Summary
द्रव-खिला कीड़ों छिद्रित सतहों से तरल पदार्थ के मिनट मात्रा प्राप्त करने की क्षमता है । इस प्रोटोकॉल एक विधि का वर्णन करने के लिए सीधे कीड़ों के लिए क्षमता का निर्धारण करने के लिए छिद्र से तरल पदार्थ निगलना फ्लोरोसेंट, चुंबकीय नैनोकणों के साथ समाधान खिला का उपयोग सतहों ।
Abstract
द्रव खिला कीड़ों तरल पदार्थ है, जो पूल, फिल्मों, या छोटे pores के लिए सीमित के रूप में पर्यावरण में मौजूद है की एक किस्म निगलना । तरल अधिग्रहण के अध्ययन mouthpart संरचना और समारोह संबंधों का आकलन करने की आवश्यकता; हालांकि, द्रव के ऊपर तंत्र संरचनात्मक वास्तुकला की टिप्पणियों से ऐतिहासिक रूप से आस्थगित कर रहे हैं, प्रयोगात्मक सबूतों के साथ कभी नहीं हमराह । यहां, हम तरल पदार्थ की छोटी मात्रा का उपयोग कर तितलियों (Lepidoptera) और मक्खियों (Diptera) के साथ द्रव की क्षमता का आकलन करने के लिए एक उपंयास विधि की रिपोर्ट । कीड़े एक 20% के साथ खिलाया सुक्रोज समाधान फ्लोरोसेंट के साथ मिश्रित कर रहे हैं, विशिष्ट ताकना आकार के फिल्टर कागज से चुंबकीय नैनोकणों । फसल (आंतरिक संरचना तरल पदार्थ के भंडारण के लिए इस्तेमाल किया) कीट से हटा दिया और एक फोकल माइक्रोस्कोप पर रखा जाता है । एक चुंबक फसल द्वारा लहराया है नैनोकणों की उपस्थिति है, जो संकेत अगर कीड़ों तरल पदार्थ निगलने में सक्षम है निर्धारित करने के लिए । इस पद्धति के लिए एक व्यापक खिला तंत्र (केशिका कार्रवाई और तरल पुल गठन) है कि संभावित Lepidoptera और Diptera के बीच साझा जब छिद्रित सतहों से खिला है प्रकट किया जाता है । इसके अलावा, इस विधि द्रव-खिला कीड़ों की एक किस्म के बीच भोजन तंत्र के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, रोग संचरण और biomimetics में महत्वपूर्ण उन सहित, और संभावित अंय अध्ययनों कि नैनो या सूक्ष्म आकार नाली शामिल है जहां तरल परिवहन सत्यापन की आवश्यकता है ।
Introduction
कई कीट समूहों मुँह (सूंड) तरल पदार्थ पर खिलाने के लिए अनुकूलित किया है, ऐसे अमृत के रूप में, फल सड़, एसएपी प्रवाह (जैसे Diptera1, Lepidoptera2, Hymenoptera3), जाइलम (Hemiptera4), आंसू (Lepidoptera ५), व रक्त (Phthiraptera६, Siphonaptera७, Diptera७, Hemiptera८, Lepidoptera९). कीड़ों की क्षमता तरल पदार्थ पर फ़ीड करने के लिए पारिस्थितिकी तंत्र स्वास्थ्य (जैसे परागण10), रोग संचरण4,11,2,12, और अध्ययन के लिए प्रासंगिक है च्या अभिसरण विकास१३. खाद्य स्रोतों की व्यापक विविधता के बावजूद, कुछ तरल पदार्थ खिला कीड़ों के बीच एक विषय तरल पदार्थ है, जो सूक्ष्म या नैनो आकार की बूंदों, तरल फिल्मों, या छिद्रित सतहों को सीमित किया जा सकता है की छोटी मात्रा में प्राप्त करने की क्षमता है ।
द्रव-खिला कीड़ों की व्यापक विविधता को देखते हुए (सभी पशु प्रजातियों में से अधिक 20%14,15) और उनके भोजन के स्रोतों की एक किस्म पर फ़ीड करने की क्षमता, उनके खिला व्यवहार और द्रव को समझने-के लिए तंत्र है कई क्षेत्रों में महत्वपूर्ण है । कीट mouthpart कार्यशीलता, उदाहरण के लिए, biomimetic प्रौद्योगिकी के विकास में एक भूमिका निभाई है, उदा, microfluidic उपकरणों है कि ऐसे तरल पदार्थ की छोटी मात्रा के अधिग्रहण के रूप में कार्य कर सकते है उन लोगों के समान तरीकों का उपयोग कर कार्यरत द्वारा कीड़े16। तरल पदार्थ के ऊपर तंत्र के अध्ययन में एक बुनियादी समस्या है, तथापि, न केवल कैसे कीड़ों तरल पदार्थ पर फ़ीड का निर्धारण है, लेकिन प्रयोगात्मक सबूत है कि तंत्र का समर्थन प्राप्त । पूरी तरह से व्यवहार का उपयोग (जैसे, सूंड12,17के साथ जांच) के रूप में खिलाने के लिए एक संकेतक अपर्याप्त है क्योंकि यह तरल पदार्थ के सफल लेने की पुष्टि नहीं करता है, और न ही यह एक के लिए मार्ग निर्धारित करने का साधन प्रदान करता है कि तरल यात्रा के रूप में वे कीट से गुजारें । इसके अलावा, तरल पदार्थ की छोटी मात्रा के साथ प्रयोग प्रदर्शन बेहतर प्राकृतिक खिला परिदृश्यों का प्रतिनिधित्व करता है, जहां तरल पदार्थ एक सीमित संसाधन2,12हैं ।
