Summary
이 종이 합성 및 펩 티 드 amphiphile micelles monocyte 대상의 특성을 포함 하는 메서드를 제공 하 고 해당 생체 적합성 및 monocytes에 바인딩할는 micelle의 능력에 대 한 테스트 분석 실험.
Abstract
동맥 경화는 매년 17.3 백만 생활을 요구 하는 심혈 관 질환, 세계, 죽음의 주요 원인에 큰 기여. 동맥 경화는 급 사, 심근 경색, 불안정 플 라크 파열 및 경고 없이 혈관을 가리고 하는 사주의 주요 원인 이기도 합니다. 현재 modalities 이미징 안정과 불안정 플 라크 파열을 구별할 수 없습니다. 펩 티 드 amphiphiles micelles (PAMs)로 다양 한 병에 걸린 조직을 구체적으로 바인딩할 moieties를 대상으로 수정할 수 있습니다이 결점을 극복할 수 있다. Monocytes는 monocytes의 큰 축적은 플 라크 파열 경향이 연관 동맥 경화 증의 조기 표식 되도록 표시 되었습니다. 따라서, monocytes 대상 나노 차별 동맥 경화의 다른 단계를 사용할 수 있습니다. 이 위해, 여기, 우리 PAMs monocyte 타겟팅의 준비에 대 한 프로토콜 설명 (monocyte chemoattractant 단백질-1 (MCP-1) PAMs). MCP-1 PAMs 15의 형태로 나노 입자에 온화한 조건에서 합성을 통해 조립 자체는 중립 표면 충전 근처와 직경에서 nm. 생체 외에서 PAMs 생체 발견 했다 및 monocytes에 대 한 높은 바인딩 선호도 했다. 여기에 설명 된 방법을 다른 염증 성 질환 및 동맥 경화에 다양 한 응용 프로그램에 대 한 약속을 보여줍니다.
Introduction
심혈 관 질환 약 17.3 백만 죽음 전세계1와 세계적으로 죽음의 주요한 원인에 남아 있다. 심혈 관계 질환 동맥 경화, 있는 패 동맥, 억제 함으로써 혈액에는 바디2,3의 셀에 산소 흐름을 구축 하는 조건에 의해 크게 기여 하고있다. 동맥 경화 증의 진행 한 염증 반응, 불규칙 한 지질 물질 대사, 및 패 형성, 플 라크 파열과 심근 경색4,5로 이어지는 두껍게 및 동맥의 경화를 포함 한다. 내 피 세포 cytokines와 접착 분자, MCP-1 C-C chemokine 수용 체 (CCR2) monocytes6,,78의 표면에서 발견을 포함 하는 표현. 산화 된 콜레스테롤 플 라크 형성, 지역에서 염증 반응을 증폭 하 고 조직 상해와 불안정 하거나 취약 한 패9, 의 형성의 초기 단계 동안 세포 monocytes 변환 10.
전통적으로, 동맥 경화는 혈관 또는 초음파11,12를 사용 하 여 해부학 적 영상에 의해 luminal 협 착 증을 평가 하 여 평가 됩니다. 그러나, 이러한 방법을 확인할 수 있습니다만 심각한 동맥 벽의 하지 동맥 경화 증의 초기 단계 축소로 초기 패 성장 하면 동맥 크기를 유지 하 여 혈액 흐름 속도12,13, 개장 하는 동맥 14. 따라서, 조 경화 유행 underrepresent. 또한, 비 침 투 적인 이미징 기법 등 단일 광자 방출 단층 촬영, 양전자 방출 단층 촬영 및 자기 공명 영상 최근 그들은 초기 세부 정보를 제공할 수 있는 플 라크 형태를 특성화 하는 데 사용 되었습니다 계산 및 플 라크 특성 그러나, 이러한 형식은 종종 감도, 해상도의 부족에 의해 제한 또는 이미징 패 진행15,16, 훨씬 더 도전 하는 여러 단계에서 만드는 이온화 방사선의 사용을 필요로 17. 특히 동맥 경화 증의 여러 단계에서 플 라크를 식별 것는 영상 전달 시스템 개발에 남아 있다.
