Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Syntese af monocyt-targeting peptid Amphiphile Micelles til billeddannelse af åreforkalkning

Published: November 17, 2017 doi: 10.3791/56625
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of Southern California

Summary

Dette paper præsenterer en metode, der involverer syntese og karakterisering af monocyt-targeting peptid amphiphile micelles og de tilsvarende undersøgelser for at teste for biokompatibilitet og micelle evne til at binde til monocytter.

Abstract

Åreforkalkning er en stor bidragyder til hjerte-kar-sygdom, den hyppigste årsag til dødsfald på verdensplan, som hævder 17,3 millioner liv hvert år. Åreforkalkning er også den hyppigste årsag til pludselig død og myokardieinfarkt, iværksat af ustabile plaques, som brud og occlude blodkar uden advarsel. Aktuelle imaging modaliteter kan ikke skelne mellem stabil og ustabil plaques, at briste. Peptid amphiphiles micelles (PAMs) kan overvinde denne ulempe, da de kan ændres med en bred vifte af målretning fraspaltning, der bindes specifikt til sygt væv. Monocytter har vist sig at være tidlige markører for åreforkalkning, mens store ophobning af monocytter er forbundet med plaques tilbøjelige til at briste. Derfor, nanopartikler, der kan målrette monocytter kan anvendes til at skelne forskellige stadier af åreforkalkning. Med henblik herpå, her, vi beskriver en protokol for forberedelse af monocyt-targeting PAMs (monocyt chemoattractant protein-1 (MCP-1) PAMs). MCP-1 PAMs samles selv gennem syntese under milde forhold til form nanopartikler af 15 nm i diameter med nær neutral overflade afgift. In vitro, PAMs fandtes for at være biokompatible og havde en høj bindende affinitet for monocytter. De metoder, der beskrives heri viser lovende for en bred vifte af applikationer i åreforkalkning samt andre inflammatoriske sygdomme.

Introduction

Hjerte-kar-sygdomme er fortsat for at være de førende dødsårsager globalt med ca 17,3 millioner dødsfald på verdensplan1. Hjerte-kar-sygdomme er bidraget af åreforkalkning, en tilstand, hvor plaques ophobes i arterier, derved hæmmende blod og ilt flow til cellerne i kroppen2,3. Progression af aterosklerose indebærer fortykkelse og hærdning af arterierne ved en inflammatorisk respons, uregelmæssige lipid metabolisme og plaque oprustning, fører til plaque brud og myokardieinfarkt4,5. Endotelceller express cytokiner og vedhæftning molekyler, som omfatter MCP-1, der binder sig til C-C chemokine receptor (CCR2) fundet på overfladen af monocytter6,7,8. Oxideret kolesterol konverterer monocytter til makrofager i den tidlige fase af plaque dannelse, som forstærker den inflammatoriske reaktion i regionen og fører til vævsskade og dannelse af ustabile eller sårbare plaques9, 10.

Traditionelt, er åreforkalkning evalueret ved at vurdere luminale stenose af anatomiske imaging bruge angiografi eller ultralyd11,12. Men disse metoder kan kun bestemme svær forsnævring af arterievæggen og ikke den tidlige fase af åreforkalkning, som indledende plaque vækst forårsager arteriel remodeling at opretholde arterie størrelse og blood flow hastighed12,13, 14. Derfor underrepresent angiograms åreforkalkning prævalens. Derudover noninvasive billedbehandling teknikker som single photon emission beregnet tomografi, positron emissions tomografi og magnetisk resonans imaging har for nylig blevet brugt til at karakterisere plaque morfologi, som de kan give oprindelige detaljer og karakterisering af plaques. Men disse metoder er ofte begrænset af manglen følsomhed, rumlige opløsning, eller kræver brug af ioniserende stråling, gør imaging plaque progression på forskellige stadier langt mere udfordrende15,16, 17. En billeddannelse levering system, der ville specifikt at identificere plaques på forskellige stadier af åreforkalkning er stadig skal udvikles.

Nanopartikler har vist sig for at være en spirende platform for i vivo plaque målretning og diagnostik18,19,20,21. Især er PAMs fordelagtig på grund af deres kemiske diversitet og evnen til at rumme en række fraspaltning, kompositioner, størrelser, figurer og overflade functionalization22. Peptid amphiphiles (PAs) består af en hydrofil, peptid "headgroup" knyttet til en hydrofobe hale, som er typisk lipider; denne amphiphilic struktur giver selvsamlende kapaciteter og giver mulighed for en multivalent visning af peptider på overfladen af partikel22,23,24. Peptid headgroups kan påvirke partikel form gennem foldning og brint limning mellem peptider25. Peptider, fold gennem β-plade interaktion har vist sig at danne aflange micelles, mens α-spiralformet bekræftelse kan danne både sfærisk og aflange micelles22,23,24, 25,26,27. Polyethylenglycol (PEG) linkers, som skjold overflade afgiften af peptid kan placeres mellem den hydrofile peptid og den hydrofobe hale af PAMs, forbedre tilgængeligheden af nanopartikler i systemisk cirkulation28, 29 , 30 , 31. PAMs er ligeledes fordelagtig, fordi de er biokompatible og har vist sig at have en bred vifte af applikationer32,33. Micelles vandopløselighed tilbyder en fordel over andre nanopartikel-baseret systemer såsom visse polymere nanopartikler, der ikke er opløseligt i vand og suspenderes i solubilizers for injektioner34. Derudover gør mulighed for at oprette PAMs at demontere som svar på en specifik stimuli PAMs en attraktiv kandidat til kontrolleret intracellulære drug delivery35.

