הזרקת וריד הזנב hydrodynamic של וקטורים אינטגרציה מבוססת-transposon מאפשרת יציבה תרביות תאים של hepatocytes מאתר ויוו. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מעשית למערכות תרביות תאים המאפשרת ביטוי מכוננת ארוכת טווח של transgene יחיד או ביטוי מכוננת ו דוקסיציקלין-inducible משולב של transgene או של מיר-shRNA בכבד.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מערכות מכוננת Inducible עבור שינוי גנטי In Vivo של העכבר Hepatocytes באמצעות הזרקת וריד הזנב Hydrodynamic
במאמר זה
סיכום
תקציר
במודלים המחקר של סרטן הכבד, התחדשות, דלקת, פיברוזיס, מערכות גמיש ויוו ביטוי גנים והשתקה שימושיות מאוד. הזרקת וריד הזנב hydrodynamic של המבנים מבוססי transposon היא שיטה יעילה עבור הנדסה גנטית של hepatocytes בעכברים בוגרים. בנוסף לביטוי transgene המכונן, מערכת זו יכול לשמש ליישומים מתקדמים יותר, כגון בתיווך shRNA גן במשתמע דפיקה למטה, את מערכת CRISPR/Cas9 כדי ליצור מוטציות או מערכות inducible. כאן, השילוב של הביטוי CreER מכוננת יחד עם ביטוי inducible של transgene או מיר-shRNA להתמקד מוצג בתור דוגמה של טכניקה זו. אנו מכסים את ההליך רב שלבי החל משלב הכנת היפהפיה הנרדמת-transposon בונה, הזרקה, וטיפול של עכברים, הכנת רקמת הכבד לניתוח על ידי immunostaining. מערכת הציג היא גישה אמין ויעיל להשגת שינויים גנטיים מורכבים ב hepatocytes. היא שימושית במיוחד בשילוב עם זנים העכבר מבוססות-Cre/loxP, ניתן להחיל על מגוון דגמים בחקר מחלת כבד.
מבוא
מחלת כבד כרונית מציג ברחבי העולם נטל1הבריאותיות העיקריים. מחקר בבעלי חיים מודלים כלים מהותיים בחקר מחלת כבד, סייעו לענות על שאלות מורכבות התחדשות כבד, דלקת הכבד, ו steatosis, כמו גם סרטן הכבד2. מספר ניכר של מודלים בבעלי חיים אלה מסתמכים על השינוי הגנטי של תאי כבד. לכן, כלים יעילים לתמרן ביטוי גנים ב hepatocytes הן מועילות3. הוקמה שיטות כגון הרבייה של זנים מהונדסים גנטית עכבר או הדור של וקטורים ויראלי לדלקת hepatocyte נמצאים גם הנמל זמן רב, חששות בטיחות, או תשואה transgene המסכן ביטוי hepatocytes ויוו 4 , 5. הזרקת וריד הזנב hydrody....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים בוצעו על פי ההנחיות עבור טיפול והשתמש של חיות מעבדה ואושרו על-ידי הרשויות אחראי (Regierung פון Oberbayern, מינכן, גרמניה, סטנפורד מוסדיים חיה טיפול, שימוש הוועדה, בסטנפורד, קליפורניה, ארה ב). רשימה של כל פלסמידים לקראת שיבוט (שלב 1 עד 4) מסופק בטבלה משלים S1.
1. שכפול של Transgene עבור ביטוי גנים המכונן
- עיצוב תחל transgene הגברה13,14.
- הוסף אתרים הגבלה עבור פאצי (TTAATTAA) 5' בסוף פריימר לפנים. להוסיף באתרים מגבלת AscI (GGCGCGCC) או FseI (GGCCGGCC) 5' סוף ומהצמיגים הפוכה.
- להגביר את transgene על ידי ה-PCR באמצעות תנאים אופטימיזציה עבור הרצוי t....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
תקנים היעילות באמצעות הזרקת וריד הזנב hydrodynamic: האחוז של hepatocytes מאתר זה הם transfected hydrodynamically על ידי זריקה אחת הוא משתנה ותלוי במספר פרמטרים כגון נפח הזרקה, הזרקת זמן, כמות ה-DNA מוזרק וגודל של הבונה מוזרק6, 22,23. בנוסף, היעילות תקנים היא בדרך כלל נמוכה יותר אצל בעלי חיים גדולים יותר, איפה קוטר כלי דם גדולים יותר, כמו גם שטח גדול יותר sinusoidal מוביל להפחתה .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
תרביות תאים של hepatocytes עם הזרקת וריד הזנב hydrodynamic הפכה שיטה הוקמה מאז השקתו לפני יותר מ- 15 שנה6. אמצעי האחסון מוזרק חורג תפוקת הלב, זורם מן הכלילי התחתון לתוך sinusoids של הכבד7, שמוביל תקנים של בערך 10-20%, במקרים מסוימים עד 40% של hepatocytes25,26. גורמים מנבאים של תרביות תאים מוצלחת הם אמצעי האחסון מוזרק לכל זמן מוזרק22,23. ומכאן, יעילות נמוכה ת.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי דויטשה Krebshilfe, גרמניה (מספר גרנט 111289 כדי UE), הקרן ולוסיל פקארד הבריאות של הילדים (ארנסט, אמיליה גאלו ניחן הבתר - CTSA מספר גרנט UL1 RR025744 מורה). אנו מודים ד ר מארק א קיי על וקטור בונה ותמיכה עצה ניסיוני ומרווה ג'וליאן ד ר עבור עכברים ו ניסיוני.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>חומר כללי | |||