나노 입자는 vivo에서 플 라크 타겟팅 및 진단18,19,,2021신흥 플랫폼으로 나타났습니다. 특히, PAMs는 유리한 그들의 화학 다양성 및 moieties, 구성, 크기, 모양 및 표면 기능화22의 다양 한 수용할 수 있습니다. 펩 티 드 amphiphiles (Pa)는 친수성, 펩 티 드 "headgroup"는 일반적으로 지질; 소수 성 꼬리에 연결 구성 이 amphiphilic 구조 자가 조립 기능을 수 여 하 고 입자22,,2324의 표면에 펩 티 드의 multivalent 표시에 대 한 수 있습니다. 펩 티 드 headgroups 폴딩 및 수소 펩 티 드25사이 결합을 통해 입자 모양에 영향을 수 있습니다. Β-시트 상호 작용을 통해 배 펩 티 드 α 나선형 확인 모두 구형 하 고 길쭉한 micelles22,,2324, 를 형성할 수 있다 동안 길쭉한 micelles을 형성 하기 위하여 보였다 25,,2627. 방패는 펩 티 드의 표면 충전 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG) 링커 친수성 펩 티 드와 조직의 순환28, 나노 입자의 가용성을 향상 PAMs의 소수 성 꼬리 사이 놓일 수 있다 29 , 30 , 31. PAMs는 또한 유리 때문에 생체 이며 다양 한 응용 프로그램32,33를가지고 표시 되었습니다. Micelles의 물 용 해도 물에 용 해 되지 않으며 주사34착에 정지 해야 하는 특정 고분자 나노 입자와 같은 나노 기반 시스템 다른 이점을 제공 합니다. 또한, 분해 PAMs 특정 자극에 대 한 응답에서을 제어 세포내 약물 전달35매력적인 후보를 PAMs를 만든다.
CCR2 수용 체에 바인딩 및 대동맥 아치에 축적, PAMs 이전 monocyte 모니터링9대동맥 동맥 경 화성 병 변의 다른 단계를 대상으로 개발 했다. ApoE-/- 생쥐에서 monocyte 누적 패 진행36비례적으로 증가합니다. 또한, 환자 파열 발생 하기 쉬운, 단계의 플 라크 monocytes37의 높은 금액을 포함 발견 했다. 따라서, MCP-1 통합 PAMs 수정은 큰 대상 특이성 및 초기-을 단계의 동맥 경 화성 병 변 사이 감 별 법에 대 한 허용 하기 때문에 유용 합니다. 이러한 개념 증명 연구 또한 PAMs 충분히 안전 하 게 pre-clinically 사용할 수 있으며38renally 삭제를 확인 합니다. Monocytes과 염증은 다른 질병에, MCP-1 PAMs는 롬8,,3940 넘어 다른 질병에서 치료 및 진단 응용 프로그램에 사용 될 가능성이 , 41.
여기, 우리는 입자의 최적의 크기, 표면, 그리고 선택적 monocytes 동맥 경화에서 향상 된 이미징 응용 프로그램을 대상으로 시연 하는 높은 확장성과 자기 조립 MCP-1 PAMs의 제조를 보고 합니다.
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Protocol
참고: 시 약에 대 한 MSDS를 읽고을 로컬 기관에 의해 필요에 따라 모든 화학 안전 조치를 따르십시오.
1입니다. MCP-1 PAMs의 준비
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MCP-1 펩 티 드의 준비
- Fmoc L 리스 (Boc)의 0.25 mmol을 무게-반응 선박 (RV)에 왕. 화학 증기 두건에서 5 mL dimethylforamide (DMF)와 RV의 측을 씻어.
- 자동된 벤치탑 펩 티 드 합성기에 RV를 로드 합니다. 사전 패키지 된 아미노 산 성 튜브, N '-CYNFTINRKISVQRLASYRRITSS-C', C N-말단을 로드 합니다. 최종 deprotection 단계 끝에 빈 병을 포함 합니다.
참고: 시퀀스, N '-CNNSIIRSKQVLRSTRYFRSATYK-C', 스크램블된 펩 티 드 수 또한 될 합성 같은 프로토콜을 사용 하 여. - 합성이 완료 되 면 전송는 펩 티 드 수 지에는 RV에서 2-3 mL 메탄올을 가진 섬광 유리병에 수 지의 모든 전송 되기 전 까지는. 수 지 바닥에 침 몰 했다, 후 표면에 뜨는 메탄올을 제거 하 고 건조까지 남은 증발. 진공 건조는 추가적인 2 시간 또는 하룻밤 실 온에서.
- 화학 증기 두건에서 94:2.5:2.5:1 vol %trifluoracetic 산 (TFA):ethanedithiol:water:triisopropylsilane를 포함 하는 12 mL 분열 솔루션을 확인 합니다. 그것은 균일 하 게 혼합 되도록 절단 솔루션을 소용돌이 친다.
주의: triisopropylsilane와 ethanedithiol는 공기에 민감한, 때문에 아르곤 triisopropylsilane 그리고 그들을 다시 퍼 팅 하기 전에 1 분 동안 ethanedithiol의 재고 튜브를 제거. - SV의 절반 하단 클램핑 함으로써 팔 쉐이 커에 합성 선박 (SV)를 배치 합니다. 펩 티 드 수 지의 모든 전송 됩니다 때까지 분열 솔루션의 2 mL와 SV에 펩 티 드-수 지를 전송 합니다.
- 워시 3 mL 분열 솔루션 SV의 측면. SV의 뚜껑 닫고 흔들어 4 h 300 진동/분.
- 무게는 빈 50 mL 원심 분리기 튜브 밖으로. 질량을 기록 합니다.