Ved at binde til CCR2 receptoren og akkumulere i aortabuen, var PAMs tidligere udviklet til monocyt målretning til at overvåge forskellige stadier af aterosklerotiske læsioner i aorta9. I ApoE- / - mus, monocyt akkumulering øges proportionalt til plaque progression36. Det konstateredes desuden, at patienter med brud-tilbøjelige, sene plaques indeholder større mængder af monocytter37. Ændring af PAMs at indarbejde MCP-1 er derfor nyttigt, fordi det giver mulighed for større målretning specificitet og differentiering mellem tidlige - og sene aterosklerotiske læsioner. Disse proof-of-concept undersøgelser også bekræftet at PAMs er sikker nok til at blive brugt pre-clinically og er ryddet renally38. Da monocytter og inflammation er karakteristiske for andre sygdomme, har MCP-1 PAMs potentiale til at blive anvendt til terapeutiske og diagnostiske programmer i andre sygdomme ud over åreforkalkning8,39,40 , 41.

Heri, rapporterer vi fabrikation af yderst skalerbar og selvsamlede MCP-1 PAMs, som viste partiklen optimal størrelse, overflade afgift og selektiv målretning til monocytter for forøget tænkelig andragender i åreforkalkning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bemærk: Læs sikkerhedsdatablade for reagenser og følg alle kemiske sikkerhedsforanstaltninger som krævet af lokale institution.

1. fremstilling af MCP-1 PAMs

  1. Forberedelse af MCP-1 peptid
    1. Afvejes 0,25 mmol af Fmoc-L-Lys (Boc)-Wang i en reaktion fartøj (RV). Skyl siden af RV med 5 mL dimethylforamide (DMF) i en kemisk stinkskab.
    2. Indlæse RV på en automatiseret benchtop peptid synthesizer. Belastning færdigpakkede aminosyre hætteglas, N '- CYNFTINRKISVQRLASYRRITSS - C', fra C til N-terminus. Omfatte en tom hætteglas på enden for den endelige deprotection trin.
      Bemærk: En scrambled peptid med sekvens, N '- CNNSIIRSKQVLRSTRYFRSATYK - C', kan også syntetiseres ved hjælp af den samme protokol.
    3. Når syntese er færdig, overføre peptider på harpiks fra RV til scintillation hætteglasset med 2-3 mL methanol indtil alle harpiks er overført. Efter harpiksen er sunket til bunds, Fjern supernatanten methanol og fordampe de resterende indtil tør. Støvsuger tør for en yderligere 2 timer eller natten over ved stuetemperatur.
    4. Gøre 12 mL kavalergang løsning indeholdende trifluoracetic syre (TFA):ethanedithiol:water:triisopropylsilane 94:2.5:2.5:1 vol % i en kemisk stinkskab. Swirl kavalergang løsning for at sikre det er jævnt blandet.
      Forsigtig: Fordi triisopropylsilane og ethanedithiol er luft-følsomme, argon purge stock hætteglas med triisopropylsilane og ethanedithiol for 1 min før at sætte dem tilbage.
    5. Placer syntese fartøj (SV) på en arm shaker ved fastspænding nederst halvdelen af SV. Overføre peptid-harpiks til SV med 2 mL af kavalergang løsning, før alle peptid-harpiks er overført.
    6. Vask sider af SV med 3 mL kavalergang løsning. Luk hætten af SV og ryst på 300 svingninger/min for 4 h.
    7. Der afvejes en tom 50 mL-centrifugerør. Optage massen.
    8. Efter 4 h, dræne kløvet peptid løsning fra SV i 50 mL-centrifugerør. Skyl SV flere gange med de resterende kavalergang løsning.
    9. Fordampe kløvet peptid løsning med kvælstof, indtil der er mindre end 4 mL tilbage i centrifugeglasset.
    10. Tilføje 36 mL iskold Eter peptid-kløvet løsning.
    11. Vortex løsning indtil det er helt hvide eller gule. Der centrifugeres ved 3.000 x g i 5 min. ved 4 ° C, og den dekanteres.
    12. Tilføje 40 mL iskold ether til røret. Vortex og sonikeres igen. Gentag centrifugering proces. Dekanteres.
    13. Tør den rå PA pellet med nitrogen gas udrensning indtil Eters er synligt fordampet.
    14. Der tilsættes 20 mL dobbeltdestilleret vand, vortex, og Læg instrumenterne i ultralydsbad indtil peptid er helt opløst i løsning.
    15. Fryse løsningen og lyophilize indtil tør.
    16. Når peptid er tørret, afvejes massen af centrifugeglasset indeholdende den rå peptid. Opløse den rå peptid i 5 mg/mL vand.
    17. 25 mg af rå MCP-1 peptid i 5 mL dobbeltdestilleret vand for at lave en samlet koncentration på 5 mg/mL opløses. Rense den rå MCP-1 peptid af high-performance væskekromatografi (HPLC) ved hjælp af 0,1% TFA i vand (opløsningsmiddel A) og 0,1% TFA i acetonitril (opløsningsmiddel B) som mobile faser på en C8 kolonne med omvendt-fase. Indsprøjte peptid 5 mL i HPLC.
      Bemærk: Den første mobile fase bestod af 100% opløsningsmiddel A med en væskehastighed på 9,0 mL/min. formindske opløsningsmiddel A langsomt til 30% i 27 min og hold på denne sammensætning i 3 min. tilbagevenden gradient til 100% opløsningsmiddel en over 3 min og hold på denne sammensætning i 1 minut til at give en total varighed for 34 min. hold kolonne temperatur på 55 ° C. Brug positiv ion kildetilstand for analysen. Myresyre kan bruges i stedet for TFA, hvis TFA er for Sure til HPLC kolonne. Det anbefales, at den organiske opløsningsmidler sammensætning rampe hastighed ikke må overstige 2%/min til bedre adskillelse.
    18. Analysere hver fraktion, ved hjælp af matrix assisted laser desorption/Ionisation (MALDI) massespektrometri for forventede produkt m/z på 2,890.
      Bemærk: Opløses α-cyano-4-hydroxycinnamic syre på 1 mg/mL i acetonitril/vand (50/50 vol %) som matrix løsning. Spot 0,75 µL af matrix løsning på MALDI pladen, efterfulgt af 0,75 µL af hver fraktion. Udføre analyse ved hjælp af en positiv reflekterende ion mode på en massiv vifte af 500-5.000 Da.
    19. Kombinere produkt fraktioner, blæse acetonitril, fryse, og lyophilize renset peptider indtil tør.
  2. Forberedelse af MCP-1 PA
    1. Forberede en 1,1 kindtand overskud af 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] DSPE-PIND (2000)-maleimide til peptid i separate scintillationshætteglas. Opløses begge forbindelser i dobbeltdestilleret vand at gøre ~ 15 mg/mL. Læg instrumenterne i ultralydsbad i 15 min eller indtil begge løsninger er helt klare.
      Bemærk: DSPE-PIND (2000)-Cy5 er syntetiseret ved hjælp af den samme protokol med DSPE-PIND (2000)-Amin og N-hydroxysuccinimide (NHS) ester-functionalized Cy5, bortset fra step 1.2.3, hvor pH af løsningen er justeret til 8,5.
    2. Tilføje DSPE-PEG (2000)-maleimide løsning til peptid løsning. Vortex og Læg instrumenterne i ultralydsbad.
    3. Tilføj 1 M NaOH dråbevis (1 µL) ad gangen indtil pH af løsningen er 7.
    4. Kvælstof udrensning løsning i 5 min. rør løsningen natten over.
    5. Fryse løsningen og lyophilize indtil tør.
    6. Når den rå vare er tørret, opløse solid i 5 mg/mL vand.
    7. Rense med HPLC som beskrevet ovenfor.
      Bemærk: Ukonjugeret peptid og DSPE-PEG(2000) bør elueres mellem 15-30% økologisk koncentration (vol %), mens DSPE-PEG (2000)-MCP-1 konjugat bør elueres mellem 40-50% økologisk koncentration.
    8. Analysere hver fraktion, ved hjælp af MALDI massespektrometri for den tilsvarende m/z. DSPE-PEG (2000)-MCP-1 skal have en bred m/z peak på 5.760.
      Bemærk: 2,5-dihydroxybenzoic syre er bedst brugt som matrix for DSPE-PIND (2000)-MCP-1 med MALDI.
  3. Samling af MCP-1 PAMs
    1. 1,75 mg opløses MCP-1 PAs med 3 mL methanol i en 1 dram hætteglas. Der sonikeres indtil MCP-1 PA er helt opløst.
      Bemærk: Cy5 amphiphiles kan indarbejdes på en kindtand forholdet mellem 10:90 MCP-1 PA til billedbehandlingsprogrammer.
    2. Fordampe methanol under kvælstof i cirkelbevægelser mens du skylle siden af hætteglasset den resterende methanol, indtil en ensartet film er dannet i bunden af hætteglasset. Vakuum-tør film natten over.
    3. Hydrat film med 3 mL vand eller fosfat buffer saltvand (PBS) til at gøre en 100 µM løsning af MCP-1 PAMs. Forsigtigt vortex og sonikeres løsningen indtil klar. Der inkuberes ved 80 ° C i 30 min.
      Bemærk: Den forhøjede temperatur har vist sig at fremskynde den samlesæt proces og giver mulighed for peptid komponent til at danne den mest stabile sekundære struktur, samtidig sænke kritiske micelle koncentration (CMC)42,43.
    4. Cool den resulterende dispersion til stuetemperatur.