X-रे चरण कंट्रास्ट इमेजिंग नरेश तितली (Danaus plexippus L) के साथ प्रयोग किया गया था कैसे तितलियों छिद्रित सतहों से तरल पदार्थ की छोटी मात्रा में12पर फ़ीड । संराट तितलियों सूंड के साथ cuticular अनुमानों (पृष्ठीय legulae) के बीच रिक्त स्थान के माध्यम से केशिका कार्रवाई का उपयोग करने के लिए तरल पदार्थ लाने के लिए भोजन नहर में छोटे pores । आने वाले तरल पदार्थ खाना नहर की दीवार पर एक फिल्म के रूप है कि बढ़ता है और पठार अस्थिरता12,18है, जो तो सिर में चूसने पंप की कार्रवाई के द्वारा तितली के पेट के लिए ले जाया जाता है द्वारा एक तरल पुल में गिर जाता है । हालांकि एक्स-रे चरण कंट्रास्ट इमेजिंग कीड़े के अंदर द्रव प्रवाह visualizing के लिए एक इष्टतम उपकरण है12,19,20,21, तकनीक आसानी से उपलब्ध नहीं है और एक अधिक सुविधाजनक विधि तरल पदार्थ को तेज करने और उन्हें निगलने के लिए एक कीट की क्षमता के तेजी से आकलन के लिए आवश्यक है ।
यह निर्धारित करने के लिए कि D. plexippus के लिए खिला तंत्र अन्य Lepidoptera पर लागू होता है और यह भी मक्खियों (Diptera) (दोनों समूहों को छिद्रित सतहों से तरल पदार्थ पर फ़ीड), Lehnert एट अल. 13 एक कीट की क्षमता को छिद्रित सतहों से तरल पदार्थ की छोटी मात्रा पर फ़ीड करने के लिए एक तकनीक लागू किया है, जो यहां विस्तार से बताया गया है । हालांकि यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल अध्ययन के लिए है कि उपयोग गीला और असुरक्षित सतहों, कार्यप्रणाली अंय अध्ययनों के लिए बदला जा सकता है, इस तरह के पूल खिला तंत्र को संबोधित उन के रूप में । इसके अलावा, अनुप्रयोगों microfluidics और प्रेरित प्रौद्योगिकी सहित अन्य क्षेत्रों के लिए विस्तार ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. कीट प्रजातियों, समाधान और खिला स्टेशन सेटअप की तैयारी
नोट: गोभी तितलियों (Pieris rapae एल, Pieridae) प्रतिनिधि Lepidoptera की प्रजातियों के रूप में चुना जाता है क्योंकि वे द्रव के पिछले अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया है-ले क्षमताओं और mouthpart आकृति विज्ञान22,23। घर मक्खियों (Musca domestica एल, Muscidae) और नीले रंग की बोतल मक्खियों (Calliphora vomitoria एल, Calliphoridae) का उपयोग किया जाता है क्योंकि वे अक्सर छिद्रित सतहों13पर खिला मनाया जाता है ।
- आदेश पी rapae एक कीट आपूर्तिकर्ता से लार्वा के रूप में और उंहें कृत्रिम आहार पर रियर ( सामग्री की तालिकादेखें) जब तक वे कोषस्थ और 23 डिग्री सेल्सियस और एक 18L: 6D photoperiod के लिए सेट एक पर्यावरण चैंबर में वयस्कों के रूप में उभरने । आदेश एम. domestica और सी. vomitoria के रूप में कोषस्थों और उंहें पी. rapaeके रूप में एक ही पर्यावरणीय परिस्थितियों में पीछे । वे खिला प्रयोगों से पहले कोषस्थों से उभरने के बाद वयस्क तितलियों और मक्खियों फ़ीड मत करो ।
- एक 20% सुक्रोज समाधान (नियंत्रण) और एक 20% सुक्रोज nanoparticle समाधान द्रव के लिए परीक्षण करने के लिए तैयार है । फ्लोरोसेंट चुंबकीय नैनोकणों (एक polyacrylic एसिड कोटिंग के साथ आयरन ऑक्साइड, व्यास में लगभग 20 एनएम) को जोड़कर nanoparticle समाधान तैयार करने के लिए24 एक 20% सुक्रोज समाधान (1 मिलीग्राम/एमएल डीएच2ओ नैनोकणों के साथ 20% सुक्रोज समाधान, 1:1) । फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) (10x पतला डीएच2O, pH ७.४), जो विच्छेदन के लिए उपयोग किया जाता है में 1x का एक समाधान तैयार करें ।
