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Pré conditionnement les voies respiratoires des souris à la bléomycine augmente l’efficacité de la prise de greffe orthotopique Lung Cancer Cell

Published: June 28, 2018 doi: 10.3791/56650
Automatic Translation
*1, *1, 1,2
1Department of Pathology, Yale University School of Medicine, 2Department of Medical Oncology, Yale University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Les auteurs décrivent une méthode pour améliorer significativement la greffe orthotopique de cellules de cancer du poumon dans les poumons murines en préconditionner les voies respiratoires avec des blessures. Cette approche peut également être appliquée pour étudier les interactions stroma dans le microenvironnement de poumon, la diffusion métastatique, la comorbidité de cancer du poumon, et pour produire plus efficacement les patients issus des xénogreffes.

Abstract

Cancer du poumon est une maladie réfractaire de traitement mortelle qui est biologiquement hétérogène. Pour comprendre et traiter efficacement le spectre clinique complète de malignités thoraciques, des modèles animaux supplémentaires qui peuvent récapituler les étapes et les sous-types de cancer de poumon humain diverses sont nécessaires. Une allogreffe ou xénogreffe modèles sont polyvalents et permettent la quantification des capacité tumorigènes in vivo, en utilisant des cellules malignes d’origine murine ou humaine. Cependant, les méthodes décrites précédemment de greffe de cellule pour le cancer du poumon ont été effectuées dans des sites non physiologiques, tels que le flanc de la souris, en raison de l’inefficacité de l’orthotopic transplantation de cellules dans les poumons. Dans cette étude, nous décrivons une méthode pour améliorer la prise de greffe orthotopique lung cancer cell en préconditionner les voies respiratoires des souris avec la bléomycine agent inducteur de la fibrose. Comme une expérience de validation, nous avons appliqué cette approche pour greffer des cellules tumorales du sous-type adénocarcinome pulmonaire, provenant de souris ou de sources humaines, dans diverses souches de souris. Nous démontrons que blessant les voies respiratoires à la bléomycine avant l’injection de cellules de tumeur augmente la prise de greffe de cellules tumorales de 0 à 17 % de 71 à 100 %. Significativement, cette méthode améliorée incidence des tumeurs pulmonaires et une excroissance ultérieure à l’aide de différents modèles et les souches de souris. En outre, les cellules cancéreuses du poumon implantée diffusent des poumons dans des organes éloignés. Ainsi, nous fournissons un protocole qui peut être utilisé pour établir et maintenir de nouveaux modèles orthotopique du cancer du poumon avec la limitation des quantités de cellules ou recueillis et à évaluer de façon quantitative la capacité tumorigène des cellules cancéreuses du poumon dans les paramètres physiologiquement pertinents .

Introduction

Cancer du poumon est la principale cause de cancer liée décès dans le monde1. Patients atteints de cancer du poumon a finit par succombent de métastases à des organes éloignés, notamment pour le système nerveux central, foie, glandes surrénales et OS2,3,4. Tumeurs thoraciques ont été traditionnellement classées comme le cancer du poumon à petites cellules (CPPC) ou non-small cell lung cancer (NSCLC)5. NSCLC est le plus fréquemment diagnostiqué une tumeur maligne et peuvent être subdivisés en différents sous-types histologiques, y compris l’adénocarcinome pulmonaire (LUAD) et poumon épidermoïde (ULEMC)6. L’analyse génomique des cancers du poumon primaires humaines réséqués a révélé que les tumeurs au sein d’un histotype donné peuvent également exprimer diverses perturbations moléculaires, outre contribuant à leur progression clinique divergente et déconcertants pronostic patient. L’hétérogénéité remarquable des cancers du poumon représente un défi important à la conception rationnelle, les essais précliniques et mise en œuvre de stratégies thérapeutiques efficaces. Par conséquent, il y a lieu d’élargir le répertoire des modèles de cancer du poumon expérimental tractable pour étudier les diverses origines cellulaires et moléculaires sous-types stades de cette maladie.

Diverses approches à l’aide de modèles animaux ont été utilisés pour étudier lung cancer in vivo, chacun avec leurs propres avantages et inconvénients selon l’ou les questions d’intérêt biologiques. Modèles de souris génétiquement modifiées (edged) peuvent cibler des altérations génétiques spécifiques à un type de cellules progénitrices donnée, résultant dans les tumeurs que les progrès dans un hôte immunocompétent7. Bien qu’extrêmement puissant et cliniquement pertinents, la morbidité de tumeur de latence, variabilité, et/ou du poumon associée à Gregory peut être prohibitif pour certaines des mesures quantitatives et la détection des métastases de stade tardif dans des organes éloignés,8. Une approche complémentaire est l’utilisation de modèles d’allogreffe, par lequel cellules de cancer pulmonaire, obtenue directement auprès d’une tumeur de souris ou de dérivés d’abord comme les lignées cellulaires établies dans la culture, sont réintroduites en hôtes syngéniques. Par analogie, xénogreffes de cancer du poumon sont établies à partir des lignées cellulaires humaines ou des échantillons de patient tumeur dérivée. Xénogreffes de ligne de cellules humaines ou patients xénogreffes dérivés (PDXs) sont généralement conservées dans des souris immunodéprimées et interdit donc de surveillance immunitaire complète9. Malgré cet inconvénient, ils fournissent une avenue pour propager la limitation des quantités d’humains échantillons biologiques et l’étude fondamentale en vivo propriétés des cellules cancéreuses humaines, qui codent pour des aberrations génomiques plus complexes que les tumeurs GEMM.

Une propriété utile des allogreffes et xénogreffes, c’est qu’ils sont prêtent à des traditionnels essais de dilution cellules limitant, utilisés pour quantifier la fréquence de tumeur initiant des cellules (TICs) au sein d’une population de cellules malignes10. Dans ces expériences, un nombre défini de cellules est injecté par voie sous-cutanée dans le flanc des animaux et la fréquence des TICs peut être estimée selon le taux d’abonnement de tumeur. Tumeurs sous-cutanées cependant peuvent être plus hypoxique11 et ne peuvent pas modéliser principales contraintes physiologiques du microenvironnement tumoral de poumon. Livraison par voie intratrachéale de souches épithéliales ou cellules progénitrices dans les poumons des souris est une méthode pour étudier la régénération pulmonaire et bronchique stem cell biology12. Toutefois, le taux de prise de greffe de cette technique peut être relativement faible, à moins que les poumons sont d’abord soumis à des formes physiologiques de blessure, comme une infection virale13,14. Soutien de cellules stromales inflammatoires et/ou la rupture de la membrane basale de poumon peut améliorer la rétention des cellules transplantées dans les niches des cellules souches dans les voies respiratoires distales15. Fibrose induisant des agents peut également pré-conditionner les poumons afin d’améliorer la prise de greffe de cellules pluripotentes induites16 des cellules souches mésenchymateuses17. Si des formes similaires de lésion des voies aériennes peuvent influer sur le taux de prise de greffe, capacité initiatrice de la tumeur et la croissance des cellules cancéreuses du poumon doit encore être systématiquement évalués.