2. karakterisering af MCP-1 PAMs

  1. Dynamisk lysspredning (DLS) og zeta potentiale
    1. Plads 100 µM af MCP-1 PAM eller røræg PAM i en kuvette efter anvisninger af DLS eller zeta potentielle instrument.
      Bemærk: DLS og zeta potentielle kuvetter kan være forskellige afhængigt af instrumentets instruktioner.
    2. Reagensglasset instrument til stuetemperatur. Måle størrelsen og overflade afgift af PAM.
  2. Transmissions elektronmikroskopi (TEM)
    1. Tilføje 7 µL af 50 µM MCP-1 PAM eller røræg PAM på et TEM gitter suspenderet i en selvlukkende pincet i 5 min. vægen væk droplet med en delikat opgave tørre.
    2. Tilføje 7 µL vand til at vaske gitteret. Vægen væk slipværktøjet.
    3. Tilføje 7 µL 1 wt % phosphorwolfram syre i 2 min. vægen væk slipværktøjet. Gentag trin 2.2.2.
    4. Tørre gitteret TEM inden TEM analyse.
  3. Cirkulær dichroism (CD) spektroskopi
    1. Drej på kvælstof i 5-10 min før anvendelsen af instrumentet.
    2. Placer 300 µL af Tom (vand eller PBS) i kuvette.
    3. Måle spektrene på 190-265 nm, 0,2 mm sti-længde med gangen 1 s integration, og en 1 nm båndbredde i stuetemperatur. Indsamle 3 replikater.
    4. Foranstaltning 100 µM MCP-1 peptid, MCP-1 PAM, scrambled peptid og scrambled PAM under samme betingelse beskrevet taktfast 2.3.3. Trække fra blindprøven.
    5. Passe til dataene ved hjælp af en lineær interpolation af polylysine basis spektre.
    6. Slukke for apparatet. Vente 10 min før du slukker for kvælstof.