- एक खिला स्टेशन है कि एक दबाना और एक अलग खिला मंच (एक फ्लैट मंच) (चित्रा 1) के साथ एक मैनुअल जोड़तोड़ के होते है सेट करें । खिला मंच पर एक गुफा स्लाइड प्लेस और 11, 20, 30, ४१, या ६० µm के आकार के व्यास के साथ नायलॉन शुद्ध फिल्टर है और 1, 5, 8, या 10 µm की खिला प्रयोगों के लिए पास के आकार के व्यास के साथ झिल्ली फिल्टर ।
2. खिला प्रोटोकॉल
- एक जोड़ ऊतक कागज में कीट के शरीर, पैर, और पंख लपेटें । कीट की स्थिति इतनी है कि केवल सिर और मुँह सामने आ रहे हैं । दो माइक्रोस्कोप स्लाइड, जो एक साथ जोड़ तोड़ पर दबाना द्वारा आयोजित कर रहे हैं के बीच कीट के पंख जगह है कि कीट खिला चरण (चित्रा 1) के ऊपर निलंबित कर दिया है ।
- प्रशासन के एक 30 µ एल छोटी बूंद या तो 20% सुक्रोज समाधान या 20% सुक्रोज nanoparticle समाधान एक micropipette के साथ एक गुफा स्लाइड के केंद्र के लिए । तो यह है कि फिल्टर कागज के केंद्र nanoparticle समाधान की छोटी बूंद के साथ गठबंधन है एक विशिष्ट ताकना आकार की गुफा स्लाइड पर एक एकल फिल्टर कागज प्लेस । छोटी बूंद और फिल्टर कागज के साथ प्रसार समाधान में फिल्टर कागज परिणाम के बीच संपर्क, भरने pores (चित्रा 1) ।
नोट: फिल्टर कागज के बजाय अन्य तरह के आसपास, छोटी बूंद के ऊपर रखा गया है, फिल्टर कागज के शीर्ष पर नैनोकणों की संभावित उपस्थिति को कम करने के लिए जहां कीड़े फ़ीड. - हेर-फेर के साथ कीट की स्थिति तो यह है कि केवल मुँह के बाहर क्षेत्रों खिला मंच पर गीला फ़िल्टर कागज से संपर्क कर सकते हैं (चित्रा 1). फिल्टर कागज पर मुँह का विस्तार करने के लिए एक कीट पिन का प्रयोग करें और कीट ४५ एस के लिए फ़ीड करने के लिए अनुमति देते हैं ।
- तरल फिल्मों है कि फिल्टर कागज की सतह पर मौजूद हो सकता है पर खिला कीड़ों की संभावना को कम करने के लिए, मुँह स्थिति इतनी है कि वे फिल्टर कागज है कि स्लाइड के फ्लैट हिस्सा छू रहा है के एक भाग के साथ संपर्क में है (ie , सीधे नहीं स्लाइड के गुफा भाग के ऊपर) । यदि कीट खिलाने में रुचि व्यक्त नहीं करता है, तो मुँह को खिलाने के समय की अवधि के लिए कीट पिन के साथ फिल्टर पेपर पर रखा जा सकता है ।
3. विच्छेदन
- एक ५० mm घड़ी ग्लास में पंजाबियों समाधान प्लेस ताकि कीट के शरीर को कवर करने के लिए पर्याप्त समाधान है । एक stereoscope और स्थिति कीट विदारक उपकरण (वसंत सूक्ष्म विदारक कैंची, कीट पिन, ठीक बिंदु विदारक संदंश) के तहत घड़ी शीशे को stereoscope के बगल में रखें । ।
- खिलाने के बाद टिशू पेपर से कीट को निकालकर उसे पंखों से बंद करके पकड़ लें । वसंत सूक्ष्म विदारक कैंची से कीट के सिर, पैर, और पंख निकालें और पंजाब के समाधान में कीट को देखो ग्लास (चित्रा 2) में रखें ।.
- जरूरत पड़ी तो विच्छेदों से पहले कीड़े anesthetize । पेट के बाहर क्षेत्र के निकट छल्ली द्वारा कीट धारण करने के लिए संदंश का प्रयोग करें । प्रमुख हाथ के साथ, वसंत सूक्ष्म विदारक कैंची का उपयोग करने के लिए पेट के पार्श्व पक्ष के साथ एक पूर्वकाल दिशा में छल्ली कटौती, पीछे अंत में शुरू, जब तक छाती तक पहुंच गया है । यह सुनिश्चित करने के लिए विशेष ध्यान रखें कि केवल छल्ली ही कट जाए और वह कीट के अंदर पाचन नहर क्षतिग्रस्त न हो (चित्र 2) ।
- छल्ली के अतिरिक्त कटौती करने के लिए पेट को खोलने के लिए पाचन नहर के अंदर (चित्रा 2) प्रकट करने के लिए उदर खोल । उदर छल्ली, वसा शरीर, और कीट पिन की सहायता से अन्य संरचनाओं निकालें और बाद में निपटान के लिए घड़ी कांच के बाहर उन्हें स्थानांतरित, घड़ी कांच में केवल छाती और पाचन नहर छोड़ने.
