heterogenitet inom tumörer, som tillåter inriktning metaboliskt mycket aktiv eller strålning resistenta delar av tumören. Vi kunde öka dosen, särskilt inriktade på den mest biologiskt aktiva eller mest hypoxisk regionen av tumören med hjälp av 18F-FET PET eller 18F-FAZA PET, respektive. Det kritiska steget i protokollet är samtidig bildregistrering. Ingen programvara är för närvarande kunna automatiskt Co registrera prekliniska Mr eller CT med PET-bilder med tillräckligt hög noggrannhet och reproducerbarhet. PET-spårämnen i neuro-onkologi visar i allmänhet, ett lågt upptag i normal hjärna som komplicerar registreringsprocessen. För fusion av de tre avbildningsmetoder (CT/MRT/PET) föredrog vi BIQS i stället för den PCTPS, som inte utvecklas för närvarande att enkelt kombinera flera avbildningsmetoder. BIQS har dessutom fler smarta verktyg för styv matchning. En stor hjälp är också användningen av en multimodalitet säng, förhindra rörelse av djur mellan olika imaging förvärven. Dock manuell samtidig registrering är tidskrävande och ökar tiden för bedövning av djur. När bildregistrering uppnås, var Exportera koordinater från BIQS till PCTPS genomförbart genom att tillämpa en enkel omformning på målet koordinater.
Det är inte bara viktigt att exakt rikta (biologisk) tumör volym: sparande av den omgivande normal hjärnvävnaden måste hänsyn också tas till. Det senare är ofta eftersatt i nuvarande djur strålbehandling experiment men mycket viktigt att göra modellen också kliniskt relevanta. Detta uppnåddes genom att tillämpa flera icke-plana bågar. Till vår kunskap tillämpades aldrig flera arc kraniala bestrålning i små djur innan. När det gäller balk användning är denna metod i nära likhet med den kliniska bilden-guidad conformal RT och på grund av användningen av arc behandling målet i slutändan får den ordinerade dosen, medan de normala vävnaderna får endast en bråkdel av den. Som sådan, görs ett första steg att minimera gapet mellan preklinisk och klinisk RT teknik17. En begränsning av denna mikro-irradiator är att gantry rotation är begränsad till 120 °. Kombinera arc rotationer med en förändring i soffan position ytterligare ökat sparande av hjärnans normala vävnaden som omger tumören målet.
Denna metodik är ett viktigt steg mot införandet av biologiska avbildningsmetoder för strålbehandling vägledning. Dock behövs ny utveckling att förenkla pre-klinisk bild fusion och införliva dos målning av siffror (DPBN) i prekliniska applikationer. Använder den nuvarande micro-irradiator, ska vi nu kunna tillämpa sub volym öka; DPBN är dock inte ännu möjligt på grund av begränsningar i dosberäkningar, gantry rotationer och kollimator design. Slutligen, utvecklingen av kompakt preklinisk PET skannrar erbjuder sub millimeter rumslig upplösning är lovande26 och dessa enheter kan ge en mycket elegant lösning för att integrera PET i en liten djur strålning plattform.
Vi visat tillämpligheten av denna modell för kombinerade MRI och PET-guidad bestrålning och kemoterapi av glioblastoma hos råttor och för framtida forskning på nya therapeutics för glioblastom. Dessutom är tillämpningen av PET-guidad sub volym öka ett första steg mot att införliva en BTV i strålning behandling planeringen av små djur cancer modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter avslöja
Acknowledgments
Författarna vill tacka Stichting Luka Hemelaere och Soroptimist International för att stödja detta arbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GB RAT model | |||
| F98 Glioblastoma cell line | ATCC | CRL-2397 | |
| Fischer F344/Ico crl Rats | Charles River | N/A | http://www.criver.com/products-services/basic-research/find-a-model/fischer-344-rat |
| Micropump system | World Precision Instruments | UMP3 | Micro 4: https://www.wpiinc.com/products/top-products/make-selection-ump3-ultramicropump/#tabs-1 |
| Stereotactic frame | Kopf | 902 | Model 902 Dual Small Animal Stereotaxic frame |
| diamant drill | Velleman | VTHD02 | https://www.velleman.eu/products/view/?id=370450 |
| Bone wax | Aesculap | 1029754 | https://www.aesculapusa.com/products/wound-closure/hemostatic-bone-wax |
| Insulin syringe Microfine | Beckton-Dickinson | 320924 | 1 mL, 29G |