| GeneRuler 1 kb פלוס סולם DNA | תרמו פישר | #SM1331 | סולם DNA לאלקטרופורזה |
| רקמה-טק O.C.T. | סאקורה | 4583 | הטמעה של חתכי קריו |
| Biozym LE Agarose | Biozym | 840004 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E7637-1G | |
| D(+)-Saccharose | Carl Roth | 4621.1 | להמתקת תמיסת הדוקסיצילין |
| Ampicillin נתרן מלח | AppliChem | A0839,0010 | לבחירת שיבוטים |
| LB אגר (לוריא/מילר) | קארל רות' | X969.1 | |
| LB מרק (לוריא/מילר) | קארל רוט | X968.1 | |
| S.O.C. | תרמו פישר | 15544034 | |
| ג'נטמיצין סולפט | AppliChem | A1492,0001 | לבחירת שיבוטים עמידים לגנטמיצין |
| Roti-Histofix 4 | Fa. Roth | P087.6 | תמיסת פרה-פורמלדהיד |
| T4 DNA Ligase | ניו אינגלנד BioLabs | M0202S | |
| GatewayTM LR ClonaseTM II תערובת אנזימים | invitrogen/ThermoFisher | 11791-020 | מכיל תערובת אנזים LR-קלונאז II ופרוטאינאז K |
| DB3.1 תאים מוכשרים | תרמו פישר | 11782-018 | |
| Stbl3 מוכשר כימית E. coli | Thermo Fisher | C737303 | |
| <חזק>שם | Company | Catalog Number | >Comments |
| Restriction Enzymes | |||
| PacI | New England BioLabs | R0547S | |
| AscI | New England BioLabs | R0558S | |
| FseI | New England BioLabs | R0588S | |
| SacI | ניו אינגלנד BioLabs | R0156S | |
| SpeI | ניו אינגלנד BioLabs | R0133S | |
| KpnI | ניו אינגלנד BioLabs | R0142S | |
| NotI | ניו אינגלנד BioLabs | R0189S | |
| XhoI | ניו אינגלנד BioLabs | R0146S | |
| BfuAI | ניו אינגלנד BioLabs | R0701S | |
| שם | חברה | מספר קטלוגי | >Comments |
| ערכות | |||
| QIAערכת מיצוי ג'ל מהירה | Qiagen | 28704 | למיצוי DNA מג'ל |
| NucleoSpin ג'ל ו-PCR ניקוי | Macherey & Nagel | 740609.10 | |
| NucleoBond PC20 | Macherey & Nagel | 740571 | מיצוי פלסמיד (מיני הכנה) |
| NucleoBond PC500 | Macherey & Nagel | 740574 | מיצוי פלסמיד (הכנת מקסי) |
| Phusion נאמנות גבוהה DNA פולימראז | תרמו פישר | F530S | |
| <חזק>שם | <חזק>חברה | <חזק>מספר קטלוגי | <חזק>הערות |
| ><חזק>חומרים לניסויי עכבר | |||
| מזרק Injekt F 1 מ"ל | בראון | 9166017V | להזרקה תוך צפקית |
| אומניפיקס לואר 3 מ"ל | בראון | 4616025V | להזרקה תוך ורידית |
| צינורית סטריקנית 24G | בראון | 4657675 | |
| צינורית סטריקנית 27G | בראון | 4657705 | |
| טמוקסיפן | סיגמא-אולדריץ' | T5648-1G | להפעלת CreER |
| שמן תירס | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | מנשא לזריקות טמוקסיפן |
| דוקסיציקלין היקלאט | AppliChem | A2951,0025 | הפעלת ביטוי תלוי טטרציקלין |
| Injekt 10 מ"ל מזרק | בראון | 4606108V | |
| Filtropur S 0.2 | Sarstedt | 831,826,001 | לסינון דוקסיציקלין |
| NaCl 0,9% | בראון | מנשא 3200905 להזרקות תוך ורידיות | |
| שפופרת חרוטית פלקון 50 מ"ל | קורנינג מדעי החיים | 352095 | |
| מנורת אינפרא אדום | N/A | N/A | לחימום זנב העכבר |
| IVIS | Perkin Elmer | 124262 | מערכת הדמיה In vivo |
| Company | Catalog Number | Comments | |
| >Plasmids לשיבוט וקטורי טרנספוזון של היפהפייה הנרדמת עבור HTVI. | |||
| pTC | n/a | וקטור לביטוי גנים מכוננים, ref. 15 | |
| pEN_TTmcs | Addgene #25755 | וקטור כניסה לביטוי גנים הניתן להשראה, ref. 19 | |
| pEN_TTGmiRc2 | Addgene #25753 | וקטור כניסה לביטוי miR-shRNA הניתן להשראה עם ביטוי משותף של GFP, ref. 19 | |
| pEN_TTmiRc2 | Addgene #25752 | וקטור כניסה לביטוי miR-shRNA הניתן להשראה ללא ביטוי משותף של GFP, ref. 19 | |
| pTC ApoE-Tet | Addgene #85578 | וקטור ביטוי לביטוי גן הניתן להשראה או miR-shRNA עם מקדם ApoE.HCR.hAAT, ref. 11 | |
| pTC-CMV-Tet | Addgene #85577 | וקטור ביטוי לביטוי גן הניתן להשראה או miR-shRNA עם מקדם CMV, הפניה 11 |
מקורות
- Byass, P. The global burden of liver disease: a challenge for methods and for public health. BMC Med. 12, 159(2014).
- Liu, Y., et al. Animal models of chronic liver diseases. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304 (5), G449-G468 ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