नोट: विच्छेदन फसल है, जो एक थैली की तरह संरचना (पाचन नहर का एक विस्तार) छाती और पेट के मोड़ के पास स्थित खुलासा होगा । - यदि फसल सामने न आ जाए तो फसल का पता चलने तक कैंची से छाती में अतिरिक्त चीरा लगाएं । एक बार फसल दिखाई देने पर, केवल वॉच ग्लास (चित्रा 2) में फसल के साथ ही पाचन नहर छोड़कर कीट के शेष भागों को काट लें ।
नोट: lepidopteran फसल लगभग पारदर्शी और प्रकृति में सिलोफ़न की तरह है, जो अगर यह तरल पदार्थ और विस्तार से नहीं भरा है या अगर यह विच्छेदन के दौरान कटौती की पहचान करने के लिए मुश्किल हो सकता है । - एक coverslip (24 मिमी x 24 मिमी) बाद में इमेजिंग (चित्रा 2) के लिए पर फसल जगह के लिए ठीक बिंदु विदारक संदंश का प्रयोग करें ।
4. घूस नैनोकणों का निर्धारण
- फसल rupturing को रोकने के लिए देखभाल का उपयोग करते हुए ठीक बिंदु विदारक संदंश के साथ coverslip पर फसल की स्थिति । 20X आवर्धन पर इमेजिंग के लिए एक औंधा फोकल माइक्रोस्कोप पर CY3 चैनल (या चरण कंट्रास्ट) का उपयोग करें । छवि विच्छेदन के बाद तुरंत इसे बाहर सुखाने से रोकने के लिए ।
- एक चुंबकीय हलचल बार पकड़ो (लंबाई में ४१.३ मिमी और व्यास में 8 मिमी) है कि माइक्रोस्कोप के ऑपरेटिंग चरण के नियंत्रण में नहीं है ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
द्रव में पैटर्न के अध्ययन-तरल पदार्थ खिला कीड़ों के बीच क्षमताओं को खिलाने के लिए जब होता है के निर्धारण की आवश्यकता है । यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल Lepidoptera और Diptera13के बीच सीमित ताकना आकार परिकल्पना परीक्षण करने के लिए प्रयोग किया जाता है । सीमित ताकना आकार परिकल्पना राज्यों है कि तरल पदार्थ खिला कीड़ों तरल से भर फ़ीड नहीं कर सकते है pores अगर ताकना आकार व्यास खिला नाली12के व्यास से छोटी है । छिद्रित सतह से आने वाले तरल पदार्थ एक स्थिर तरल पुल के रूप में होना चाहिए, पठार18अस्थिरता के माध्यम से, केशिका में तरल पदार्थ रखने के दबाव पर काबू पाने के लिए और चूसने पंप पर कार्य करने के लिए एक तरल सतह प्रदान करने के लिए । विभिन्न आकारों (चित्रा 3) की खिला नाली के साथ कीड़े वे फ़ीड कर सकते हैं, जिसमें से छोटी ताकना आकार में अलग करने के लिए भविष्यवाणी कर रहे हैं ।
प्रत्येक प्रजातियों के लिए सीमित ताकना आकार का परीक्षण किया व्यक्तियों के ५०% के लिए क्षमता के आधार पर गणना के लिए फिल्टर पेपर13के एक विशिष्ट ताकना आकार पर फ़ीड है । 20% सुक्रोज समाधान (नियंत्रण) से परेशान कीटों ने उनकी फसलों में नैनोकणों नहीं की । कीड़े के बाद अगर नैनोकणों घूस लिया गया आकलन करने के लिए कीट थे, उनके मुँह बाहर और समीपस्थ क्षेत्रों में नाली को मापने के लिए एक फोकल माइक्रोस्कोप के साथ imaged थे (चित्रा 3) । बाहर और समीपस्थ माप क्योंकि यह महत्वपूर्ण स्थान के एक संकेतक के रूप में सेवा कर सकते हैं, जहां तरल पदार्थ मुँह, यानी, mouthpart नाली आकार और सीमित ताकना आकार के बीच एक करीबी रिश्ते को अप्रत्यक्ष प्रदान कर सकता है किया गया mouthpart संरचनाओं के लिए सबूत है कि केशिका कार्रवाई की सुविधा । पी rapae की सूंड के लिए खाद्य नहर के व्यास टिप क्षेत्र (बाहर का माप) और सूंड लंबाई (समीपस्थ क्षेत्र) के 30% से कम के पास मापा गया । पांच pseudotracheae का मतलब व्यास बाहर का माप के रूप में इस्तेमाल किया गया था और मौखिक खोलने के व्यास प्रत्येक मक्खी नमूना के लिए समीपस्थ माप के रूप में मापा गया था.