| InfraPhil IR lamp | Philips | HP3616/01 | |
| Ethilon | Ethicon | 662G/662H | FS-2, 4-0, 3/8, 19 mm |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| DMEM | Invitrogen | 14040-091 | |
| Penicilline-streptomycine | Invitrogen | 15140-148 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-032 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-062 | |
| PBS | Invitrogen | 14040-224 | |
| Falcons | Thermo Scientific | 178883 | 175 cm2 nunclon surface, disposables for cell culture with filter caps |
| Cell freezing medium | Sigma-aldrich | C6164 | Cell Freezing Medium-DMSO, sterile-filtered, suitable for cell culture, endotoxin tested |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal irradiation | |||
| Micro-irradiator | X-strahl | SARRP | |
| software for irradiation | X-strahl | MuriPlan | pre-clinical treatment planning system (PCTPS), version 2.0.5. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small animal PET | |||
| microPET system possibility 1 | Molecubes | B-Cube | http://www.molecubes.com/b-cube/ |
| microPET system possibility 2 | TriFoil Imaging, Northridge CA | FLEX Triumph II | http://www.trifoilimaging.com |
| PET tracers | In-house made | 18F-FDG, 18F-FET, 18F-FAZA, 18F-Choline | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small animal MRI | |||
| microMRI system | Bruker Biospin | Pharmascan 70/16 | https://www.bruker.com/products/mr/preclinical-mri/pharmascan/overview.html |
| Dotarem contrast agent | Guerbet | MRI contrast agent, Dotarem 0,5 mmol/ml | |
| rat whole body transmitter coil | Rapid Biomedical | V-HLS-070 | |
| rat brain surface coil | Rapid Biomedical | P-H02LE-070 | |
| Water-based heating unit | Bruker Biospin | MT0125 | |
| 30 G Needle for IV injection | Beckton-Dickinson | 305128 | 30 G |
| PE 10 tubing (60 cm/injection) | Instech laboratories, Inc | BTPE-10 | BTPE-10, polyethylene tubing 0.011 x .024 in (0.28 x 60 mm), non sterile, 30 m (98 ft) spool, Instech laboratories, Inc Plymouth meeting PA USA- (800) 443-4227- http://www.instechlabs.com |
| non-heparinised micro haematocrit capillaries | GMBH | 7493 21 | these capillaries are filled with water to create markers visible on MRI and CT |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| isoflurane: Isoflo | Zoetis | B506 | Anaesthesia |
| ketamine: Ketamidor | Ecuphar | Anaesthesia | |
| xylazine: Sedaxyl | Codifar NV | Anaesthesia | |
| catheter | Terumo | Versatus-W | 26G |
| Temozolomide | Sigma-aldrich | T2577-100MG | chemotherapy |
| DMSO | Sigma-aldrich | 276855-100ML | |
| Insulin syringe Microfine | Beckton-Dickinson | 320924 | 1 mL, 29G |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Image analysis | |||
| PMOD software | PMOD technologies LLC | PFUS (fusion tool) | biomedical image quantification software (BIQS), version 3.405, https://www.pmod.com/web/?portfolio=22-image-processing-pfus |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia-equipment | |||
| Anesthetic movabe unit | ASA LTD | ASA 0039 | ASA LTD, 5 valley road, Keighley, BD21 4LZ |
| Oxygen generator | Veterinary technics Int. | 7F-3 | BDO-Medipass, Ijmuiden |
References
- Stupp, R., et al. Promising survival for patients with newly diagnosed glioblastoma multiforme treated with concomitant radiation plus temozolomide followed by adjuvant temozolomide. J Clin Oncol. 20 (5), 1375-1382 (2002).
- Dhermain, F. Radiotherapy of high-grade gliomas: current standards and new concepts, innovations in imaging and radiotherapy, and new therapeutic approaches. Chin J Cancer. 33 (1), 16-24 (2014).
- Ahmed, R., et al. Malignant gliomas: current perspectives in diagnosis, treatment, and early response assessment using advanced quantitative imaging methods. Cancer Manag Res. 6, 149-170 (2014).
- Verhaegen, F., Granton, P., Tryggestad, E. Small animal radiotherapy research platforms. Phys Med Biol. 56 (12), R55-R83 (2011).
- Kinsella, T. J., Vielhuber, K. A., Kunugi, K. A., Schupp, J., Davis, T. W., Sands, H. Preclinical toxicity and efficacy study of a 14-day schedule of oral 5-iodo-2-pyrimidinone-2-deoxyribose as a prodrug for 5-iodo-2-deoxyuridine radiosensitization in U251 human glioblastoma xenografts. Clin Cancer Res. 6 (4), 1468-1475 (2000).