3. in Vitro analyse af MCP-1 PAMs

  1. In vitro biokompatibilitet
    1. Kultur og udvide WEHI 274.1 murine monocytter i Dulbeccos modificerede Eagle Medium suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS), 1% penicillin-streptomycin, og 0,05 mM 2-mercaptoethanol i 37 ° C under 5% CO2 til passage 5.
      Bemærk: WEHI 274.1 er suspension celler. Når dyrkning, genopfyldes medierne hver 2-3 dage.
    2. Med pipette overfoeres monocytter i medierne i en steril 50 mL-centrifugerør. Der centrifugeres ved 300 x g i 5 min. ved 4 ° C.
    3. Opsug den gamle medier og resuspend i 10 mL frisk medier i centrifugeglasset. Bland langsomt indtil celler er jævnt fordelt i medierne. Tælle celler benytter trypan blå farvning og en hemocytometer.
    4. Fortynd celler, således at 4.000 monocytter pr. 90 µL af medier pr. brønd. Tilføje 90 µL af celler i wells af en 96-brønd plade. Der inkuberes i 24 timer.
      Bemærk: Undgå at bruge brøndene på den udvendige kant af pladen for at undgå forskelle i fordampning og termisk ændringer i pladen. Fyld de udvendige wells med 100 µL PBS.
    5. Opløse 0,15 µmol af MCP-1 peptid, MCP-1 PAM, scrambled peptid eller forvrænget-PAM i 150 µL PBS i separate, steriliseret microcentrifuge rør. Foretage seriel fortynding for at gøre 65 µL 1, 10 og 100 µM af hver prøve.
    6. Tilføje 10 µL PBS for hver koncentration i brønde, der indeholder WEHI 274.1 (total mængde: 100 µL pr. godt, 6 linjer, 96 samlede wells). Der inkuberes i 72 timer.
    7. Tilsæt 10 µL (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) (MTS) i hver brønd. Inkuber i 1 time.
    8. Analysere absorbansen ved hjælp af en pladelæseren på 490 nm eller baseret på producentens anvisninger.
  2. In vitro micelle bindende
    1. Frø 500.000 monocytter i hver brønd med en 6-godt plade i 2 mL af medier indeholdende 100 µM Cy5-mærket MCP-1 PAM (10:90 kindtand forholdet mellem DSPE-PIND (2000)-Cy5 og MCP-1 PA). Inkuber i 1 time.
    2. Indsamle WEHI 274.1 ved centrifugering ved 300 x g i 5 min. ved 4 ° C. Opsug mediet.
    3. Resuspend og vaske cellerne i 2 mL PBS. Der centrifugeres ved 300 x g i 5 min. ved 4 ° C. Opsug PBS. Gentag vaskeprocessen med 2 mL PBS. Opsug PBS.
    4. Tilsættes 2 mL koldt 4% PARAFORMALDEHYD at fastsætte cellerne. Inkuber ved stuetemperatur i 10 min.
    5. Med pipette overfoeres de faste celler på et sterilt glas coverslip i wells af en 6-godt plade. Der centrifugeres ved 400 x g i 5 min.
    6. Fjerne PARAFORMALDEHYD. Vask og skyl med 2 mL PBS én gang. Resuspend med 1 mL PB
      Bemærk: Når skylning, undgå at forstyrre celler på coverslip.
    7. Sætte 10 µL af 90% glycerol i PBS på et dias. Brug en nål og pincet til at afhente coverslip. Tør kanten af coverslip. Forsigtigt placere coverslip på et dias med forsiden nedad.
    8. Forsigtigt tætning kanten af coverslip med klar neglelak. Læg i køleskabet indtil klar til billedbehandling.
    9. Bruge en Konfokal laser scanning mikroskop (CLSM) installeret med lasere til Cy5 på λexcitation = 650 nm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Forberedelse af MCP-1 PAM
CCR2-bindende motiv (restprodukter fra 13-35) af MCP-1 protein [YNFTNRKISVQRLASYRRITSSK] eller røræg peptid [YNSLVFRIRNSTQRKYRASIST] blev ændret ved at tilføje en cystein rester på N-terminus. MCP-1 peptid blev syntetiseret af en Fmoc-medieret fast-fase metode ved hjælp af en automatiseret peptid synthesizer. Den rå peptid blev renset med omvendt-fase HPLC på en C8 kolonne ved 50 ° C ved hjælp af 0,1% TFA i acetonitril/vand-blandinger og karakteriseret ved MALDI massespektrometri (figur 1). Cystein-indeholder peptid blev konjugeret på DSPE-PEG2000-maleimide at give DSPE-PEG (2000)-peptid konjugater via en thioether kobling. Efter 24 timer ved stuetemperatur, blev den rå vare renset ved HPLC (figur 2). DSPE-PIND (2000)-Cy5 blev syntetiseret ved hjælp af en NHS ester reaktion. Monocyt-targeting PAMs Co samles med DSPE-PEG (2000)-MCP-1 og DSPE-PIND (2000)-Cy5 blev fremstillet ved opløsning i methanol, der var derefter inddampes af N2, og den deraf følgende film blev tørret under vakuum natten over og selv samlet i vand eller PBS gennem de hydrofobe interaktioner af grupperne"hale" til form MCP-1 PAMs.

Karakterisering af MCP-1 PAM
DLS data og TEM billeder af monocyt-targeting PAMs viste godt spredte, sfæriske nanopartikel 15,3 ± 2,0 nm i diameter (figur 3 og tabel 1). Både MCP-1 PAMs og scrambled PAMs viste en lille positiv zeta potentielle 12,1 ± 3.1 mV og 13,7 ± 1.9 mV, henholdsvis (tabel 1). CD viste, at indarbejdelsen af MCP-1 peptid inden for micelle forbedret sekundær struktur (tabel 2, MCP-1 PAMs: 46,2 ± 0,9% β-plade, 53.1 ± 1,4% tilfældig coil og gratis MCP1: 34.2 ± 3,5% β-plade, 65.8 ± 3,5% tilfældig coil).