Dans cette étude, nous décrivons une méthode pour accroître l’efficacité de l’orthotopic lung cancer cellule prise de greffe, de préconditionner les poumons des souris atteintes de blessures. LUAD apparaît dans les voies aériennes distales avec un sous-ensemble important de ces cancers développant un stroma fibreux18 souvent corrélé avec le pronostic19. Bléomycine, un naturel synthases hybrides peptide-polykétide, a été largement utilisée pour induire une fibrose pulmonaire dans la souris20. L’instillation des voies aériennes de bléomycine favorise tout d’abord épithéliale attrition dans les alvéoles et le recrutement des cellules inflammatoires, y compris les macrophages, les neutrophiles et les monocytes21. Elle est suivie de tissu transformant en voies respiratoires distales, membrane basale réorganisation22,23 et matrice extracellulaire (ECM) dépôts24. Les effets d’une injection de bléomycine unique sont transitoires, fibro-résoudre après 30 jours dans la plupart des études25. À l’aide de modèles des allogreffes et xénogreffes, nous avons testé si préconditionner les voies respiratoires des souris à la bléomycine pourrait augmenter significativement le taux de cellules LUAD dans les poumons.

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Protocol

Toutes les expériences ont été effectuées conformément aux protocoles approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) à l’Université Yale.

1. mise en place / préparation des réactifs.

  1. Bléomycine
    ATTENTION : Basé sur le système général harmonisé (SGH) de Classification et d’étiquetage des produits chimiques, la bléomycine est classée comme un danger pour la santé GHS08.
    1. Préparer la bléomycine sous une hotte chimique. Resuspendre 15 U dans 5 mL de solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS).
    2. Aliquote 100-200 µL de la solution en verre flacons et congeler à-20 ° C pour une utilisation future. Bien étiqueter les tubes avec la date de la remise en suspension. Utiliser dans les 6 mois à compter de cette date.
      Remarque : Chaque souche de souris a une sensibilité différente à la bléomycine26. Tests de différentes doses de bléomycine pour chaque souche de souris sont recommandés. Les souches de souris et les doses correspondantes de la bléomycine utilisés dans des expériences représentatives sont énumérés au tableau 1.
  2. Souris
    1. Acheter souris nécessaires pour l’expérimentation et autoriser les souris 7 jours pour s’acclimater avant l’injection. Effectuer des perfusions sous une hotte de sécurité biologique. Transférer les animaux hébergés dans une chambre conforme non-BSL2 à une salle BSL2 selon le processus institutionnels normal avant la perfusion de la bléomycine. Injecter des souris à 6-8 semaines d’âge.
      ATTENTION : Injecter des souris à la suite des lignes directrices pour les agents dangereux, le niveau de biosécurité 2 (BSL2) et approbation IACUC.
      Remarque : La souris achetés pour les expériences représentatives sont répertoriés dans la Table des matières. Seules les souris mâles ont été utilisés.
  3. Lignées cellulaires de Cancer du poumon
    1. Lignées de cellules de culture souhaitée dans leurs médias respectifs. Avant les injections, effectuer le profilage d’ADN répété en tandem courtes ou de tests génétiques afin d’assurer l’identification de la ligne cellulaire appropriée. Pour faciliter l’in vivo et ex vivo imagerie, infecter les lignées cellulaires avec un lentivirus exprimant la thymidine kinase, la protéine fluorescente verte (GFP) et la luciférase fusion journaliste27et trier les cellules positives journaliste par fluorescence activé la cellule triant (FACS) avant la greffe. Tester les lignes pour le mycoplasma tous les 6 mois.
      1. La culture de lignée de cellules cancéreuses humaines L2030 tel que recommandé par le fabricant à l’aide de support de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) avec 10 % de sérum fœtal (SVF), la pénicilline-streptomycine et amphotéricine b.
      2. Culture 368T1 lignée murine (dérivée de souris KrasG12D; p53- / - ) à l’aide de support de l’aigle de la modification de Dulbecco (DMEM) avec 10 % FBS, pénicilline-streptomycine et amphotéricine b.
      3. La culture de lignée de cellules cancéreuses humaines PC9 avec 10 % RPMI FBS, pénicilline-streptomycine et amphotéricine b.

2. traitement à la bléomycine

  1. Plan d’injecter par voie intratrachéale de souris à la bléomycine 14 jours avant la greffe de cellules tumorales.
  2. Décongeler le stock de bléomycine sur glace 2 h avant l’injection.
  3. Une fois décongelé, diluer la bléomycine, de la concentration de travail désirée (0,02 U/50 µL ou 0,005 U/50 µL) et gardez-le sur glace.
    Remarque : Concentration de la bléomycine dépend de la souche de souris utilisée pour les expériences (tableau 1). Titrage de la bléomycine chez les souris devrait être effectuée pour déterminer la dose optimale.
  4. Préparer l’anesthésie en diluant la kétamine et xylazine à une concentration finale de 10 mg/mL et 1 mg/mL, respectivement, à l’aide d’une aiguille de seringue et 27 G de 1 mL, anesthésier chaque souris en injectant par voie intrapéritonéale kétamine/xylazine solution à 100/10 mg/kg respectivement.
  5. Surveiller la respiration de souris et emploient une pincée d’orteil. Confirmer anesthetization appropriée lorsque la souris ne répond pas à l’orteil pincée. Pommade de vétérinaire sur les yeux pour prévenir le dessèchement tandis que sous anesthésie.
  6. Placer 1 souris à la fois sur une plate-forme d’intubation par pendaison ses dents de devant avec le dos contre la plate-forme.
  7. Éclairer la partie supérieure du thorax à l’aide d’un illuminateur fibre optique pour aider à la visualisation de la trachée. Ouvrir la bouche de la souris et tirez doucement la langue avec une pince plate stérile.
  8. Utiliser un cathéter intraveineux sans l’aiguille pour éviter de bloquer la respiration. Position du cathéter sur la lumière blanche émise par l’ouverture de la trachée.
  9. Insérer le cathéter dans la trachée jusqu'à ce que le dessus du cathéter atteigne les dents de devant. Confirmer le positionnement correct de la sonde dans la trachée en visualisant la lumière blanche qui brille à travers l’ouverture du cathéter dans la bouche.
  10. À l’aide d’une pipette, administrer 50 µL de bléomycine ou véhicule (PBS) directement dans le cathéter pour s’assurer que la totalité du volume est inhalé. Effectuez cette étape dans des conditions stériles.
  11. Si le cathéter est inséré correctement, la souris inhalera immédiatement le contenu du cathéter. Attendez quelques secondes jusqu'à ce que la totalité du volume se déplace le long du cathéter. Puis retirer le cathéter de la trachée et disposer dans une solution 10 % eau de Javel.
    Remarque : La durée moyenne par souris d’étapes 2.7-2.11 est environ 5 min.
  12. Si la souris n’est pas inhalant le liquide, soigneusement surveiller la respiration et ajuster la position du cathéter. Si la souris s’arrête de respirer, retirer le cathéter immédiatement et laisser la souris pour reprendre à respirer normalement avant de ré-insérer le cathéter.
  13. Placez votre souris injectée sur un coussin de chauffage agréé IACUC sur le dos sur une surface plane pour la récupération. Toute la procédure prendra 10 min par la souris. Ne retournez pas un animal qui a subi une injection à la compagnie des autres animaux jusqu'à ce que complètement guéri.
  14. Placer une carte « Chimiques dangereux in Use » sur la cage pendant 24 h.