इस प्रोटोकॉल बाहर mouthpart नाली आकार और छोटी ताकना आकार जिसमें से कीड़ों (चित्रा 4) फ़ीड कर सकते है के बीच एक करीबी रिश्ता पता चला है । सबूत dipteran प्रजातियों के लिए द्रव में सबसे पहले pseudotracheae (बाहर mouthpart माप) के बजाय मौखिक खोलने (समीपस्थ mouthpart माप) जब छिद्रित सतहों से खिला (चित्रा 4) में होता है कि संकेत दिया । दिलचस्प है, pseudotracheae के संरचनात्मक वास्तुकला lepidopteran मुँह के समान है और cuticular संरचनाओं कि केशिका कार्रवाई, अभिसरण विकास का एक उदाहरण के माध्यम से तरल पदार्थ को बढ़ावा देने सकता है के होते है13। सीमित ताकना आकार और mouthpart नाली आकार के बीच घनिष्ठ संबंध सबूत है कि Lepidoptera और Diptera के बीच तरल पदार्थ के लिए एक महत्वपूर्ण घटक के रूप में केशिका कार्रवाई का समर्थन करता है उपलब्ध कराता है ।
चित्रा 1: प्रायोगिक सेटअप और खिला स्टेशन । (क) सेटअप एक ऊतक कागज (टी. पी.) में कीट लपेटन के होते है और दो स्लाइड (sl), जो एक साथ एक क्लैंप (सी) से जुड़ी द्वारा आयोजित कर रहे है के बीच कीट के पंख रखने समायोज्य knobs (ए) के साथ (एमए) । कीट की सूंड (पीआर) एक खिला मंच (st) है, जो एक छोटी बूंद (पी) है कि nanoparticle समाधान है कि एक गुफा स्लाइड (सीएस) के लिए प्रशासित किया जाता है पर रखा गया है एक फिल्टर कागज (fp) को कम है । (ख) गुफा स्लाइड पर छोटी बूंद और फिल्टर कागज के स्थान दिखा योजनाबद्ध । (ग) nanoparticle समाधान की छोटी बूंद (तीर) के माध्यम से फिल्टर कागज केशिका कार्रवाई के माध्यम से एक असुरक्षित खिला सतह बनाने के लिए फैलता है । (घ) isopore फ़िल्टर दिखाने के पृष्ठीय दृश्य के फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप छवि (पीओ) (20X आवर्धन, CY3 चैनल) nanoparticle समाधान के साथ (10 µm) pores । सतह पर कोई लिक्विड फिल्म नहीं देखी गई । (E) फोकल माइक्रोस्कोप z-स्टैक छवि isopore फ़िल्टर (10 µm) के pores में nanoparticle समाधान (एन एस) दिखा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2: विच्छेदन और nanoparticle का पता लगाना. (क) संदंश (फो) कीट (एम. domestica यहाँ दिखाए गए, fl) को सुरक्षित करने के लिए उपयोग किया जाता है. (ख) कीट के पंख, सिर, और पैर हट जाते हैं । (C) कैंची (sc) पेट के पार्श्व पक्ष को खोलने के लिए कटौती करने के लिए उपयोग किया जाता है । (घ) प्रजनन संरचनाओं (अंडे, जैसे) और पाचन नहर के अनआवश्यक भागों को अतिरिक्त संदंश के साथ हटा दिया जाता है. (E) फसल (cr) को अलग करने के लिए अतिरिक्त संरचनाएं निकाल दी जाती हैं । (च) नैनोकणों की उपस्थिति का पता लगाने के लिए पृथक फसल तैयार. (G) फसल को एक कवर स्लिप (सीएस) पर रखा जाता है और एक औंधा फोकल माइक्रोस्कोप में ले जाया जाता है । एक चुंबकीय हलचल बार (ma) फसल के पास लहराया है nanoparticle आंदोलन का कारण है । (ज) Nanoparticle आंदोलन (लाल घेरे में उल्लिखित) सी. vomitoria की फसल में चरण कन्ट्रास्ट माइक्रोस्कोपी के साथ. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 3: Lepidoperan और dipteran mouthpart संरचनाएं. (एक) लेजर पृथक टोमोग्राफी lepidopteran सूंड (पीआर), जो दो लंबी दाढ़ की हड्डी galeae है कि संरचनाओं (legulae) कि एक खाद्य नहर (एफसी) के लिए तरल पदार्थ बनाने के लिए जोड़ने के द्वारा एक साथ आने से बना है दिखा छवि । इनसेट (फोकल माइक्रोस्कोप छवि) पृष्ठीय legulae सूंड के बाहर क्षेत्र के पास (डीएल) दिखाता है । पृष्ठीय legulae के बीच रिक्त स्थान खाद्य नहर में तरल पदार्थ लाने के लिए केशिका क्रिया प्रदान करते हैं । (B) प्रत्येक C-आकार galea में एक श्वासनली (tr), तंत्रिका, और आंतरिक पेशियां (im) है । (ग) Dipteran मुँह एक चबूतरा (आरओ), haustellum, और एक बाहर का labellum (पौंड) है कि छोटे नाली, pseudotracheae (पीटी) (इनसेट में फोकल छवि में दिखाया गया है), जो एक केंद्रीय मौखिक खोलने (सेशन) से विकीर्ण से मिलकर बनता है ।लेजर पृथक टोमोग्राफी छवि भी यौगिक नेत्र (ce) और दाढ़ की हड्डी palpi (सांसद) से पता चलता है । (घ) भोजन नहर, जो मौखिक खोलने से जोड़ता है आंशिक रूप से labrum (la) और labium (lm) से बना है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 4: कीट मुँह और ताकना आकार जिसमें से वे फ़ीड कर सकते हैं के बीच संबंध. सीमित ताकना आकार व्यास से संबंधित है (मतलब ± SEM) बाहर mouthpart नाली के बजाय समीपस्थ खाद्य नहरों । Musca domestica नीचे दिखाया गया है ग. vomitoria. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