- 4 h 후 SV에서 쪼개진된 펩 티 드 솔루션 50 mL 원심 분리기 관으로 배출. SV를 나머지 분열 솔루션으로 여러 번 헹 구 십시오.
- 증발 질소로 쪼개진된 펩 티 드 솔루션 4 mL 미만 원심 분리기 튜브에 남아 있을 때까지.
- 펩 티 드 죽 습 솔루션에 얼음 처럼 차가운 에테르의 36 mL를 추가 합니다.
- 소용돌이 그것까지 솔루션은 완전히 흰색 또는 노란색. 4 ° C에서 5 분 동안 3000 x g에서 centrifuge 고는 상쾌한 가만히 따르다.
- 튜브를 얼음 처럼 차가운 에테르 40 mL를 추가 합니다. 소용돌이 다시 sonicate. 원심 분리 과정을 반복 합니다. 상쾌한을 가만히 따르다.
- 건조 질소 가스 정화 에테르 가시 증발 때까지 함께 원유 PA 펠 릿.
- 두 배 증류수 20 mL를 추가 물, 소용돌이, 그리고 펩 티 드 솔루션에 완전히 용 해 될 때까지 sonicate.
- 솔루션을 동결 하 고 건조까지 lyophilize.
- 펩 티 드 건조 되 면 원유 펩 티 드를 포함 하는 원심 분리기 튜브의 질량을 무게. 5 mg/mL 물에 원유 펩 티 드를 분해.
- 25 밀리 그램 5 mg/mL의 총 농도 만들기 위해 이중 증 류 물 5 mL에에서 원유 MCP-1 펩타이드의 분해. 0.1%와 0.1 %TFA 물 (용 매 A)를 사용 하 여 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 원유 MCP-1 펩타이드 정화 TFA C8 역 상 열에 모바일 단계에로 (용 매 B) 이기에. 여 HPLC로 펩 티 드의 5 mL를 주사.
참고: 초기 모바일 단계 이루어져 100% 용 매 9.0 mL/분의 유량에서 용 매 A 27 분에 30%를 천천히 감소 하 고 3 분 반환 100% 용 매 그라데이션에 대 한이 구성에는 3 분 고 1 분에 게이 구성에 보류 34 분의 총 실행 시간 유지 열 온도 55 ° c. 긍정적인 이온 소스 모드를 사용 하 여 분석에 대 한. 개미의 산 성 TFA HPLC 열에 대 한 너무 산 성 경우 TFA, 대신 사용할 수 있습니다. 유기 용 매 조성 램프 속도 더 나은 분리를 위한 2%/min를 초과 하지 않아야 합니다 것이 좋습니다. - 각 분수 2,890에서 예상된 제품 m/z에 대 한 매트릭스 보조 레이저 탈 착 또는 이온화 (MALDI) 질량 분석을 사용 하 여 분석 합니다.
참고: 매트릭스 솔루션으로 이기/물 (50: 50 vol %)에 1 mg/mL에서 α-cyano-4-hydroxycinnamic 산을 분해. MALDI 격판덮개, 각 분수의 0.75 µ L 뒤에 매트릭스 솔루션의 0.75 µ L 자리. 500-5000 다의 질량 범위에서 긍정적인 반사 이온 모드를 사용 하 여 분석을 실시 합니다. - 결합 제품 분수, 이기, 버릴, 동결 및 건조까지 순화 된 펩 티 드를 lyophilize.
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MCP-1 PA의 준비
- 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] DSPE-말뚝 (2000)-maleimide 별도 섬광 튜브에 펩 티 드를 1.1 어 금 니 과잉을 준비 합니다. 확인을 두 번 증 류 물에 두 화합물을 분해 ~ 15 mg/mL. 15 분 또는 때까지 두 솔루션은 완전히 분명 sonicate.
참고: DSPE 말뚝 (2000)-Cy5 솔루션의 pH 8.5로 조정 된다 DSPE-말뚝 (2000)-아민 및 N-hydroxysuccinimide (NHS) 에스테 르 기능성된 Cy5 단계 1.2.3을 제외 하면 동일한 프로토콜을 사용 하 여 합성 됩니다. - 펩 티 드 솔루션 DSPE 말뚝 (2000)-maleimide 솔루션을 추가 합니다. 소용돌이 sonicate.
- 1 추가 M NaOH dropwise (1 µ L) 솔루션의 pH가 7까지 한 번에.
- 5 분을 위한 질소 제거 솔루션 솔루션 밤새 저 어.
- 솔루션을 동결 하 고 건조까지 lyophilize.
- 원유 제품 건조 되 면 5 mg/mL 물에 고체를 용 해.
- 위에서 설명한 대로 HPLC와 정화.