3. suivi de souris après Intubation

  1. Surveiller les souris pour détresse respiratoire immédiatement après intubation et puis toutes les 15 min jusqu'à ce que la souris se réveillent de l’anesthésie. N’abandonnez pas souris jusqu'à ce qu’ils ont repris connaissance suffisante pour maintenir le décubitus sternal.
  2. Injecter le kétoprofène (5 mg/kg) par voie intrapéritonéale pour soulager la douleur.
  3. Examiner la souris 24h après l’intubation et 3 fois par semaine pour déceler tout signe de morbidité.
  4. Tenir un registre de la date de la procédure, l’identification des animaux, type d’intervention, type d’observations surveillance anesthésiques et post-opératoire avec fois.
  5. Surveiller les souris pour perdre du poids, détresse respiratoire, anomalies comportementales et un état corporel < 2 (segmentation de la colonne vertébrale des os pelviens évident/dorsales sont palpables) toutes les deux semaines après l’injection de bléomycine.
  6. Euthanasier la souris dans une détresse respiratoire ou des souris qui ont connu la perte de 15 % de la masse corporelle de CO2 ou de la kétamine/xylazine suivie par dislocation cervicale. Confirmer l’euthanasie en effectuant la palpation pour l’activité respiratoire.

4. prise de greffe des lignées de cellules Adénocarcinome pulmonaire.

Remarque : Effectuez la greffe de cellules 14 jours après l’injection de bléomycine (étape 2.1).