कीट mouthpart कार्यक्षमता ऐतिहासिक रूप से सकल आकृति विज्ञान के अध्ययन से आस्थगित है (उदा, lepidopteran सूंड एक पीने के भूसे से संबंधित कार्यशीलता25,26); हालांकि, हाल के अध्ययनों कि प्रयोगात्मक सबूत शामिल कीट मुँह और संरचना की जटिलताओं की हमारी समझ में एक बदलाव के परिणामस्वरूप है-समारोह रिश्ते2,12,13 , 22 , 27. यद्यपि आधुनिक इमेजिंग तकनीक, जैसे कि स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी23, फोकल माइक्रोस्कोपी22, माइक्रो गणना टोमोग्राफी (माइक्रो-सीटी)28, और लेजर पृथक टोमोग्राफी (चित्रा 3), प्रदान आकृति विज्ञान के विस्तृत अध्ययन के लिए अवसर, कार्यक्षमता के लिए साक्ष्य प्रयोग के साथ साथ किया जाना चाहिए ।
विधि यहां वर्णित पता चलता है कि केशिका एक आवश्यक कीड़ों द्वारा नियोजित तंत्र जब गीला छिद्रित सतहों से खिला हो सकता है । खिला व्यवहार का प्रयोग (उदा,12,17की जांच) अकेले इस खिला तंत्र नहीं पता चला है, के रूप में कुछ व्यक्तियों है कि उनके मुँह के साथ सतहों की जांच करने में असमर्थ थे फ़ीड, विशेष रूप से उन प्रदान mouthpart नाली के व्यास से छोटे ताकना आकार व्यास के साथ फिल्टर कागजात । इसके अलावा, फसल के निरीक्षण के लिए निर्धारित अगर यह तरल पदार्थ भरा भी अपर्याप्त होगा, इन प्रयोगों में घूस लिया तरल पदार्थ की मात्रा के रूप में दृश्य आकलन के लिए बहुत छोटे थे, यानी, कुछ कीड़ों की फसलें फुलाया दिखाई दिया, लेकिन नैनोकणों अभी भी मौजूद थे संकेत है कि तरल पदार्थ घूस दिया गया ।
छोटे कीड़ों को संभालने की क्षमता, एक कीट पिन के साथ अपने मुँह में हेरफेर, और सावधान विच्छेदन प्रदर्शन महत्वपूर्ण कदम और वर्णित पद्धति की सीमाओं के कुछ प्रतिनिधित्व करते हैं । वहां उदाहरण हैं, जहां विच्छेदन फसल है, जो अध्ययन के लिए व्यर्थ कीट प्रदान की वजह से फसल की सामग्री (संभवत: nanoparticle समाधान युक्त) देखो गिलास में पंजाबियों समाधान के साथ मिश्रित के परिणामस्वरूप थे, यह मुश्किल नैनोकणों की घूस की पुष्टि करने के लिए कर रही है । इसके अलावा, कीट छल्ली के ऑटो प्रतिदीप्ति केवल नैनोकणों कल्पना करने का मतलब के रूप में फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं; हालांकि, चरण इसके विपरीत के साथ फोकल इमेजिंग इस मुद्दे को खत्म कर दिया और दृश्य मूल्यांकन के लिए एक और साधन प्रदान की (चित्रा 2), जो भी प्रकाश डाला गया क्यों चुंबकीय नैनोकणों का उपयोग कर के रूप में केवल फ्लोरोसेंट नैनोकणों का विरोध इष्टतम है । यद्यपि यह प्रोटोकॉल कीटों को तरल पदार्थ निगलने के लिए क्षमता का आकलन करने का एक साधन प्रदान करता है, सीमाओं में से एक यह है कि यह नैनोकणों की कल्पना करने का साधन प्रदान नहीं करता है जबकि वे घूस दिए जा रहे हैं; इसलिए, इस प्रक्रिया के दौरान तरल गतिशीलता के अध्ययन के लिए संभावना को दूर करने ।
यहां वर्णित तकनीक कीड़ों की क्षमता का आकलन करने के लिए तरल पदार्थ की छोटी मात्रा में निगलने के लिए एक विधि प्रदान करता है । द्रव खिला कीड़ों की भारी विविधता को देखते हुए, इस प्रोटोकॉल को अपने मुँह में सूक्ष्म और नैनो आकार के नाली के साथ कीड़ों के अंय अध्ययनों में नियोजित किया जा सकता है । इसके अलावा, भविष्य के अध्ययनों से एक समान तकनीक का उपयोग करने के लिए पथ है कि तरल पदार्थ पाचन नहर के माध्यम से यात्रा का निर्धारण, जैसे, फसल को दरकिनार कुछ रक्त में मनाया कीड़े खिलाने, या अध्ययन है कि कैसे लंबे समय तरल पदार्थ विशेष रूप से रहने की जांच संरचनाओं, जैसे midgut या hindgut, जब तक खिलाने, विच्छेदन, और इमेजिंग के बीच समय के रूप में खाते में ले रहे हैं ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