In Vitro Analyse af MCP-1 PAM
In vitro biokompatibilitet og monocyt binding af MCP-1 PAMs blev observeret af Konfokal mikroskopi. Musen monocytter blev inkuberet med stigende koncentrationer af MCP-1, MCP-1 PAM, scrambled peptid og scrambled PAM for 72 h, og cellerne fandtes for at være levedygtig og biokompatible op til 100 µM (figur 4). Desuden viste konfokalmikroskopi specifikke binding af monocytter at MCP-1 PAMs sammenlignet med røræg PAMs (figur 5).

Figure 1
Figur 1 : HPLC kromatogrammet på 220 nm (bølgelængde af peptid obligationer) og 254 nm (tyrosin bølgelængde) af MCP-1 peptid (A) og scrambled peptid (B) (Boxed peak på 7,4 min). MALDI-TOF masse spektrum af MCP-1 peptid (C) og scrambled peptid (D) på en afstand af 500-5.000 Da viser peak for [M + H]+ på m/z 2,888 (forventet 2,890). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: HPLC kromatogrammet på 220 nm (bølgelængde af peptid obligationer) og 254 nm (tyrosin bølgelængde) af DSPE-PIND (2000)-MCP-1 (A) og DSPE-PIND (2000)-scrambled (B). (Boxed peak på 16,9 min). (C) MALDI-TOF masse spektrum af DSPE-PEG (2000)-MCP-1 på en vifte af 1.000-10.000 Da viser toppe for [M + H]+ på m/z 2,888 (forventet 2,890) for MCP-1 og m/z 5,758 (forventede 5.760) for DSPE-PEG (2000)-MCP-1. (D) MALDI-TOF masse spektrum af DSPE-PIND (2000)-scrambled på en vifte af 1.000-10.000 Da viser toppe for [M + H]+ på m/z 2,887 (forventet 2,890) for scrambled peptid og m/z 5,761 (forventede 5.760) for DSPE-PIND-forvrænget. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : TEM billeder af MCP-1 PAM (A) og scrambled PAM (B). Skalalinjen = 100 nm. Antal gennemsnitlige størrelse distribution af MCP-1 PAM (C) og scrambled PAM via DLS (D). Data er gennemsnit ± SD (n = 3). (E) CD analyse af MCP-1 og scrambled peptider og PAMs (n = 3). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : In vitro levedygtighed af WEHI 274.1 murine monocytter efter 72 h eksponering for MCP-1 peptid, MCP-1 PAM, scrambled peptid, og scrambled PAM. Data er gennemsnit ± SD (n = 6). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: CLSM billeder af MCP-1 PAM (A) og scrambled PAM (B) indarbejdet med 10 mol % Cy5 PA (rød) inkuberes med WEHI 274.1 for 1 h. skalalinjen = 20 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

PAMs Antal-Ave diameter (nm) PDI Zeta potentiale (mV)
MCP-1 15,3 ± 2,0 0.119 ± 0.006 12,1 ± 3.1
Scrambled 16,9 ± 1,4 0.232 ± 0.019 13,7 ± 1,9
Målt i PBS buffer. Dataene udtrykt som betyder ± SD.

Tabel 1: Størrelse, polydispersity og zeta potentiale af PAMs.

a-Helix (%) b-ark (%) Tilfældige Coil (%)
MCP-1 peptid 0.0 ± 0,0 36,2 ± 2.2 63.8 ± 1.8
MCP-1 PAM 0,7 ± 0,6 46,2 ± 0,9 53.1 ± 1,4
Scrambled peptid 0.0 ± 0,0 43,7 ± 2.1 56.3 ± 3,5
Scrambled PAM 0.0 ± 0,0 60,7 ± 0,2 39.3 ± 0,2

Tabel 2: Sekundær struktur sammensætning af peptider og PAMs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

MCP-1 PAMs er en lovende molekylær billeddannelse platform, bestående af en hydrofil målretning peptid og hydrofobe hale, der driver nanopartikel selvsamlede karakter. Denne monocyt-targeting micelle kan fremstilles ved simpel syntese og rensning trin af MCP-1 peptid og DSPE-PEG (2000)-MCP-1. PAMs har mange gavnlige egenskaber for i vivo molecular imaging som deres samlesæt under milde betingelser, iboende bionedbrydelighed og strukturelle og kemiske mangfoldighed giver mulighed for indarbejdning af andre billeddiagnostiske fraspaltning eller målretning peptider til selektivt levere til et bestemt sted af interesse. Deres partikelstørrelse, form og sammensætning kan indstilles ved at ændre peptid, hydrofobe hale eller micelle koncentration, giver mulighed for optimal kemiske og fysiske egenskaber for en bred vifte af applikationer22,33.

Et par begrænsninger af denne protokol bør nævnes. Først, da PAMs er drevet af hydrofobe interaktioner, er det nødvendigt at konstruere målretning peptider, der er hydrofilt, hvorved den målretning gruppe skal forelægges på overfladen af micelle. Hvis peptid sekvens er hydrofobe, en tilføjelse af en eller to hydrofile aminosyrer på C-terminus kan imødekommes, men tilsætning af aminosyrer kunne påvirke peptid sekundær struktur inden for micelle, dermed ændrer egenskaberne for den peptid i dets oprindelige tilstand i protein44,45. For det andet ved lave koncentrationer har PAMs dårlig stabilitet i vandige miljøer som de er stærkt afhængige af CMC, den mindste koncentration behov for PAs til at danne en micellar struktur46. Under CMC, micelle dekompilerer at enkelte PA monomerer, og begrænser micelle at fungere som en transportør og losse et lægemiddel på et bestemt websted47. For at afbøde denne ulempe, kan CMC nedsættes ved at øge kædelængde hydrofobe hale48,49. Endelig anbefales langtidsopbevaring af PAMs i løsning ikke som PA sekundær struktur kan ændre sig med tiden, som dermed påvirker micellar struktur og stabilitet samt effektiviteten i ligand bindende26.