- Vellimana, A. K., et al. Combination of paclitaxel thermal gel depot with temozolomide and radiotherapy significantly prolongs survival in an experimental rodent glioma model. J Neurooncol. 111 (3), 229-236 (2012).
- Kioi, M., Vogel, H., Schultz, G., Hoffman, R. M., Harsh, G. R., Brown, J. M. Inhibition of vasculogenesis, but not angiogenesis, prevents the recurrence of glioblastoma after irradiation in mice. J Clin Invest. 120 (3), 694-705 (2010).
- Vinchon-Petit, S., Jarnet, D., Jadaud, E., Feuvret, L., Garcion, E., Menei, P. External irradiation models for intracranial 9L glioma studies. J Exp Clin Cancer Res. 29, 142 (2010).
- Yang, W., et al. Convection enhanced delivery of carboplatin in combination with radiotherapy for treatment of brain tumors. J Neurooncol. 101 (3), 379-390 (2011).
- Rousseau, J., et al. Efficacy of intracerebral delivery of cisplatin in combination with photon irradiation for treatment of brain tumors. J Neurooncol. 98 (3), 287-295 (2010).
- Baumann, B. C., et al. An integrated method for reproducible and accurate image-guided stereotactic cranial irradiation of brain tumors using the small animal radiation research platform. Transl Oncol. 5 (4), 230-237 (2012).
- Grosu, A. -L., et al. Implications of IMT-SPECT for postoperative radiotherapy planning in patients with gliomas. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 54 (3), 842-854 (2002).
- Butterworth, K. T., Prise, K. M., Verhaegen, F. Small animal image-guided radiotherapy: Status, considerations and potential for translational impact. Br J Radiol. 88 (1045), 4-6 (2015).
- Aird, E. G. A., Conway, J. CT simulation for radiotherapy treatment planning. Br J Radiol. 75 (900), 937-949 (2002).
- Baker, G. R. Localization: Conventional and CT simulation. Br J Radiol. 79 (Spec No 1). , S36-S49 (2006).
- Corroyer-Dumont, A., et al. MRI-guided radiotherapy of the SK-N-SH neuroblastoma xenograft model using a small animal radiation research platform. Br J Radiol. 90 (1069), 20160427 (2017).
- Bolcaen, J., et al. MRI-guided 3D conformal arc micro-irradiation of a F98 glioblastoma rat model using the Small Animal Radiation Research Platform (SARRP). J Neurooncol. 120 (2), 257-266 (2014).
- Niyazi, M., et al. FET-PET for malignant glioma treatment planning. Radiother Oncol. 99 (1), 44-48 (2011).
- Grosu, A. L., et al. First experience with I-123-alpha-methyl-tyrosine SPECT in the 3-D radiation treatment planning of brain gliomas. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 47 (2), 517-526 (2000).
- Ling, C. C., et al. Towards multidimensional radiotherapy (MD-CRT):biological imaging and biological conformality. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 47 (3), 551-560 (2000).
- Wahl, R. L., Jacene, H., Kasamon, Y., Lodge, M. A. From RECIST to PERCIST: Evolving Considerations for PET response criteria in solid tumors. J Nucl Med. 50 Suppl 1. (5), 122S-150S (2009).
- Daisne, J. F., et al. Tumor volume in pharyngolaryngeal squamous cell carcinoma: comparison at CT, MR imaging, and FDG PET and validation with surgical specimen. Radiology. 233 (1), 93-100 (2004).
- Grosu, A. -L., Weber, W. PET for radiation treatment planning of brain tumours. Radiother Oncol. 96 (3), Elsevier Ireland Ltd. 325-327 (2010).
- Banissi, C., Ghiringhelli, F., Chen, L., Carpentier, A. F. Treg depletion with a low-dose metronomic temozolomide regimen in a rat glioma model. Cancer Immunol Immunother. 58, 1627-1634 (2009).
- Robinson, C. G., et al. Effect of alternative temozolomide schedules on glioblastoma O(6)-methylguanine-DNA methyltransferase activity and survival. Br J Cancer. 103, 498-504 (2010).
- España, S., Marcinkowski, R., Keereman, V., Vandenberghe, S., Van Holen, R. DigiPET: sub-millimeter spatial resolution small-animal PET imaging using thin monolithic scintillators. Phys Med Biol. 59 (13), 3405 (2014).