यह काम नेशनल साइंस फाउंडेशन (NSF) ग्रांट नो के सहयोग से किया गया । IOS १३५४९५६. हम Dr. एंड्रयू डी वॉरेन (Lepidoptera और जैव विविधता, फ्लोरिडा प्राकृतिक इतिहास, फ्लोरिडा के विश्वविद्यालय के संग्रहालय के लिए McGuire केंद्र) को तितली छवियों का उपयोग करने की अनुमति के लिए धंयवाद ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20% sucrose solution | Domino Sugar | Sugar needed to produce the sucrose solution with dH2O | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P5493 | 10X concentration diluted to 1X in dH2O for insect dissections |
| Single depression concave slide | AmScope | BS-C6 | Slide is necessary for feeding stage setup |
| Filter paper | EMD Millipore | NY6004700 (60 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Filter paper | EMD Millipore | NY4104700 (41 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Filter paper | EMD Millipore | NY3004700 (30 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Filter paper | EMD Millipore | NY2004700 (20 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Filter paper | EMD Millipore | NY1104700 (11 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Filter paper | EMD Millipore | TCTP04700 (10 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Filter paper | EMD Millipore | TETP04700 (8 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Filter paper | EMD Millipore | TMTP04700 (5 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Filter paper | EMD Millipore | RTTP04700 (1 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Iris microdissecting scissors | Carolina Biological Supply Company | 623555 | Scissors used for dissections |
| Insect pins (#1) | Bioquip Products | 1208B1 | Pins used during dissections and feeding trials |
| Extra-fine point dissecting forceps | Carolina Biological Supply Company | 624684 | Dissecting equipment |
| Leica M205 C Stereoscope | Leica Microsystems | M205 C | Stereoscope used for dissections |
| Inverted confocal microscope | Olympus | IX81 | Fluorescent microscope used to detect magnetic nanoparticles |
| Fisherbrand PTFE Disposable Stir Bar | Fisherscientific | S68067 | Magnet used to detect nanoparticles |
| Kimtech Science Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34155 | Tissues used to secure insects during feeding trials |
| House fly (Musca domestica) pupae | Mantisplace.com | insects for experiments | |
| Blue bottle fly (Calliphora vomitoria) pupae | Mantisplace.com | insects for experiments | |
| Cabbage butterfly (Pieris rapae) larvae | Carolina Biological Supply Company | 144102 | insects for experiments |
| Finnpipette F1 | ThermoFisher Scientific | 4641080N | micropipette for dispensing liquids |
| Finntip 250 pipette tips | ThermoFisher Scientific | 9400250 | micropipette tips |
| Microscope Glass cover slides (=coverslips) (24 x 24 mm) | AmScope | CS-S24-100 | coverslips for viewing the insect's crop on confocal microscope |
References
- Vijaysegaran, S., Walter, G. H., Drew, R. A. I. Mouthpart structure, feeding mechanisms, and natural food sources of adult Bactrocera (Diptera: Tephritidae). Ann Entomol Soc Am. 90, 184-201 (1997).
- Lehnert, M. S., Monaenkova, D., Andrukh, T., Beard, C. E., Adler, P. H., Kornev, K. G. Hydrophobic-hydrophilic dichotomy of the butterfly proboscis. J R Soc Interface. 10, 1-10 (2013).
- Zhao, J., Wu, J., Yan, S. Erection mechanism of glossal hairs during honeybee feeding. J Theor biol. 386, 62-68 (2015).
- Redak, R. A., Purcell, A. H., Lopes, J. R. S., Blua, M. J., Mizell, R. F. 3rd, Andersen, P. C. The biology of xylem fluid-feeding insect vectors of Xylella fastidiosa and their relation to disease epidemiology. Ann. Review Entomol. 49, 243-270 (2004).