Sammenfattende viser denne protokol en robust, selvsamlede peptid micelle-baserede Nanomedicin strategi for imaging åreforkalkning. MCP-1 PAMs er biokompatible, biologisk nedbrydelige og ugiftige som komponenter af micelle er inspireret fra elementer endogene til kroppen. Endnu vigtigere, har MCP-1 PAMs præferentiel binding til monocytter, som stige proportionalt til plaque progression, udvikling af en ikke-invasiv metode til at differentiere stadier af aterosklerotiske plaques. På grund af modularitet af denne platform kan PAMs indarbejde therapeutics, yderligere målretning peptider, imaging fraspaltning og nukleinsyrer. Derfor, da sådanne dynamiske evner af disse multifunktionelle micelles, vi mener, at disse partikler holder meget lovende for kliniske oversættelse i åreforkalkning og andre sygdomme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne anerkende den finansielle støtte fra University of Southern California, National Heart, Lung, og Blood Institute (NHLBI), R00HL124279, Eli og Edythe bred Innovation Award og Larsen Whittier Foundation Non-kræft Translationel forskning Award givet til Quraishy. Forfatterne takke centrum for Elektron Mikroskopi og mikroanalyser, Center of Excellence i NanoBiophysics, Center of Excellence for Molekylær karakterisering og Translational Imaging Center ved University of Southern California for bistand i instrumental opsætninger.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-ethanedithiol VWR E0032 for peptide synthesis
10 mL disposable serological pipets VWR 89130-898 for cell culture
15 mL centrifuge tubes, polypropylene VWR 89401-566 for various applications
2,5-dihydroxybenzoic acid, 99% Fisher Scientific AC165200050 for MALDI
25 mL disposable serological pipets VWR 89130-900 for cell culture
2-Mercaptoethanol, 50 mM ThermoFisher Scientific 31350010 for cell culture
5 mL disposable serological pipets VWR 89130-896 for cell culture
50 mL centrifuge tubes VWR 89039-658 for various applications
75 cm2 culture flask Fisher Scientific 13-680-65 for cell culture
75 mL reaction vessel Protein Technologies 3000005 for peptide synthesis
96-wells cell culture plate VWR 40101-346 for MTS assay
Acetonitrile, HPLC grade Fisher Scientific A998SK-4 for HPLC purification
Borosilicate glass, 1 dram VWR 66011-041 for PAM synthesis
Borosillicate glass pipet, Long tips VWR 14673-043 for various applications
Coverslip, 0.16-0.19 mm, 22 x 22 mm Fisher Scientific 12-542B for confocal microscopy
Cy5 amine Abcam ab146463 for peptide conjugation
Diethyl ether, ACS grade Fisher Scientific E138-1 for peptide precipitation
Disposable syringes, 20 mL Fisher Scientific 14-817-54 for HPLC purification
Double neubauer ruled hemocytometer VWR 63510-13 for cell counting
DSPE-PEG(2000) amine Avanti 880128P for peptide conjugation
DSPE-PEG(2000) maleimide Avanti 880126P for peptide conjugation
DSPE-PEG(2000)-NHS ester  Nanocs PG2-DSNS-10K for conjugation to Cy5
Dulbecco's modified eagle medium-high glucose Sigma Aldrich D5796-500ML for cell culture
Fetal bovine serum, qualified, heat inactivated ThermoFisher Scientific 10438026 for cell culture
Fmoc-L-Ala-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-A for peptide synthesis
Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-RBF for peptide synthesis
Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-NT for peptide synthesis
Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-CT for peptide synthesis
Fmoc-L-Gln(Trt)-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-QT for peptide synthesis
Fmoc-L-Ile-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-I for peptide synthesis
Fmoc-L-Leu-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-L for peptide synthesis
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-KBC for peptide synthesis
Fmoc-L-Phe-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-F for peptide synthesis
Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-SB for peptide synthesis
Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-TB for peptide synthesis
Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-YB for peptide synthesis
Fmoc-L-Val-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-V for peptide synthesis
Fmoc-Lys(Boc)-wang resin, 100-200 mesh Novabiochem 856013 for peptide synthesis
Formic acid, optima LC/MS grade Fisher Scientific A117-50 for HPLC purification
Glycerol VWR M152-1L for confocal microscopy
Hand tally counter Fisher Scientific S90189 for cell counting
Magnetic stir bars, egg-shaped VWR 58949-006 for peptide conjugation
Methanol, ACS certified Fisher Scientific A412-4 for PAM synthesis
MTS cell proliferation colorimetric assay kit VWR 10191-104 for MTS assay
N,N-Dimethylformamide, sequencing grade Fisher Scientific BP1160-4 for peptide synthesis
N-Methylmorpholine Protein Technologies S-1L-NMM for peptide synthesis
Paraformaldehyde Fisher Scientific AC416780250 for fixing cells