  1. Permettre aux cellules de croître dans des flacons de2 75 cm non perturbé pendant 3 jours avant le jour de l’injection avec les correspondants des médias comme indiqué dans l’étape 1.3.
    NOTE : Ils devraient être 80 % anastomosé au jour de l’injection (ce qui correspond à 2-3 x 106 dans chaque fiole selon la lignée cellulaire).
  2. Laver les cellules qui croissent sur les flacons de2 75 cm avec 5 mL de PBS à température ambiante.
  3. Aspirer les PBS et ajouter 1,5 mL de trypsine aux cellules et incuber les cellules à 37 ° C jusqu'à ce que les cellules détachement (généralement 2 à 5 min).
    Remarque : Nous recommandons de vérifier toutes les 2 min pour le détachement des cellules de la matière plastique par la simple visualisation du fond de la fiole ou sous un microscope optique. Ne dépassez pas 5 min d’incubation avec de la trypsine.
  4. Neutraliser la trypsine en ajoutant 4 mL de support contenant 10 % SVF (mêmes médias comme étape 4.1). Prélever les cellules dans un tube de 15 mL et il centrifuger à 200 x g pendant 3 min à température ambiante.
  5. Aspirer les médias et Resuspendre le culot dans 5 mL de PBS pour laver les cellules. Centrifuger les cellules à 200 x g pendant 3 min à température ambiante pour granuler des cellules. Répétez ce 1 fois.
  6. Aspirer le PBS et Resuspendre le culot dans 1,5 mL de PBS par flacon.
  7. Mélanger 50 µL du mélange de cellule avec 50 µL de bleu trypan et compter les cellules à l’aide d’une cellule Counter/hémocytomètre chambre28.
  8. Préparer la suspension cellulaire en diluant les cellules dans du PBS 1 x 105 cellules (ou tout autre montant indiqué) d’injecter dans 50 µL par souris. Garder les cellules sur la glace avant l’injection.
    Remarque : Se préparer au moins deux fois plus de cellules pour injection éviter de manquer de suspension cellulaire.
  9. Préparer l’anesthésie en diluant la kétamine et xylazine à une concentration finale de 10 mg/mL et 1 mg/mL, respectivement, à l’aide d’une aiguille de seringue et 27 G de 1 mL, anesthésier chaque souris en injectant par voie intrapéritonéale kétamine/xylazine solution à 100/10 mg/kg respectivement.
  10. Surveiller la respiration de souris et emploient une pincée d’orteil. Confirmer anesthetization appropriée lorsque la souris ne répond pas à l’orteil pincée. Pommade de vétérinaire sur les yeux pour prévenir le dessèchement tandis que sous anesthésie.
  11. Placer 1 souris à la fois sur une plate-forme d’intubation par pendaison ses dents de devant avec le dos contre la plate-forme.
  12. Éclairer la partie supérieure du thorax à l’aide d’un illuminateur fibre optique pour aider à la visualisation de la trachée.
  13. Remettre en suspension les cellules doucement à l’aide d’une pipette de p200 pour s’assurer qu’ils ne forment pas de touffes. Ouvrir la bouche de la souris et tirez doucement la langue avec une pince plate stérile.
  14. Utiliser un cathéter intraveineux avec l’aiguille retirée pour éviter de bloquer la respiration. Position du cathéter sur la lumière blanche émise par l’ouverture de la trachée.
  15. Insérer le cathéter dans la trachée jusqu'à ce que le dessus du cathéter atteigne les dents de devant. Confirmer le positionnement correct de la sonde dans la trachée en visualisant la lumière blanche qui brille à travers l’ouverture du cathéter dans la bouche.
  16. À l’aide d’une pipette, administrer 50 µL de cellules directement dans le cathéter pour s’assurer que la totalité du volume est inhalé. Effectuez cette étape dans des conditions stériles.
    Remarque : Si le cathéter est inséré correctement, la souris inhalera immédiatement le contenu du cathéter.
  17. Attendez quelques secondes jusqu'à ce que la totalité du volume se déplace le long du cathéter, puis retirer le cathéter de la trachée et disposer dans une solution 10 % eau de Javel.
  18. Si la souris n’est pas inhalant le liquide, soigneusement surveiller la respiration et ajuster la position du cathéter. Si la souris s’arrête de respirer, retirer le cathéter immédiatement et laisser la souris pour reprendre à respirer normalement avant de ré-insérer le cathéter.
    Remarque : La durée moyenne par souris d’étapes 4.11-4.18 est environ 5 min.
  19. Placez votre souris injectée sur un coussin de chauffage agréé IACUC sur le dos sur une surface plane pour la récupération.
    Remarque : Toute la procédure prendra 10 min par la souris. Ne retournez pas un animal qui a subi une injection à la compagnie des autres animaux jusqu'à ce que complètement guéri.
  20. Raser la zone de totalité des côtes sur le ventre et sur le dos de B6129SF1/J et d’autres souches de souris aux cheveux noirs en utilisant un rasoir électrique avant l’imagerie.
  21. 2-3 min après l’injection de cellules, injecter 100 µL de luciférine rétro-orbitalement (15 mg/mL) à l’aide d’une aiguille de l’insuline. Remplaçant l’oeil utilisé pour l’injection chaque séance d’imagerie.
  22. Après au moins 2 min, placer jusqu'à 5 souris dans un imageur de bioluminescence animale en position de décubitus dorsal et acquérir une image ventrale à l’aide de paramètres de luminescence29.
  23. Sous le panneau de contrôle, régler les paramètres de résolution et sensibilité pour mesurer la luminescence d’une lignée cellulaire donné. Pour la plupart des applications, commencez avec 3 min (ou « Auto » si saturé), binning = moyen (4), F/Stop = 1, champ de vue = D, sujet hauteur = 1.50.
    Remarque : Si l’injection est réussie, signal de la luminescence est détecté dans la zone de la partie supérieure du thorax, dans un seul poumon ou les deux poumons.
  24. Retourner la souris sur la position de décubitus sternal et acquérir une image dorsale comme indiqué ci-dessus.
    NOTE : Si l’injection de cellules n’est pas effectuée correctement, cellules peuvent regrouper à l’entrée de la trachée ou dans le cou.
  25. Injecter le kétoprofène 5 mg/kg par voie intrapéritonéale pour soulager la douleur.
  26. Replacer les souris dans leur cage et placer une carte « BSL-2 Agent in Use » sur la cage.
  27. Surveiller les souris pour détresse respiratoire immédiatement après intubation et puis toutes les 15 min jusqu'à ce que la souris se réveillent de l’anesthésie. N’abandonnez pas souris jusqu'à ce qu’ils ont repris connaissance suffisante pour maintenir le décubitus sternal.
  28. Examiner la souris 24h après l’intubation et trois fois par semaine pour déceler tout signe de morbidité.
  29. Conserver l’enregistrement dans le journal de bord de la date de la procédure, l’identification des animaux, type de procédure, le type d’observations surveillance anesthésiques et post-opératoire et fois.
  30. Surveiller les souris pour perdre du poids, détresse respiratoire, anomalies comportementales et un état corporel < 2 (segmentation de la colonne vertébrale des os pelviens évident/dorsales sont palpables) toutes les deux semaines suivant l’inoculation de la bléomycine.
    NOTE : Les souris atteintes de tumeurs pulmonaires peuvent présenter irritation des voies respiratoires, amaigrissement, cachexie, et/ou la mort.
  31. Euthanasier la souris dans une détresse respiratoire ou des souris qui ont connu la perte de 15 % de la masse corporelle par le CO2 ou de la kétamine/xylazine suivie par dislocation cervicale si recueillir des tissus. Confirmer l’euthanasie en effectuant la palpation pour l’activité respiratoire.

5. surveillance de la croissance tumorale par Bioluminescence Imaging

  1. Répétez l’imagerie des souris au greffe après jour 3 et toutes les semaines par la suite.
  2. Anesthésier les souris par l’injection de kétamine/xylazine (comme décrit aux étapes 2,4-2,5) ou par inhalation isoflurane (2 %). Surveiller la respiration de souris et emploient une pincée d’orteil pour confirmer la bonne anesthetization. Pommade de vétérinaire sur les yeux pour prévenir le dessèchement tandis que sous anesthésie.
  3. Raser la zone de totalité des côtes sur le ventre et sur le dos de B6129SF1/J et d’autres souches de souris aux cheveux noirs en utilisant un rasoir électrique avant l’imagerie.
  4. Une fois que les souris sont sous anesthésie, injecter 100 µL de luciférine rétro-orbitalement (15 mg/mL) à l’aide d’une aiguille de l’insuline. Attendez 2 min. remplaçant l’oeil utilisé pour l’injection chaque séance d’imagerie.
  5. Placez la souris dans l’imageur et acquisition d’images dorsales et ventrales comme indiqué aux paragraphes 4.22-4.24.
  6. Placez les souris dans la cage après imagerie, sur le dos sur une surface plane pour la récupération.
    Remarque : Toute la procédure prendra 5 min par groupe de 5 souris. N’abandonnez pas souris jusqu'à ce qu’ils ont repris connaissance suffisante pour maintenir le décubitus sternal.
  7. Analyser les images en utilisant le logiciel d’analyse imageur/bioluminescence.
    1. Sélectionnez les images appropriées et de les charger en tant que groupe dans le logiciel d’analyse de bioluminescence.
    2. Cliquez sur outil ROI | Place pour ajouter une zone carrée d’intérêt (ROI). Placez le retour sur investissement sur la zone de la partie supérieure du thorax, couvrant l’image de l’ensemble du poumon. Répétez cette opération pour chaque image de la souris.
    3. Faites un clic droit et sélectionnez copier tous ROI function pour appliquer le même ROI à toutes les images dans le groupe et leur position dans le haut du thorax des souris, vues ventrales et dorsales.
    4. Dans le coin supérieur gauche de la fenêtre d’image, sélectionnez la fonction de Photons . Cliquez sur la fonction de panneau de contrôle de mesure pour mesurer la ROIs. Copiez et collez la table de sortie contenant le flux total (photons/s) dans un logiciel de choix pour analyser les données plus loin.
    5. Normaliser la valeur quotidienne de retour sur investissement de chaque souris à sa valeur de retour sur investissement mesuré au jour 0.

6. tissu isolement et traitement.