- Büttiker, W., Krenn, H. W., Putterill, J. F. The proboscis of eye-frequenting and piercing Lepidoptera (Insecta). Zoomorphology. 116, 77-83 (1996).
- Light, J. E., Smith, V. S., Allen, J. M., Durden, L. A., Reed, D. L. Evolutionary history of mammalian sucking lice (Phthiraptera: Anoplura). BMC Evol Biol. 10, (2010).
- Krenn, H. W., Aspock, H. Form, function and evolution of the mouthparts of blood-feeding Arthropoda. Arthropod Struct Dev. 41, 101-118 (2012).
- Lehnert, M. P., Pereira, R. M., Koehler, P. G., Walker, W., Lehnert, M. S. Control of Cimex lectularius using heat combined with dichlorvos resin strips. Med Vet Entomol. 25, 460-464 (2011).
- Zaspel, J. M., Kononenko, V. S., Goldstein, P. Z. Another blood feeder? Experimental feeding of a fruit-piercing moth species on human blood in the Primorye Territory of far eastern Russia (Lepidoptera: Noctuidae: Calpinae). J Insect Behav. 20, 437-451 (2007).
- Barth, F. G. Insects and flowers: the biology of a partnership. , Princeton University Press. Princeton. (1991).
- Foil, L. D., Adams, W. V., McManus, J. M., Issel, C. J. Bloodmeal residues on mouthparts of Tabanus fuscicostatus (Diptera: Tabanidae) and the potential for mechanical transmission of pathogens. J Med Entomol. 24, 613-616 (1987).
- Monaenkova, D., et al. Butterfly proboscis: combining a drinking straw with a nanosponge facilitated diversification of feeding habits. J R Soc Interface. 9, 720-726 (2012).
- Lehnert, M. S., et al. Mouthpart conduit sizes of fluid-feeding insects determine the ability to feed from pores. Proc. R. Soc. B. 284, (2017).
- Grimaldi, D., Engel, M. S. Evolution of the insects. , Cambridge University Press. New York, NY. (2005).
- Adler, P. H., Foottit, R. G. Insect biodiversity: science and society. , Wiley Blackwell. Chichester, UK. (2009).
- Tsai, C. C., et al. Nanoporous artificial proboscis for probing minute amount of liquids. Nanoscale. 3, (2011).
- Krenn, H. W. Proboscis sensilla in Vanessa cardui (Nympahlidae, Lepidoptera): Functional morphology and significance of flower-probing. Zoomorphology. 118, 23-30 (1998).
- Plateau, J. A. F. Experimental and theoretical researches on the figures of equilibrium of liquid mass withdrawn from the action of gravity. (Transl). Annual Report of the Board Regents Smithsonian Institution. , Government Printing Office. Washington, DC. 207-285 (1863).
- Socha, J. J., Westneat, M. W., Harrison, J. F., Waters, J. S., Lee, W. -K. Real-time phase-contrast x-ray imaging: a new technique for the study of animal form and function. BMC Biol. 5, 6 (2007).
- Westneat, M. W., Socha, J. J., Lee, W. -K. Advances in biological structure, function and physiology using synchrotron x-ray imaging. Annu Rev Physiol. 70, 119-142 (2008).
- Lee, W. -K., Socha, J. J. Direct visualization of hemolymph flow in the heart of a grasshopper (Schistocerca americana). BMC Physiology. 9, 2 (2009).
- Lehnert, M. S., Mulvane, C. P., Brother, A. Mouthpart separation does not impede butterfly feeding. Arthropod Struct Dev. 43, 97-102 (2014).
- Lehnert, M. S., Beard, C. E., Gerard, P. D., Kornev, K. G., Adler, P. H. Structure of the lepidopteran proboscis in relation to feeding guild. J Morphol. 277, 167-182 (2016).
- Yan, H., Sung, B., Kim, M. -H., Kim, C. A novel strategy for functionalizable photoluminescent magnetic nanoparticles. Mater. Res. Express. 1, 045032 (2014).
- Kingsolver, J. G., Daniel, T. L. On the mechanics and energetics of nectar feeding in butterflies. J Theor Biol. 76, 167-179 (1979).
- Krenn, H. W. Feeding mechanisms of adult Lepidoptera: Structure, function, and evolution of the mouthparts. Ann Rev Entomol. 55, 307-327 (2010).
- Tsai, C. -C., Monaenkova, D., Beard, C. E., Adler, P. H., Kornev, K. G. Paradox of the drinking-straw model of the butterfly proboscis. J Exp Biol. 217, 2130-2138 (2014).
- Bauder, J. A. S., Handschuh, S., Metscher, B. D., Krenn, H. W. Functional morphology of the feeding apparatus and evolution of proboscis length in metalmark butterflies (Lepidoptera: Riodinidae). Biol J Linn Soc. 110, 291-304 (2013).