참고: 결합형된 펩 티 드 및 DSPE-PEG(2000) 해야 elute 사이 15-30% 유기 농도 (vol %), DSPE-나무 못 동안 (2000)-MCP-1 켤레는 40-50% 유기 농도 사이 elute 한다. - 대 한 해당 m/z. DSPE 말뚝 (2000)-MCP-1 5,760 광범위 한 m/z 피크 있어야 MALDI 질량 분석을 사용 하 여 각 분수를 분석 합니다.
참고: 2, 5-dihydroxybenzoic 산은 가장 사용 매트릭스로 DSPE 말뚝 (2000)-MCP-1 MALDI와.
- 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] DSPE-말뚝 (2000)-maleimide 별도 섬광 튜브에 펩 티 드를 1.1 어 금 니 과잉을 준비 합니다. 확인을 두 번 증 류 물에 두 화합물을 분해 ~ 15 mg/mL. 15 분 또는 때까지 두 솔루션은 완전히 분명 sonicate.
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MCP-1 PAMs의 조립
- 1.75 mg 분해 1 드람 유리병에서 3 mL 메탄올을 가진 MCP-1 파. MCP-1 PA 완전히 해산 때까지 sonicate.
참고: Cy5 amphiphiles 이미징 응용 프로그램에 대 한 10:90 MCP-1 PA의 어 금 니 비율에서 통합 될 수 있다. - 균일 한 필름 유리병의 바닥에 형성 될 때까지 유리병의 측면에서 나머지 메탄올을 rinsing 동안 원형 운동에 있는 질소에서 메탄올을 증발. 진공 건조 하룻밤 영화입니다.
- 물 또는 인산 염 버퍼의 3 mL와 함께 영화 화 염의 MCP-1 PAMs 100 µ M 솔루션 (PBS). 부드럽게 소용돌이 클리어까지 솔루션을 sonicate. 30 분 동안 80 ° C에 품 어.
참고: 온도 상승된 자기 집합 프로세스를 가속 화 하기 위해 표시 되었습니다 및 임계 micelle 농도 (CMC)42,43를 줄이면서 가장 안정 된 이차 구조를 형성 하는 펩 티 드 구성 요소 수 있습니다. - 차가운 실내 온도에 결과 분산.
- 1.75 mg 분해 1 드람 유리병에서 3 mL 메탄올을 가진 MCP-1 파. MCP-1 PA 완전히 해산 때까지 sonicate.
2입니다. MCP-1 PAMs의 특성
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동적 산란 (DL) 및 잠재적인 제타
- MCP-1 팸 또는 DL 또는 제타 잠재적인 악기의 지시에 따라 멧에 스크램블된 팸의 장소 100 µ M.
참고: DLS 및 제타 잠재적인 큐 벳 다 수 있습니다 악기의 지침에 따라. - 실내 온도에 악기 equilibrate 크기와 표면 충전 PAM의 측정.
- MCP-1 팸 또는 DL 또는 제타 잠재적인 악기의 지시에 따라 멧에 스크램블된 팸의 장소 100 µ M.
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전송 전자 현미경 (TEM)
- 7 µ L 추가 50 µ M의 MCP-1 팸 또는 TEM grid에 스크램블된 팸 중지 5 분 윅 거리에 대 한 자체 닫는 트위터 내에서 섬세 한 작업 지우기와 방울.
- 그리드를 씻어 물 7 µ L를 추가 합니다. 거리는 물방울 심지.
- 드롭릿에 1 wt %phosphotungstic 산 2 분 윅 거리의 7 µ L를 추가 합니다. 2.2.2 단계를 반복 합니다.
- TEM 분석에 앞서 가장 그리드를 건조.
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원형이 색 성 (CD) 분광학
- 악기의 사용 하기 전에 5-10 분 동안 질소에 설정.
- 멧에 빈 물 (PBS)의 300 µ L를 배치 합니다.
- 190-265 nm, 0.2 m m 경로 길이 1 s 통합 시간 및 실 온에서 1 nm 대역폭 스펙트럼을 측정 합니다. 3 복제를 수집 합니다.
- 측정 100 µ M MCP-1 펩 티 드, MCP-1 팸, 펩 티 드, 발진 하 고 팸 2.3.3 단계에서 설명한 동일한 조건 하에서 발진. 빈에서 뺍니다.
- Polylysine로 스펙트럼의 선형 보간을 사용 하 여 데이터에 맞게.
- 악기를 해제 합니다. 질소를 끄기 전에 10 분을 기다립니다.
3. MCP-1 PAMs의 분석 생체 외에서
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생체 적합성 생체 외에서
- 문화 및 Dulbecco의 수정이 글 중간 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 보충에 WEHI 274.1 murine monocytes 확장 1% 페니실린-스, 그리고 0.05 m m 2-mercaptoethanol 37 ° c 미만 5% CO2 통로 5.
참고: WEHI 274.1 정지 세포 이다입니다. 경작 때 미디어에 2-3 일 마다이 보충 한다. - 살 균 50 mL 원심 분리기 관으로 미디어에 피펫으로 monocytes. 4 ° c.에서 5 분에 대 한 300 x g에서 원심 분리기
- 오래 된 미디어를 발음 하 고 10 mL 신선한 매체에서 원심 분리기 튜브에 resuspend. 세포 미디어에 고르게 배포 됩니다 때까지 천천히 섞는다. Trypan 푸른 얼룩과 hemocytometer를를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.
- 되도록 잘 당 미디어의 90 µ L 당 4000 monocytes 셀을 희석. 96 잘 접시의 우물에 셀의 90 µ L를 추가 합니다. 24 h에 대 한 품 어.
참고: 증발에 차이 접시에 열 변화를 피하기 위해 접시의 외부 가장자리에 우물을 사용 하지 마십시오. 100 µ L PBS로 외부 우물을 채우십시오. - MCP-1 펩 티 드, MCP-1 팸, 스크램블된 펩타이드, 또는 별도, 멸 균 microcentrifuge 튜브에서 150 µ L PBS에 뒤섞여 팸의 0.15 µmol 분해. 1, 10, 및 각 샘플의 100 µ M의 65 µ L을 직렬 희석을 수행 합니다.
- 각 농도의 10 µ L PBS WEHI 274.1 포함 된 우물에 추가 (전체 용량: 잘, 6 라인, 총 96 웰 스 당 100 µ L). 72 h에 품 어.
- 추가 10 µ L (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) (MTS)에 각 잘. 1 시간에 품 어.
- 490에서 플레이트 리더를 사용 하 여 흡 광도 분석 nm 또는 제조업체의 지침에 따라.
- 문화 및 Dulbecco의 수정이 글 중간 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 보충에 WEHI 274.1 murine monocytes 확장 1% 페니실린-스, 그리고 0.05 m m 2-mercaptoethanol 37 ° c 미만 5% CO2 통로 5.
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생체 외에서 micelle 바인딩
- 씨앗 500000 monocytes에 100 µ M Cy5 표시 된 MCP-1 팸 (DSPE-말뚝 (2000)-Cy5 및 MCP-1 PA의 10:90 어 금 니 비율)를 포함 하는 미디어의 2 ml에서 6 잘 플레이트의 각 잘. 1 시간에 품 어.
- 4 ° c.에서 5 분에 대 한 300 x g에서 원심 분리에 의해 WEHI 274.1 수집 미디어 발음
- Resuspend 고 2 mL PBS에에서 세포를 씻어. 4 ° c.에서 5 분에 대 한 300 x g에서 원심 분리기 PBS 발음 2 mL PBS로 세척 프로세스를 반복 합니다. PBS 발음
- 세포를 해결 하기 위해 찬 4 %paraformaldehyde 2 개 mL를 추가 합니다. 10 분 동안 실내 온도에 품 어.
- 피펫으로 멸 균 유리 coverslip 6 잘 플레이트의 우물 내에 고정 된 세포. 5 분에 대 한 400 x g에서 원심.
- paraformaldehyde를 제거 합니다. 세척 하 고 2 mL PBS로 한 번 씻어. 1 mL PB와 함께 resuspend
참고: 때 rinsing는 coverslip에 셀을 방해 하지 마십시오. - 슬라이드에 PBS에 90% 글리세롤의 10 µ L를 넣어. 바늘과 트위터를 사용 하 여는 coverslip 데리 러. 건조는 coverslip의 가장자리. 부드럽게 장소 슬라이드에 coverslip 놓습니다.
- 부드럽게 투명 매니큐어와 coverslip 가장자리 물개. 이미징에 대 한 준비까지 냉장고에 넣습니다.
- Confocal 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM) 레이저와 Cy5 λ여기 에 설치 된를 사용 하 여 = 650 nm.
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Representative Results
MCP-1 팸의 준비
MCP-1 단백질 [YNFTNRKISVQRLASYRRITSSK] 또는 스크램블된 펩 티 드 [YNSLVFRIRNSTQRKYRASIST] CCR2-바인딩 모티브 (잔류물 13-35) N-말단에 시스테인 잔류물을 추가 하 여 수정 되었습니다. MCP-1 펩타이드 자동된 펩타이드 합성기를 사용 하 여 Fmoc 중재 고체 단계 방법에 의해 합성 되었다. 원유 펩 티 드 역 상 HPLC 0.1%를 사용 하 여 50 ° C에서 c 8 열에 의해 순화 되었다 이기/물 혼합물에 있는 TFA MALDI 질량 분석 (그림 1)에 의해 특징. 시스테인-포함 펩 티 드 DSPE-PEG2000-maleimide thioether 연결을 통해 DSPE 말뚝 (2000)-펩타이드 어원이 같은 말을에 활용 했다. 후 실 온에서 24 h, 원유 제품 (그림 2) HPLC에 의해 정화 되었다. DSPE-말뚝 (2000)-Cy5 NHS 에스테 르 반응을 사용 하 여 합성 되었다. 공동 DSPE 말뚝 (2000)-MCP-1 조립 monocyte 타겟팅 PAMs DSPE-말뚝 (2000)-Cy5 다음 N2, 증발 했다 메탄올에 용 해 하 여 조작 했다 고 결과 영화 하룻밤 진공에서 건조 되었고 물 자기 조립 또는 양식에 MCP-1 PAMs "꼬리 그룹"의 소수 성 상호 작용을 통해 PBS.