  1. Anesthésier les souris par l’injection de kétamine/xylazine (comme décrit aux points 2.4-2.5 ou par inhalation isoflurane (2 %). Surveiller la respiration de souris et emploient une pincée d’orteil. Confirmer anesthetization appropriée lorsque la souris ne répond pas à l’orteil pincée. Pommade de vétérinaire sur les yeux pour prévenir le dessèchement tandis que sous anesthésie.
  2. Injecter 100 µL de luciférine rétro-orbitalement (15 mg/mL) à l’aide d’une aiguille de l’insuline. Attendez 2 min.
  3. Souris image après étapes 4.22-4.24 du présent protocole.
  4. Injecter dans l’autre oeil de l’étape 6.2 un autre 100 µL de luciférine rétro-orbitalement à l’aide d’une aiguille à insuline avant l’euthanasie.
  5. Euthanasier les souris par injection intrapéritonéale de kétamine/xylazine (voir étape 2,4 pour plus de détails) suivie de dislocation cervicale si les souris sont sous anesthésie profonde conformément aux directives fournies par IACUC. Confirmer l’euthanasie en effectuant la palpation pour l’activité respiratoire.
  6. À l’aide de ciseaux chirurgicaux stériles, faire une incision de la peau sous le sternum. Ouvrez la couche musculaire le long de la membrane à l’aide de pinces et ciseaux chirurgicaux et exposer la cavité thoracique par une coupe à travers la cage thoracique sur un des côtés latérale évitant les artères thoraciques internes.
  7. Perfuse la souris en faisant une petite incision dans l’oreillette droite du cœur et injecter 5 mL de PBS dans le ventricule gauche. La couleur du tissu pulmonaire vont du rouge au blanc-rose pâle si la perfusion sanguine est faite correctement.
  8. Exciser les poumons de la cavité thoracique soigneusement en saisissant l’oesophage ou coeur avec une pince. Tirer le tissu délicatement et utiliser des ciseaux chirurgicaux pour couper avec soin le tissu social, en évitant la ponction du tissu pulmonaire. La trachée préserver autant que possible de l’inflation des voies aériennes du poumon à une étape ultérieure.
  9. Laver le poumon en immergeant et agitant le tissu 3 fois dans une plaque 6 puits remplis de 3 mL de PBS pour enlever le sang excédentaire.
  10. Placer les poumons sur le couvercle d’une plaque 6 puits et placez le couvercle contenant le tissu de l’imageur bioluminescente et acquérir une image luminescents30.
    NOTE : Nous recommandons les paramètres suivants dans le panneau « Acquisition » « champ de vision = A » et « hauteur de l’objet = 0,75 cm » et puis l’exposition « automatique » pour éviter d’être saturés d’images.
  11. D’accise et des autres organes, l’image comme fait à l’étape 6,9-6.10, où les métastases ont été identifiés par la luminescence, tels que le cerveau, foie, surrénales, osseuse, ganglions lymphatiques, reins ou la rate31.
  12. Perfuse le poumon avec 1 mL de paraformaldéhyde à 4 % en insérant l’aiguille dans la trachée de la souris. Les poumons seront gonfle si bien irrigués.
    ATTENTION : 4 % paraformaldéhyde est un toxique, une santé GHS07 des risques GHS08.
  13. Transférer les poumons dans un 15 mL conique avec 5 mL de paraformaldéhyde à 4 %.
  14. Difficulté les poumons ou autres tissus en incubant le tissu avec du paraformaldéhyde 4 % pendant la nuit à 4 ° C dans un dispositif d’agitation à 30-50 tr/min.
  15. Incorporer des poumons (ou autres tissus) dans la paraffine ou de la température de coupe optimale composée selon l' application32.
    NOTE : La paraffine est la méthode préférée pour préserver la structure du poumon et de Trichrome de Masson et coloration hématoxyline-éosine.

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Representative Results

Pour augmenter l’efficacité de la greffe de cellules de cancer LUAD dans les poumons des souris, nous avons développé un protocole qui tout d’abord les conditions préalablement les voies respiratoires à l’aide de bléomycine suivie d’injection de cellules de tumeur orthotopique (Figure 1). Nous avons confirmé que même lorsqu’il est administré à des souris athymiques immunodéprimés, bléomycine transitoire fibrose induite par jour 14 comme en témoigne la perte de l’architecture des voies respiratoires et le dépôt de collagène accrue (Figure 2). La fibrose brute chez ces souris résolu 50 jours après l’injection de bléomycine (Figure 2; panneaux droite) compatible avec les études antérieures,24.

Se fondant sur ces observations, nous avons implanté cellules LUAD d’origines différentes dans les poumons de différentes souches de souris qui avaient été préalablement conditionnées avec une dose unique de véhicule ou de la bléomycine 14 jours avant. Par exemple, une suspension de cellules LUAD l’établie humaine LUAD lignée cellulaire, L2030, a été livrée par voie intratrachéale dans les poumons des souris athymiques. Après 35 jours, souris prétraitées avec la bléomycine avaient charge de tumeur pulmonaire élevé tel que détecté par bioluminescence (Figure 3 a). À l’inverse, chez les animaux traités véhicule, aucune tumeur ont été détectées durant la même période (Figure 3 a). Charge de tumeur pulmonaire a été confirmée par l’histologie après autopsie. Poumons prétraités avec véhicule n’avaient aucune preuve des nodules de tumeur alors que les poumons pré-traité bléomycine avaient des nodules de grande tumeur (Figure 3 b). Utilisant ce protocole, nous avons aussi augmenté la prise de la greffe d’une autre lignée de cellules humaine LUAD dans des souris athymiques (PC9 ; La figure 3) et une lignée de cellules murine LUAD qui a été injectée dans syngéniques souris immunocompétentes de B6129SF1/J (Figure 3D). Les lésions précoces observées chez les souris syngénique pré-traité bléomycine étaient principalement de grade 1 et 2 et ont été bien différenciées, ressemblant à des tumeurs in situ de KrasG12D / +; p53- / - Edged33. Tous risque implantée a grandi dans le poumon proximal et distal (Figure 3 b, 3E de la Figure, la Figure 3; star (distale), d’astérisque (proximale)). La mise en place de PDXs d’échantillons biologiques le cancer du poumon (à partir de biopsies ou résection chirurgicale) est relativement inefficace, même lorsque les cellules humaines sont transplantées par voie sous-cutanée de sévèrement immunodéprimés animaux tel que le gamma NOD scid (NSG) souris de souche34. Afin d’évaluer l’application potentielle de notre méthode à PDXs, nous a également injecté une sous-population de cellules fortement métastatiques de la lignée cellulaire L2030, appelée L2030-BrM3 cellules35, par voie intratrachéale chez les souris NSG qui avait été traitée avec du véhicule ou bléomycine. Nous constatons que les souris NSG peuvent être plus sensibles aux effets toxiques de la bléomycine (données non présentées), et qu’une dose inférieure à 0,02 unités par souris est conseillée lorsque vous travaillez avec cette souche. Néanmoins, notre protocole aussi significativement augmenté la prise de greffe et le fardeau de la tumeur dans les poumons des souris NSG (Figure 3F, Figure 3).