PBS, pH 7.4 ThermoFisher Scientific 10010049 for various applications
Penicillin/streptomycin, 10,000 U/mL ThermoFisher Scientific 15140122 for cell culture
Peptide synthesis vessel, 25 mL  Fisher Scientific CG186011 for peptide synthesis
Phosphotungstic acid  Fisher Scientific A248-25 for TEM
Piperidine Spectrum P1146-2.5LTGL for peptide synthesis
Plain glass microscope slide 75 x 25 mm Fisher Scientific 12-550-A3 for confocal microscopy
Reagent reservoirs, sterile  VWR 95128093 for cell culture
Self-closing tweezer TedPella 515 for TEM
TEM support film TedPella 01814F for TEM
Trifluoroacetic acid  Fisher Scientific BP618-500 for peptide cleavage and HPLC purification
Triisopropylsilane VWR TCT1533-5ml for peptide cleavage
Trypan blue solution, 0.4% ThermoFisher Scientific 15250061 for cell counting
Tweezer, general purpose-serrated VWR 231-SA-SE for confocal microscopy
WEHI-274.1 ATCC ATCC CRL-1679 murine monocyte
automated benchtop peptide synthesizer Protein Technologies PS3 Benchtop Peptide Synthesizer
α- cyano- 4- hydroxycinnamic acid, 99% Sigma Aldrich 476870-2G for MALDI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e60 (2016).
  2. Falk, E. Pathogenesis of atherosclerosis. J. Am. Coll. Cardiol. 47 (8, Suppl. C), C7-C12 (2006).
  3. Rahmani, M., Cruz, R. P., Granville, D. J., McManus, B. M. Allograft Vasculopathy Versus Atherosclerosis. Circ. Res. 99 (8), 801-815 (2006).
  4. Luis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407 (6801), 233-241 (2000).
  5. Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature (London, U. K). 473 (7347), 317-325 (2011).
  6. Boring, L., Gosling, J., Cleary, M., Charo, I. F. Decreased lesion formation in CCR2-/- mice reveals a role for chemokines in the initiation of atherosclerosis. Nature (London). 394 (6696), 894-897 (1998).
  7. Szmitko, P. E., et al. New Markers of Inflammation and Endothelial Cell Activation. Circulation. 108 (16), 1917-1923 (2003).
  8. Deshmane, S. L., Kremlev, S., Amini, S., Sawaya, B. E. Monocyte Chemoattractant Protein-1 (MCP-1): An Overview. J. Interferon Cytokine Res. 29 (6), 313-326 (2009).
  9. Chung, E. J., et al. Monocyte-Targeting Supramolecular Micellar Assemblies: A Molecular Diagnostic Tool for Atherosclerosis. Adv. Healthcare Mater. 4 (3), 367-376 (2015).
  10. Chung, E. J. Targeting and therapeutic peptides in nanomedicine for atherosclerosis. Exp Biol Med (Maywood). 241 (9), 891-898 (2016).
  11. Sanz, J., Fayad, Z. A. Imaging of atherosclerotic cardiovascular disease. Nature (London, U. K.). 451 (7181), 953-957 (2008).
  12. Tarkin, J. M., et al. Imaging Atherosclerosis. Circ. Res. 118 (4), 750-769 (2016).
  13. Hennerici, M., Baezner, H., Daffertshofer, M. Ultrasound and arterial wall disease. Cerebrovasc Dis. 17 Suppl 1, 19-33 (2004).
  14. Nissen, S. E. Application of intravascular ultrasound to characterize coronary artery disease and assess the progression or regression of atherosclerosis. Am J Cardiol. 89 (4A), 24B-31B (2002).
  15. Khalil, M. M., Tremoleda, J. L., Bayomy, T. B., Gsell, W. Molecular SPECT Imaging: An Overview. Int J Mol Imaging. 2011, 796025 (2011).
  16. Lerakis, S., et al. Imaging of the vulnerable plaque: noninvasive and invasive techniques. Am J Med Sci. 336 (4), 342-348 (2008).
  17. Sun, Z. H., Rashmizal, H., Xu, L. Molecular imaging of plaques in coronary arteries with PET and SPECT. J Geriatr Cardiol. 11 (3), 259-273 (2014).
  18. Godin, B., et al. Emerging applications of nanomedicine for the diagnosis and treatment of cardiovascular diseases. Trends Pharmacol. Sci. 31 (5), 199-205 (2010).
  19. Branco de Barros, A. L., Tsourkas, A., Saboury, B., Cardoso, V. N., Alavi, A. Emerging role of radiolabeled nanoparticles as an effective diagnostic technique. EJNMMI Res. 2 (1), 31-39 (2012).
  20. Jayagopal, A., Linton, M. F., Fazio, S., Haselton, F. R. Insights into atherosclerosis using nanotechnology. Curr. Atheroscler. Rep. 12 (3), 209-215 (2010).
  21. Khodabandehlou, K., Masehi-Lano, J. J., Poon, C., Wang, J., Chung, E. J. Targeting cell adhesion molecules with nanoparticles using in vivo and flow-based in vitro models of atherosclerosis. Exp Biol Med (Maywood). 242 (8), 799-812 (2017).
  22. Trent, A., Marullo, R., Lin, B., Black, M., Tirrell, M. Structural properties of soluble peptide amphiphile micelles. Soft Matter. 7 (20), 9572-9582 (2011).
  23. Hartgerink, J. D., Beniash, E., Stupp, S. I. Peptide-amphiphile nanofibers: A versatile scaffold for the preparation of self-assembling materials. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (8), 5133-5138 (2002).
  24. Missirlis, D., et al. Effect of the Peptide Secondary Structure on the Peptide Amphiphile Supramolecular Structure and Interactions. Langmuir. 27 (10), 6163-6170 (2011).
  25. Zhong, L., Johnson, W. C. Environment affects amino acid preference for secondary structure. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89 (10), 4462-4465 (1992).