MCP-1 팸의 특성
DL 데이터 및 monocyte 타겟팅 PAMs의 TEM 이미지 잘 분산, 구형 나노 15.3 ± 2.0 nm의 직경 (그림 3 및 표 1) 보였다. MCP-1 PAMs와 뒤섞여 PAMs 보여 약간의 긍정적인 제타 12.1 ± 3.1 mV 및 13.7 ± 1.9 mV의 잠재력 각각 (표 1). CD는 micelle 내 MCP-1 펩 티 드의 향상 된 보조 구조 보였다 (표 2, MCP-1 PAMs: 46.2 ± 0.9% β-시트, 53.1 ± 1.4% 무작위 코일, 그리고 무료 MCP1: 34.2 ± 3.5% β-시트, 65.8 ± 3.5% 랜덤 코일).
생체 외에서 MCP-1 팸 분석
생체 외에서 생체 적합성 및 monocyte 바인딩은 MCP-1 PAMs confocal 현미경 검사 법에 의해 관찰 되었다. 마우스 monocytes MCP-1, MCP-1 팸, 스크램블된 펩 티 드, 그리고 72 h에 대 한 스크램블된 팸의 농도 증가 함께 알을 품 었 고 실용적이 고 100 µ M (그림 4)까지 생체 세포 발견 했다. 또한, confocal 현미경 검사 법 MCP-1 PAMs 스크램블된 PAMs (그림 5)에 비교 될 때에 monocytes의 특정 바인딩을 보여주었다.
그림 1 : 220에서 HPLC 크로마 (펩 티 드 결합의 파장) 및 254 nm (티로신 파장) MCP-1 펩 티 드 (A)와 스크램블된 펩 티 드 (B) (7.4 분 박스형 피크)의. MCP-1 펩 티 드 (C)와 스크램블된 펩 티 드 (D) 500-5000 다 보여주는 절정 [M + H]+ 에 대 한 m/z 2,888에 (예상된 2,890)의 범위에 MALDI TOF 질량 스펙트럼. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 220에서 HPLC 크로마 (펩 티 드 결합의 파장) 및 254 nm (티로신 파장) DSPE-(2000)-MCP-1 (A)이 고 DSPE-말뚝 (2000)-(B)를 발진. (박스형된 피크 16.9 분)입니다. (C) MALDI TOF 질량 스펙트럼 DSPE 말뚝의 (2000)-MCP-1 1000-10000 다 보여주는 봉우리 [M + H]+ 에 대 한 m/z 2,888에 (예상된 2,890) MCP-1과 m/z 5,758 (예상된 5,760) DSPE-말뚝 (2000)-MCP-1의 범위에서. (D) MALDI TOF 질량 DSPE-말뚝 (2000)의 스펙트럼-1000-10000 다 보여주는 봉우리 [M + H]+ 에 대 한 m/z 2887 스크램블된 펩 티 드에 대 한 (예상된 2,890)와 m/z 5,761 (예상된 5,760)의 범위에서 발진 DSPE 말뚝 발진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : MCP-1 팸 (A)의 TEM 이미지와 뒤섞여 팸 (B). 눈금 막대 = 100 nm. MCP-1 팸 (C)의 수 평균 크기 분포와 뒤섞여 팸 DL (D)를 통해. 데이터는 평균 ± 사 우 스 다코타 (n = 3). (E) MCP-1과 뒤섞여 펩 티 드 및 PAMs의 CD 분석 (n = 3). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : MCP-1 펩 티 드, MCP-1 팸, 스크램블된 펩 티 드, 그리고 스크램블된 PAM.에 72 h 노출 후 WEHI 274.1 murine monocytes의 생체 외에서 생존 데이터는 평균 ± 사 우 스 다코타 (n = 6). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: MCP-1 팸 (A)의 CLSM 이미지와 뒤섞여 팸 (B) 10 mol % Cy5 PA (레드) 통합 incubated WEHI 274.1 1 h. 규모 바와 = 20 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| PAMs | 수 아베 직경 (nm) | PDI | Zeta 잠재력 (mV) |
| MCP-1 | 15.3 ± 2.0 | 0.119 ± 0.006 | 12.1 ± 3.1 |
| 발진 | 16.9 ± 1.4 | 0.232 ± 0.019 | 13.7 ± 1.9 |
| PBS 버퍼에 측정. 데이터는 ± sd. 의미 표현 | |||
표 1: 크기, 증가할수록, 그리고 PAMs의 zeta 잠재력.
| a 나선 (%) | b-시트 (%) | 무작위 코일 (%) | |
| MCP-1 펩 티 드 | 0.0 ± 0.0 | 36.2 ± 2.2 | 63.8 ± 1.8 |
| MCP-1 팸 | 0.7 ± 0.6 | 46.2 ± 0.9 | 53.1 ± 1.4 |
| 스크램블 된 펩 티 드 | 0.0 ± 0.0 | 43.7 ± 2.1 | 56.3 ± 3.5 |
| 스크램블된 팸 | 0.0 ± 0.0 | 60.7 ± 0.2 | 39.3 ± 0.2 |
표 2: 펩 티 드와 PAMs의 이차 구조 구성.
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Discussion
MCP-1 PAMs 친수성 대상 펩 티 드와 소수 성 꼬리는 나노 입자의 자기 조립된 특성을 구성 된 유망 분자 이미징 플랫폼은. 이 monocyte 타겟팅 micelle 간단한 합성 및 (2000)-MCP-1 MCP-1 펩 티 드와 DSPE-못의 정화 단계에 의해 준비 될 수 있습니다. PAMs vivo에서 분자 이미징와 같은 대 한 많은 유익한 특성을가지고 그들의 본질적인 biodegradability, 온화한 조건과 다른 이미징 moieties의 설립을 허용 하는 구조 및 화학 다양성에서 자기 조립 또는 관심의 특정 사이트를 선택적으로 제공 하는 펩 티 드를 대상으로. 그들의 입자 크기, 모양, 및 구성 펩 티 드, 소수 성 꼬리, 또는 micelle 농도, 수 있도록 다양 한 응용 프로그램22,33에 대 한 최적의 화학 및 물리적 특성을 변경 하 여 조정 될 수 있습니다.
이 프로토콜의 몇 가지 한계를 언급 한다. 첫째, PAMs 소수 성 상호 작용에 의해 구동 됩니다, 이후 그것은 친수성, 수 있도록 대상 moiety는 micelle의 표면에 수 여 하는 대상 펩 티 드를 생성 하는 데 필요한. 펩 티 드 순서는 소수, 하나 또는 두 개의 친수성 아미노산의 C terminus에 추가 수용 가능, 하지만 아미노산의 추가 micelle 내의 펩 티 드 이차 구조에 영향을 미칠 수, 그로 인하여의 속성을 변경 합니다 펩 티 드 단백질44,45에서 기본 상태로 내. 둘째, 낮은 농도에서 PAMs 있다 가난한 안정성 수성 환경에서 그들은 매우 CMC, 파46micellar 구조 형성 하기 위해 필요한 최소 농도에 의존. CMC, 아래는 micelle 개별 PA 단위체로 분해 하 고 캐리어로 행동 하 고 특정 사이트47에 마약을 언로 드 하 micelle을 제한 합니다. 이 단점을 완화, CMC는 소수 성 꼬리48,49의 체인 길이 늘려 감소 수 있습니다. 마지막으로, 솔루션에서 PAMs의 장기 저장으로 PA 이차 구조 함으로써 micellar 구조 안정성, 뿐만 아니라 ligand 바인딩26효율성에 영향을 미치는 시간, 변경할 수 있습니다 권장 하지 않습니다.
요컨대,이 프로토콜 이미징 동맥 경화에 대 한 강력 하 고, 자기 조립 펩타이드 nanomedicine micelle 기반 전략을 보여 줍니다. MCP-1 PAMs 있습니다, 생 분해성, 생체 및 비 독성으로 micelle의 구성 요소는 본문 요소 내 생에서 영감을. 더 중요 한 것은, MCP-1 PAMs 우선 바인딩할 monocytes, 패 진행에 비례적으로 증가, 동맥 경 화성 플 라크의 단계를 분화 하는 비-침략 적 접근을 용이 하 게 있다. 이 플랫폼의 모듈화로 인해 PAMs 치료제, 펩 티 드, 이미징 moieties, 및 핵 산을 대상으로 추가 통합할 수 있습니다. 따라서, 이러한 다기능 micelles의 같은 동적 기능을 감안할 때,이 입자 동맥 경화 및 기타 질병에 임상 번역에 대 한 큰 약속을 잡고 우리 생각 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자 남부 캘리포니아 대학, 국가 심 혼, 폐, 혈액 연구소 (NHLBI), R00HL124279, Eli와 Edythe 넓은 혁신 상 수상, 고 L.K. 위 티어 재단 비 암에서 재정 지원을 인정 하 고 싶습니다. 번역 상 연구 상 EJC 부여입니다. 저자 감사는 센터 전자 현미경 및 Microanalysis, NanoBiophysics에 있는 우수의 센터, 분자 특성 분석을 위한 우수의 센터 및 들어가게 이미징 센터에 남부 캘리포니아 대학에 경 음악 설정입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-ethanedithiol | VWR | E0032 | for peptide synthesis |
| 10 mL disposable serological pipets | VWR | 89130-898 | for cell culture |
| 15 mL centrifuge tubes, polypropylene | VWR | 89401-566 | for various applications |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid, 99% | Fisher Scientific | AC165200050 | for MALDI |
| 25 mL disposable serological pipets | VWR | 89130-900 | for cell culture |
| 2-Mercaptoethanol, 50 mM | ThermoFisher Scientific | 31350010 | for cell culture |
| 5 mL disposable serological pipets | VWR | 89130-896 | for cell culture |
| 50 mL centrifuge tubes | VWR | 89039-658 | for various applications |
| 75 cm2 culture flask | Fisher Scientific | 13-680-65 | for cell culture |
| 75 mL reaction vessel | Protein Technologies | 3000005 | for peptide synthesis |
| 96-wells cell culture plate | VWR | 40101-346 | for MTS assay |
| Acetonitrile, HPLC grade | Fisher Scientific | A998SK-4 | for HPLC purification |
| Borosilicate glass, 1 dram | VWR | 66011-041 | for PAM synthesis |
| Borosillicate glass pipet, Long tips | VWR | 14673-043 | for various applications |
| Coverslip, 0.16-0.19 mm, 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-542B | for confocal microscopy |
| Cy5 amine | Abcam | ab146463 | for peptide conjugation |
| Diethyl ether, ACS grade | Fisher Scientific | E138-1 | for peptide precipitation |
| Disposable syringes, 20 mL | Fisher Scientific | 14-817-54 | for HPLC purification |
| Double neubauer ruled hemocytometer | VWR | 63510-13 | for cell counting |
| DSPE-PEG(2000) amine | Avanti | 880128P | for peptide conjugation |
| DSPE-PEG(2000) maleimide | Avanti | 880126P | for peptide conjugation |
| DSPE-PEG(2000)-NHS ester | Nanocs | PG2-DSNS-10K | for conjugation to Cy5 |
| Dulbecco's modified eagle medium-high glucose | Sigma Aldrich | D5796-500ML | for cell culture |
| Fetal bovine serum, qualified, heat inactivated | ThermoFisher Scientific | 10438026 | for cell culture |
| Fmoc-L-Ala-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-A | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-RBF | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-NT | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-CT | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Gln(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-QT | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Ile-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-I | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Leu-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-L | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-KBC | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Phe-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-F | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-SB | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-TB | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-YB | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Val-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-V | for peptide synthesis |
| Fmoc-Lys(Boc)-wang resin, 100-200 mesh | Novabiochem | 856013 | for peptide synthesis |
| Formic acid, optima LC/MS grade | Fisher Scientific | A117-50 | for HPLC purification |
| Glycerol | VWR | M152-1L | for confocal microscopy |
| Hand tally counter | Fisher Scientific | S90189 | for cell counting |
| Magnetic stir bars, egg-shaped | VWR | 58949-006 | for peptide conjugation |
| Methanol, ACS certified | Fisher Scientific | A412-4 | for PAM synthesis |
| MTS cell proliferation colorimetric assay kit | VWR | 10191-104 | for MTS assay |
| N,N-Dimethylformamide, sequencing grade | Fisher Scientific | BP1160-4 | for peptide synthesis |
| N-Methylmorpholine | Protein Technologies | S-1L-NMM | for peptide synthesis |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | AC416780250 | for fixing cells |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010049 | for various applications |
| Penicillin/streptomycin, 10,000 U/mL | ThermoFisher Scientific | 15140122 | for cell culture |
| Peptide synthesis vessel, 25 mL | Fisher Scientific | CG186011 | for peptide synthesis |
| Phosphotungstic acid | Fisher Scientific | A248-25 | for TEM |
| Piperidine | Spectrum | P1146-2.5LTGL | for peptide synthesis |
| Plain glass microscope slide 75 x 25 mm | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for confocal microscopy |
| Reagent reservoirs, sterile | VWR | 95128093 | for cell culture |
| Self-closing tweezer | TedPella | 515 | for TEM |
| TEM support film | TedPella | 01814F | for TEM |
| Trifluoroacetic acid | Fisher Scientific | BP618-500 | for peptide cleavage and HPLC purification |
| Triisopropylsilane | VWR | TCT1533-5ml | for peptide cleavage |
| Trypan blue solution, 0.4% | ThermoFisher Scientific | 15250061 | for cell counting |
| Tweezer, general purpose-serrated | VWR | 231-SA-SE | for confocal microscopy |
| WEHI-274.1 | ATCC | ATCC CRL-1679 | murine monocyte |
| automated benchtop peptide synthesizer | Protein Technologies | PS3 Benchtop Peptide Synthesizer | |
| α- cyano- 4- hydroxycinnamic acid, 99% | Sigma Aldrich | 476870-2G | for MALDI |
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