Ensuite, nous avons utilisé ce protocole pour tester le taux de prise de greffe de limiter les quantités de cellules à l’aide de la lignée cellulaire L2030 dans des souris athymiques. Souris, préalablement traités par la bléomycine ont été injectés avec 5 x 10,5, 5 x 10,4ou 5 x 103 L2030 cellules. 85,7 100-% des souris développé des tumeurs pulmonaires entre 7 et 10 semaines à toutes les dilutions testées (tableau 2). Nous concluons cette greffe d’un relativement faible nombre de cellules tumorales dans le poumon est possible si les souris sont pré-conditionnés à la bléomycine. Dans l’ensemble, notre protocole pourrait s’adapte à plusieurs souches de souris et de divers modèles de la ligne LUAD cellule pour augmenter le taux de prise de greffe de cellules cancéreuses dans les poumons de 0-16,7 % à 71,4-100 % (tableau 2).

Enfin, pour évaluer la cinétique putative de l’excroissance cellulaire LUAD et dissémination métastatique des poumons pré-conditionnés bléomycine, nous avons caractérisé le comportement de fortement métastatiques L2030-BrM3 cellules, en utilisant notre protocole. Après la prise de greffe orthotopique chez les souris traitées à véhicule, attrition de cellules de tumeur a été observée par bioluminescence au 3e jour après l’injection et la croissance des tumeurs du poumon n’a pas pu être détectée par la suite ou au point de terminaison (jour 35) (Figure 4 a, Figure 4 b). À l’inverse, nous avons détecté l’excroissance des tumeurs pulmonaires chez des souris préalablement traités par la bléomycine, dès après l’injection jour 7 (Figure 4 a). Après 39-57 jours d’expansion de la tumeur, la morbidité et l’intensité bioluminescente associés avec des limites de charge tumeur pulmonaire élevé l’analyse de maladie disséminée (données non présentées). Donc, nous avons photographié métastase dans des organes éloignés ex vivo à l’autopsie. Chez les animaux ayant une charge de tumeur pulmonaire à 57 jours, petites lésions pourraient également être détectées dans des tissus comme le cerveau, foie, reins, glandes surrénales et membres postérieurs osseuse à fréquences variables (Figure 4). Par conséquent, nous concluons que spontanée disséminée dans les sites cliniquement pertinents peut être générée par cette méthode orthotopique.

Figure 1
Figure 1 : méthode pour pré-conditionner les poumons pour greffe de cellules tumorales. Schéma du protocole utilisé. Lésion pulmonaire est réalisée en injectant par voie intratrachéale de bléomycine. Les cellules LUAD sont ensuite injectées dans la trachée des souris 14 jours après. Souris sont imagés par la suite chaque semaine pour la luminescence à moniteur tumeur prise de greffe, de croissance et de métastases à distance. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : la bléomycine provoque la fibrose pulmonaire transitoire et le remodelage de la ECM. Des images représentatives de l’hématoxyline-éosine (H & E) et coloration Trichrome de Masson de poumons de véhicule et la bléomycine traités après l’injection souris 14 jours (max. de fibrose) et 51 jours après l’injection (résolution de fibrose) en l’absence de cellules tumorales injection. Echelle = 500 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : greffe de poumon de lignées cellulaires LUAD dans de multiples modèles de souris est augmenté chez les souris préalablement traités par la bléomycine. A) athymiques souris prétraitement avec véhicule ou bléomycine ont reçu une injection de 5 x 105 L2030 cellules. Fardeau de tumeur poumon relative au point de terminaison (normalisé à la post-injection jour 0 jour 35) telle que mesurée par bioluminescence est tracée. Pour chaque groupe, une souris avec charge tumorale médian est montrée. n = 6-7 souris par groupe. Les images B) représentant H & E des poumons prétraitement avec véhicule ou bléomycine de A à jour 35. Astérisque = distale ; Étoile = proximale. C) athymiques souris traitées comme A on a injecté de 1 x 105 PC9 cellules. Images de fardeau et représentant de tumeur sont mesurées et montrés a. n = 7 souris par groupe. D-E) souris B6129SF1/J prétraitement avec véhicule ou bléomycine ont été injectés avec 1 x 105 368T1 KrasG12D / + p53- / - des cellules (KP Met T-non). Fardeau de la tumeur, images représentatives et H & Es sont mesurées et dépeinte comme dans A et B. n = 7 souris par groupe. F-G) souris NSG prétraitement avec véhicule ou bléomycine ont été injectées avec des cellules de 1 x 105 L2030-BrM3. Fardeau de la tumeur, images représentatives et H & Es (jour 9 et après l’injection jour 10) sont mesurées et indiquées comme dans A et B. n = 3-6 souris par groupe. Echelle = 500 µm. encart = grossissement élevé, des zones de cellule greffée de tumeur. Echelle de retraits = 100 µm. p valeurs calculées par le test de Mann-Whitney. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : cellules LUAD implantés chez les souris traitées à la bléomycine métastaser dans plusieurs organes éloignés. A) athymiques souris prétraitement avec véhicule ou bléomycine ont reçu une injection de 5 x 105 L2030-BrM3 cellules. Charge de tumeur pulmonaire a été mesuré chaque semaine à l’aide de bioluminescence. Flux de photons total dorsale normalisé au jour 0 s’affiche. B) tumeur le fardeau de la bioluminescence des poumons de A au point de terminaison (post-injection jour 35). Pour chaque groupe, une souris avec charge tumorale médian est montrée. n = 6-7 souris par groupe. C) images représentatives des organes avec Métastase décelable de la souris même à l’autopsie (à gauche). Tableau avec les fréquences indiquées des souris avec métastase dans des organes éloignés au point de terminaison (greffe après jour 39 à 57) (à droite). Ex-vivo des organes avec signal visuel de bioluminescent au-dessus de 1. 5 x 104 photons / (stéradian de2 cm s) étaient considérés comme des métastases positive. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Souche de souris Unités/souris
Athymiques 0,02
NSG 0,02
B6129SF1/J 0,005

Tableau 1 : Liste des doses recommandées de la bléomycine pour les souches de souris testées.

Souche de souris Lignée cellulaire Nombre de cellules injectées greffe de % valeur p
Véhicule Bléomycine
Athymiques L2030 5 x 10,5 0 % (0/7) 100 % (6/6) 0,0006
Athymiques L2030 5 x 104 n.d. 85,7 % (6/7) n.a.
Athymiques L2030 5 x 103 n.d. 85,7 % (6/7) n.a.
Athymiques PC-9 1 x 105 0 % (0/7) 85,7 % (6/7) 0,0023
NSG H2030-BrM3 1 x 105 16,7 % (1/6) 100 % (3/3) * 0.0476
B6129SF1/J 368T1 1 x 105 0 % (0/7) 71,4 % (5/7) * 0,0105

Tableau 2 : Tableau récapitulatif de la fréquence de la prise de greffe (%) en utilisant les souches de souris indiqué, de lignées cellulaires et de numéros de cellule. Prise de greffe a été déterminé par imagerie in vivo de luminescence et confirmée par imagerie ex vivo , avec histologie des tissus entre 37 et 50 jours après l’injection. * Prise de greffe positive a été confirmée par in vivo luminescence au jour 10 après l’injection.p valeurs calculées par le test exact de Fischer unilatérale. n.a. = sans objet ; ND = non déterminé.

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Discussion

Frappant de parallels cliniques ont été recensées entre le cancer du poumon et autres maladies chroniques du poumon36. En particulier, les patients atteints de fibrose pulmonaire idiopathique (IPF) ont une prédilection accrue pour développer un cancer du poumon, et cette association est indépendante du tabagisme histoire37,38. IPF est caractérisée par une destruction progressive de l’architecture de poumon et fonction respiratoire altérée par le biais de dépôts de l’ECM,39. Aussi, après résection chirurgicale, début stade NSCLC atteintes IPF simultanée ont un mauvais pronostic40. Plupart des tumeurs NSCLC contiennent une composante fibreuse au moment du diagnostic et de l’étendue de cette réaction stromale en corrélation avec un pronostic sombre,18. Dommages tissulaires aiguës ou soutenue de fibrose peuvent augmenter l’incidence de la tumorigenèse de multiples façons. Par exemple, après une blessure, le processus de régénération épithéliale peut élargir le vivier de cellules progénitrices sensibles à la transformation. Par ailleurs, l’afflux et la fonction des différentes cellules immunitaires peuvent aider à établir un microenvironnement immunosuppresseur, tandis que l’activation des myofibroblastes peut-être sécréter des facteurs de croissance ou déposer favorisant la tumeur ECM. En conséquence, notre méthode de pré conditionnement des poumons avec une fibrose inducteur peut s’avérer particulièrement pertinente à l’étude des effets des comorbidités en matière de cancer de poumon (p. ex. fibrose) et la modélisation des sous-types NSCLC, qui sont riches en matrice extracellulaire et une stroma inflammatoire41.

Dans l’ensemble, notre méthode a considérablement accru la prise de greffe de cellules tumorales injectées dans les voies respiratoires par l’intermédiaire de la trachée. Cette observation vaut pour des souches de souris avec des degrés de l’immunocompétence. Les autres méthodes d’injection de cellules tumorales dans les poumons comprennent l’injection dans la veine queue ou injection directe dans le parenchyme pulmonaire par l’intermédiaire de la paroi thoracique. Dans le but précis d’étudier la tumorigénicité de cellule pour le cancer du poumon, ces méthodes sont moins qu’optimales, comme l’ancien exige des cellules tumorales de survivre dans la circulation et extravasate avant excroissance (un processus plus proche de métastases dans les poumons), tandis que le second peuvent causer des cellules à écouler dans la cavité pleurale, peu de temps après injection (données non présentées). Les deux méthodes peuvent confondre loco-régionale quantification de l’excroissance des cellules du cancer pulmonaire. Par ailleurs, notre protocole garantit que les cellules tumorales ensemencés sont tout d’abord conservées dans les voies respiratoires, entourés par le stroma du poumon. Essentielles à la réussite du présent protocole, sont l’intubation correcte des souris, la dose tolérable de la bléomycine et le calendrier de pré-conditionnement des voies aériennes par rapport à injection de cellules tumorales. Nous démontrons également que ce protocole permet aux cellules de diffuser par la suite à d’autres tissus, y compris le cerveau. Bien que la morbidité associée à charge de tumeur pulmonaire peut limiter encore caractérisation complète des macrométastase lointain, cette approche peut être utile de quantifier et d’étudier des cellules tumorales circulantes provenant des poumons.

Malgré les avantages de la méthode décrite ici, plusieurs techniques variables peuvent influencer l’efficacité ultime de prise de greffe et le suivi de la progression tumorale. Tout d’abord, il est bien établi que la réaction fibreuse à la bléomycine chez la souris est dépendante de la souche. Par exemple, les souris C57Bl/6 sont plus enclins à la fibrose par rapport à de souris Balb/c42. Deuxièmement, la sensibilité à la bléomycine est dépend de l’âge et de sexe. Dans notre expérience, les femelles et les jeunes souris sont plus sujettes aux effets indésirables sur l’ensemble du protocole. Cela peut limiter la tumorigenèse études nécessitant des comparaisons directes entre mâle et femelle, ou petits et grands animaux. En outre, l’instillation intratrachéale de souris âgés de moins de 7 semaines est techniquement complexe et ajustements à la taille du cathéter peuvent être nécessaires. Troisièmement, la bléomycine est toxique et peut être mutagène en raison de sa capacité à induire des cassures de l’ADN. Il est important de tester la dose tolérable de la bléomycine pour chaque souche de souris avant de réaliser les expériences. Dans cette épreuve d’étude de principe, nous fournissons les doses suggérées pour les souris mâles à travers diverses souches. En outre, les souris avec fourrure sombre conviennent moins pour bioluminescent imaging due à la pénétration tissulaire faible et masquage du signal bioluminescent de la fourrure. Depilating les souris peut améliorer les mesures de l’image, mais des méthodes alternatives peuvent également être utilisées comme l’imagerie par résonance magnétique et l’imagerie fluorescente à l’aide de sondes de grande longueur d’onde comme TdTomato ou Katushka43. Enfin, l’immunogénicité potentielle d’une protéine donnée journaliste devrait considérer lors du choix d’une modalité de détection de tumeur pour un modèle de souris donnée.

Bléomycine remodèle les poumons distales par premier dommageable alvéolaire type 2 cellules (AT2) qui ensuite régénèrent pour tenter de réparer les alvéoles44. AT2 cellules étant un des types cellulaires majeurs pour donner naissance à NSCLC, préconditionner les poumons à la bléomycine peut-être également modifier l’initiation et la progression des tumeurs in situ découlant de gregory. Autres types de blessures, y compris la grippe infection13 ou naphtalène instillation14, ont été montrés pour augmenter la prise de greffe de cellules souches/progénitrices pulmonaires humaines et murines. Notamment, naphtalène dommages souches/progénitrices des cellules dans les jonctions de broncho-alvéolaire et augmente potentiellement initiation tumorale dans edged45. Réglage du type de blessure et de niche des voies aériennes ciblées pour les types de cellules implantée peut optimiser davantage notre méthode pour étudier les allogreffes de cancer du poumon ou xénogreffes d’origines différentes. Enfin, nous proposons que cette méthode peut être implémentée pour la génération standard du cancer du poumon PDXs. Le taux de réussite de mettre en place un cancer du poumon PDXs d’échantillons biologiques humains par greffe sous-cutanée chez les souris NSG est relativement faible (30 à 40 %)46,47. La croissance orthotopic de PDXs peut non seulement augmenter ce taux de réussite avec la limitation des quantités d’échantillon (provenant des poumons humains), mais génèrent également des conditions plus physiologiquement pertinentes pour tester la pharmacocinétique et la pharmacodynamie des traitements du cancer du poumon.

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Disclosures

Les auteurs déclarent sans intérêts financiers concurrents.

Acknowledgments

Cette étude a été financée par des subventions de l’Institut National du Cancer (R01CA166376 et R01CA191489 à D.X. Nguyen) et le Department of Defense (W81XWH-16-1-0227 à D.X. Nguyen).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bleomycin Sigma B5507-15UN CAUTION Health hazard GHS08
Exel Catheter 24G Fisher 1484121 Remove needle. For intratracheal injection
Ketamine (Ketaset inl 100 mg/mL C3N 10 mL) Butler Schein 56344 To anesthetize mice
Xylazine Butler Schein 33198 To anesthetize mice
Ketoprofen, 5,000 mg Cayman Chemical 10006661 Analgesic
Puralube Veterinary Ophthalmic Ointment BUTLER ANIMAL HEALTH COMPANY LLC 8897 To prevent eye dryness while under anesthesia
D-Luciferin powder Perkin Elmer Health Sciences Inc 122799 For luminescent imaging. Reconstitute powder with PBS for a working concentration of 15mg/mL. Protect from Light
Rodent Intubation stand Braintree Scientific RIS-100 Recommended stand for intratracheal injection
MI-150 ILLUMINATOR 150W MI-150 DOLAN-JENNER INDUSTRIES MI-150 / EEG2823M To illuminate and visualize trachea
Graefe Forceps, 2.75 (7 cm) long serrat Roboz RS-5111 For intratracheal injection
Syringe Luer-Lok Sterile 5ml BD / Fisher 309646
Satiny Smooth by Conair Dual Foil Wet/Dry Rechargeable Shaver Conair - To shave mice
Bonn Scissors, 3.5" straight 15 mm sharp/sharp sure cut blades Roboz RS-5840SC
15 mL conical tube BD / Fisher 352097
1.5 mL centrifuge tubes USA SCIENTIFIC INC 1615-5500
Vial Scintillation 7 mL Borosilicate Glass GPI Fisher 701350
Filter pipette tips (200 μL) USA SCIENTIFIC INC 1120-8710
Phosphate Buffered Saline Life Technologies 14190-144
0.25% Trypsin-EDTA Life Technologies 25200-056
DMEM high glucose Life Technologies 11965-092
RPMI Medium 1640 Life Technologies 11875-093
Fetal bovine serum USDA Life Technologies 10437-028
Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15140-122
Amphotericin B Sigma A2942-20ML
Trypan Blue Stain 0.4% Life Technologies 15250-061
Countess Automated Cell Counter Life Technologies AMQAX1000
Flask T/C 75cm sq canted neck, blue cap Fisher / Corning 353135
IVIS Spectrum Xenogen Bioluminiscence Perkin Elmer Health Sciences Inc 124262 For in vivo bioluminescence imaging
Living image software Perkin Elmer Health Sciences Inc 128113 For in vivo bioluminescence analysis
XGI-8 Gas Anesthesia System Perkin Elmer Health Sciences Inc 118918 For Isoflurane anesthesia
BD Ultra-Fine II Short Needle Insulin Syringe 1 cc. 31 G x 8 mm (5/16 in) BD / Fisher BD328418 For retro-orbital luciferin injection
Syringe 1ml BD / Fisher 14-823-434 For intraperitoneal injections
26 G x 1/2 in. needle BD / Fisher 305111 For intraperitoneal injections
4% Paraformaldehyde VWR 43368-9M CAUTION Health hazard GHS07, GHS08. For fixing tissue
Pipet-Lite Pipette, Unv. SL-200XLS+ METTLER-TOLEDO INTERNATIONAL 17014411
Mayer's Hematoxylin ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES 517-28-2
Eosin Y stain 0.25% (w/v) in 57% Fisher 67-63-0
Masson Trichrome Stain Kit IMEB Inc K7228 For masson trichrome stain to visualize collagen
Superfrost plus glass slides Fisher 1255015
6 well plate Corning C3516
Universal Mycoplasma Detection Kit ATCC 30-1012K
OCT Embedding compound ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES 62550-12 For embedding tissue for frozen sections
Leica CM3050 S Research Cryostat Leica CM3050 S To section tissue for staining analysis
Keyence All-in One Fluorescence Microscope Keyence BZ-X700
ImageJ US National Institutes of Health IJ1.46 http://rsbweb.nih.gov/ij/ download.html
Prism 7.0 for Mac OS X GraphPad Software, Inc. -
Athymic (Crl:NU(NCr)-Foxn1nu) mice Charles River NIH-553
NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) mice Jackson Laboratories 5557
B6129SF1/J mice Jackson Laboratories 101043
NIH-H2030 cells ATCC CRL-5914
368T1 generously provided by Monte Winslow (Standford University) -
PC9 cells Nguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62 -
H2030 BrM3 cells Nguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62 -

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Médecine numéro 136 adénocarcinome pulmonaire modèles murins orthotopique injection intratrachéale bléomycine greffe métastases
Pré conditionnement les voies respiratoires des souris à la bléomycine augmente l’efficacité de la prise de greffe orthotopique Lung Cancer Cell
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Stevens, L. E., Arnal-Estapé,… More

Stevens, L. E., Arnal-Estapé, A., Nguyen, D. X. Pre-Conditioning the Airways of Mice with Bleomycin Increases the Efficiency of Orthotopic Lung Cancer Cell Engraftment. J. Vis. Exp. (136), e56650, doi:10.3791/56650 (2018).

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