  26. Shimada, T., Lee, S., Bates, F. S., Hotta, A., Tirrell, M. Wormlike Micelle Formation in Peptide-Lipid Conjugates Driven by Secondary Structure Transformation of the Headgroups. J. Phys. Chem. B. 113 (42), 13711-13714 (2009).
  27. Missirlis, D., et al. Linker Chemistry Determines Secondary Structure of p5314-29 in Peptide Amphiphile Micelles. Bioconjugate Chem. 21 (3), 465-475 (2010).
  28. Elbert, D. L., Hubbell, J. A. Surface treatments of polymers for biocompatibility. Annu. Rev. Mater. Sci. 26, 365-394 (1996).
  29. Xue, Y., O'Mara, M. L., Surawski, P. P. T., Trau, M., Mark, A. E. Effect of Poly(ethylene glycol) (PEG) Spacers on the Conformational Properties of Small Peptides: A Molecular Dynamics Study. Langmuir. 27 (1), 296-303 (2011).
  30. Canalle, L. A., Loewik, D. W. P. M., van Hest, J. C. M. Polypeptide-polymer bioconjugates. Chem. Soc. Rev. 39 (1), 329-353 (2010).
  31. Hamley, I. W. PEG-Peptide Conjugates. Biomacromolecules. 15 (5), 1543-1559 (2014).
  32. Acar, H., et al. Self-assembling peptide-based building blocks in medical applications. Adv. Drug Delivery Rev. , (2016).
  33. Busseron, E., Ruff, Y., Moulin, E., Giuseppone, N. Supramolecular self-assemblies as functional nanomaterials. Nanoscale. 5 (16), 7098-7140 (2013).
  34. Barrett, J. C., et al. Modular Peptide Amphiphile Micelles Improving an Antibody-Mediated Immune Response to Group A Streptococcus. ACS Biomater. Sci. Eng. 3 (2), 144-152 (2017).
  35. Toughrai, S., et al. Reduction-Sensitive Amphiphilic Triblock Copolymers Self-Assemble Into Stimuli-Responsive Micelles for Drug Delivery. Macromol. Biosci. 15 (4), 481-489 (2015).
  36. Swirski, F. K., et al. Monocyte accumulation in mouse atherogenesis is progressive and proportional to extent of disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (27), 10340-10345 (2006).
  37. Kashiwagi, M., et al. Association of monocyte subsets with vulnerability characteristics of coronary plaques as assessed by 64-slice multidetector computed tomography in patients with stable angina pectoris. Atherosclerosis (Amsterdam, Neth). 212 (1), 171-176 (2010).
  38. Chung, E. J., Tirrell, M. Recent Advances in Targeted, Self-Assembling Nanoparticles to Address Vascular Damage Due to Atherosclerosis. Adv. Healthcare Mater. 4 (16), 2408-2422 (2015).
  39. Cassetta, L., Pollard, J. W. Cancer immunosurveillance: role of patrolling monocytes. Cell Res. 26 (1), 3-4 (2016).
  40. Williams, C. B., Yeh, E. S., Soloff, A. C. Tumor-associated macrophages: unwitting accomplices in breast cancer malignancy. NPJ Breast Cancer. 2, (2016).
  41. Richards, D. M., Hettinger, J., Feuerer, M. Monocytes and Macrophages in Cancer: Development and Functions. Cancer Microenviron. 6 (2), 179-191 (2013).
  42. Schick, M. J. Effect of temperature on the critical micelle concentration of nonionic detergents. Thermodynamics of micelle formation. J. Phys. Chem. 67 (9), 1796-1799 (1963).
  43. Marullo, R., Kastantin, M., Drews, L. B., Tirrell, M. Peptide contour length determines equilibrium secondary structure in protein-analogous micelles. Biopolymers. 99 (9), 573-581 (2013).
  44. Hilbich, C., Kisters-Woike, B., Reed, J., Masters, C. L., Beyreuther, K. Substitutions of hydrophobic amino acids reduce the amyloidogenicity of Alzheimer's disease βA4 peptides. J. Mol. Biol. 228 (2), 460-473 (1992).
  45. Trevino, S. R., Scholtz, J. M., Pace, C. N. Amino Acid Contribution to Protein Solubility: Asp, Glu, and Ser Contribute more Favorably than the other Hydrophilic Amino Acids in RNase Sa. J. Mol. Biol. 366 (2), 449-460 (2007).
  46. Kim, S. W., Shi, Y. Z., Kim, J. Y., Park, K. N., Cheng, J. X. Overcoming the barriers in micellar drug delivery: Loading efficiency, in vivo stability, and micelle-cell interaction. Expert Opin Drug Delivery. 7 (1), 49-62 (2010).
  47. Rangel-Yagui, C. O., Pessoa, A. Jr, Tavares, L. C. Micellar solubilization of drugs. J. Pharm. Pharm. Sci. 8 (2), 147-163 (2005).
  48. Batrakova, E., et al. Fundamental relationships between the composition of pluronic block copolymers and their hypersensitization effect in MDR cancer cells. Pharm. Res. 16 (9), 1373-1379 (1999).
  49. Chen, L. J., Lin, S. Y., Huang, C. C. Effect of Hydrophobic Chain Length of Surfactants on Enthalpy-Entropy Compensation of Micellization. J. Phys. Chem. B. 102 (22), 4350-4356 (1998).

Tags

Bioteknologi sag 129 monocyt peptid micelles åreforkalkning nanopartikel billedbehandling samlesæt diagnostiske
Syntese af monocyt-targeting peptid Amphiphile Micelles til billeddannelse af åreforkalkning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Poon, C., Sarkar, M., Chung, E. J.… More

Poon, C., Sarkar, M., Chung, E. J. Synthesis of Monocyte-targeting Peptide Amphiphile Micelles for Imaging of Atherosclerosis. J. Vis. Exp. (129), e56625, doi:10.3791/56625 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter