慢性的な経頭蓋電気刺激およびラットの皮質内の記録

Summary

この詳細なプロトコルは、自由行動ラットの経頭蓋電気刺激の短期および長期効果を調査するために、側頭骨に経頭蓋刺激電極配置をについて説明します。

Abstract

経頭蓋電気刺激 (TES) は、ランダムまたは閉ループ イベント発生方法でびまん性脳活動に影響を与える強力な比較的簡単なアプローチです。多くの研究が可能な利点および健康および病理学的頭脳の TES の副作用を中心に、まだ刺激の作用機序に関する多くの基本的な未解決の問題があります。したがって、明確がある急性をテストする堅牢で再現可能な方法および齧歯動物の TES の慢性効果のため必要があります。TES は、神経ネットワークの体内を調べる正規行動、イメージング、電気生理学的手法と組み合わせることができます。脳の活動を操作するための汎用性の高い、柔軟なツールを提供しながら、経頭蓋刺激電極の注入は実験的なデザインで余分な制約を課しません。ここでを作製し、インプラントの経頭蓋刺激電極ヶ月拘束された一時的な脳の活動に影響を与える詳細なステップバイ ステップのプロトコルを提供します。

Introduction

経頭蓋電気刺激 (TES) は一時的に拘束された方法で脳の活動に影響を与える貴重な方法論的アプローチです。サイズ、刺激電極の配置に応じて TES が大脳のボリュームに影響を与えるし、びまん性神経集団を同調^1,2,3。経頭蓋直流電流刺激が大鬱病性障害の^4、5と多くの研究は人間⁶経頭蓋刺激の認知的効果を示す焦点の治療のため既に医学的に承認されました。^,7します。 さらに、有望な結果をてんかん発作^8,9を制御する TES の可能性について報告しました。

集中的な研究にもかかわらずまだこの方法^10、11,12を適用する長期的な結果、潜在的な副作用は、アクションの詳細なメカニズムについて多くの未解決の問題があります。したがって、動物モデルでの TES の効果を調査するため、再現性のある堅牢なプロトコルを持っている非常に重要です。ためのプロトコルを提供我々 目を覚まし動物 (例えばうつ病、てんかん、統合失調症) の多くの疾患が広く調査のみ、これらの医療条件の本質は、通常長期の治療を必要と、慢性的なラット頭蓋電極の注入。ここで紹介した方法は行動研究のため使用することができます。 または (すなわちワイヤー、シリコン プローブの、juxtacellular 電極) 記録電極の注入したり、電気生理学的実験のため慢性頭蓋ウィンドウに結合することができます。イメージング研究、それぞれ。実験的なデザインによって刺激のタイミングはランダムまたはイベントによってトリガーされる特定の行動キューまたは特定の頭脳の状態 (発作、シータ)^8,の電気生理学的特徴をすることができます。^11,13。

それは、皮膚に装着した電極の形態を使用して、現在使用されている人間のアプローチと対照をなしてを示すラットから側頭骨の表面に皮下注入右をほとんど採用方法を言及することが重要彼らの足を使用して簡単にアクセス可能である彼らの皮膚上に配置何かに耐えます。

注入の慢性的な性質のため交換、削減、および改良の原則に則り、このメソッドは、使用できるようにヶ月間、さまざまな実験条件で各動物を募ることができますので、動物の数を減らすのに役立ちます少ない動物の様々 な仮説をテストします。

本研究では、経頭蓋刺激電極 (図 1 aB) 製造の詳細なステップバイ ステップのプロトコルを提供し、6 ヶ月歳の頭骨上これらの電極の慢性的な注入を実証男性のロング ・ ラット。

Protocol

ここで説明するすべての方法は、コミュニティの欧州理事会の指令に従って (86/609 ECC) アルバート ・ セント ・ イシュトバーン Györgyi 医療薬学の大学センターで動物研究の倫理委員会によって承認されているとセゲド (XIV/218/2016)。

1. 刺激電極の作製

1. 1 つの刺激電極、ミニチュアのフックアップ ワイヤの六つの 10 cm 長い部分をカット削除の一端にクラッドともう一方の端に 1 cm 2 cm します。
2. 2 本のケーブルを撚り合わせて、皮をむいた短辺で半田付け。
3. SOT 353 ケースとあらゆる集積回路の 3 つのテープ包装のストリップを取得します。
4. パッケージの 3 つの穴を介してツイスト線をステッチします。ワイヤの長い皮をむいたセグメントはパッケージの空洞にする必要があります。断熱材の端が穴の縁に沿ったようにケーブルを配置します。
5. ワイヤーを固定する穴に歯科用セメントを置きます。
   注意: 歯科用セメントをパッケージのキャビティに漏出を避けるために十分な高密度にする必要があります。
6. セメントが固化 (最小 10 分) と、パッケージを反転し、セメント系多孔質に向かって水密シールを形成する穴に瞬間接着剤の薄い層を置きます。皮をむいた線を接着しないでください。
7. 短い皮をむいた側のケーブルを一緒にねじるし、半田付け (図 1 a)。
8. もはや皮をむいたセグメント線の高級ピンセットの先端をつかんで、それらをロールバック空洞 (図 1 b) にそれらをラップします。必要な場合は、余分なケーブルをカットします。

2. 記録電極の作製

1. 1 つの記録を作成するには、トリプレット電極 (図 1D)、高速ロータリーを使用してステンレス鋼チューブの 1 センチの部分をカットを見た。鋭い針とチューブの端からフィンを削除し、チューブが残骸のきれい、完全に透過性であることを確認します。
   注: 彼らはチューブを歪めるが、ペンチを使用しないでください。
2. J 形のホルダーを形成する 3 cm の長さの最小な金メッキ基板スペーサー ピンを曲げます。「J」形状の長い脚をカットし、、電極を保持し、アンカリング ポイントとして 'U' 形状と脳定位固定装置によって開催される、長い直線部分の取り外し可能なジョイントさせる元の形を取り戻すため一緒にはんだ付け.チューブで一緒に 'J' ホルダーの短い足を接着します。安定性のため、必要に応じていくつかの追加の 1 cm 長い棒を接着します。
3. ステンレス鋼、超はさみで 2.5 cm 長い電極線の 3 の部分をカットします。クリアでシャープなカット、断熱材、電極ワイヤーの円形の面でそのままになっていることを確認します。また適用される力のためカットの先端が曲がっていないことを確認します。1、2 mm (例えば、1 つの左ストレート 1 45 °、1 つ直角) それらを区別する別の角度で線のそれぞれの一方の端を曲げます。
4. ワイヤーと管を埋める、実験用電極の適切な間隔を選択 (例えば、皮質のローカル フィールド ポテンシャル (LFP) と現在ソース密度 (CSD) 登録からワイヤーの先端の推奨の突出のため、チューブを開く: 4.5 mm 4.1 〜 3.7 mm、それぞれ)。どの線が適切なチャネルの順序を維持するための深さに対応するメモ。
5. 一度ワイヤーは隣同士に右揃え、チューブに平行、電極ワイヤを修正する配置液体接着剤で一滴チューブの両端に鋭い針で。接着剤が管毛細管効果によりは突出の端に記録サイトない方に流れることを確認します。
6. 使用する記録システムと互換性のある適切な自電極インター フェース ボードを準備します。
7. 目的の記録のチャネルに対応する電極のインタ フェース ボードの穴にワイヤの非記録、曲がった先端をご紹介します。すべてのワイヤが位置、ピンセットで、金色のピンを穴に押し込みます。
   注: 歯科用セメントを使ってその場で金のピンを修正可能性がありますが、ほとんどの場合、それは十分に安定してなくてもこの安全手順。

3. 麻酔

1. シール麻酔誘導室に動物を置き、イソフルラン 2 L/分医療空気中の 4-5% でそれを埋めます。
2. ラットがリカンベント、商工会議所から動物を削除し、適切な換気の鼻部分を固定フレームに置きます。
3. 気流の率は同じままですが、2% にイソフルラン レベルを設定します。麻酔のレベルを確認します。つまんでに応えて足引っ込め反射がない場合、続行、麻酔の深さが増加します。
4. 監視し、37 ± 0.5 ° C 恒温監視システムでラットの体温を維持します。角膜の乾燥を防ぐために目にパラフィン軟膏の滴を適用します。この手順、手術中に数回、必要に応じて繰り返します。
5. 気道における粘液形成を避けるためにアトロピンを 0.3 mg/kg を皮下注入します。この長い手術の場合は 4 時間ごとに繰り返します。呼吸を監視し、必要な場合、気化器を調整します。

4. 刺激と記録電極の注入

注: オートクレーブ外科すべての必要な機器および慎重に全体の手順中に無菌と消毒の一般的な規則に従います。外科領域以外の非滅菌の分野を触れないでください。移植前に 30 分のエチルアルコール溶液 (70%) 電極を浸します。

1. 髪クリッパーで頭皮から髪の毛のほとんどを削除します。頭皮に脱毛クリームを適用、表面に均等に広げ、数分待ってから。ヘラを使用すると、クリーム、残りの髪を慎重に取り外します。消毒し、水で皮膚を洗い流します。
2. 1-2% リドカインを注入する (7 mg/kg の総線量を超えない) 皮下に皮膚を麻痺させます。獣医軟膏 (例えばパラフィン) 目の一滴を適用します。
3. 首に額から、メスに正中線で徹底したと長い (~ 2 cm) 矢状切開を行います。頭蓋骨の骨膜を含む組織を解剖し、2 つの側頭骨の稜間区域をきれいに彫刻刀や歯のピンセットを使用しています。4 ブルドッグを使用して切り裂かれた皮膚の取り消しによって公開される頭蓋骨をしてください。
4. 優しく頭骨の急な端と筋の間の高級ピンセットを置き、それらを分離します。筋肉を損傷することがなく、好ましくは冠状縫合の平面に後頭骨の端から、できるだけ側頭骨の大規模な表面の多くとして公開するジグの動きを確認します。
5. リトラクター公開側頭骨を保つために bitemporally を配置します。
6. リンスと 1-2 の mL 3% H₂O₂頭蓋骨の表面、1-2 mL の水で洗ってください。
7. 側頭骨の表面を非常に慎重に空気乾燥、眼の棒で水分をモップでふきます。(刺激電極の上部の縁は側頭骨の稜の端に沿ってする必要があります) 洗浄垂直頭蓋骨表面上に刺激電極に適合する場合をテストします。ブルドッグと、リトラクターを再調整または必要に応じてハサミでは、刺激電極の形状します。
8. 導電性電極ゲルし、電極の縁に接着剤の薄い層を置く刺激の空洞を埋めます。
9. 1 つの正確な動きと側頭骨の乾燥表面刺激電極を配置、しっかりと場所に保持 1 分の高級ピンセットで。水分が接着剤との接触がないことを確認してください。必要に応じて眼棒をモップします。
   注意: 電極の任意の不安定を経験した場合、それを削除します。骨を洗浄後新しい刺激電極でこの手順を繰り返します。
10. 組織の漏れの水分は継続的に眼の棒で乾燥する間、刺激電極のエッジ上歯科用セメントを置きます。セメントを用いた全体刺激電極をカバーします。
11. セメントが完全に硬化すると、側でこれらの手順を繰り返します。
12. すべてのネジをアンカーのため頭蓋骨のいくつかの穴をドリルします。穴にミニチュアねじをドライブし、それらを歯科用セメントを置きます。~ 10% 小径ドリルねじ径と比較して頭を使用します。
13. 実験の目的に応じてケーブルの両端にコネクタをはんだ付け、セメントでカバーして、表面の上に置きます記録電極と光ファイバーを植え付けることを続行または頭蓋骨の頭蓋ウィンドウを準備します。後者の場合、コネクタをはんだ付けし、終了時にのみ構築にそれらを固定します。長期同時 TES と LFP 録音の必要な場合インプラントの単一ケーブルの代わりに前述の電極三つ子を実行します。
    注: このセットアップは、共通モード刺激工芸品⁸の除去のためことができます。電極注入の記録の詳細については、以前のプロトコル^14,15を参照してください。
14. 消毒剤と豊富露出した組織を洗浄します。1-2% リドカインを注入する (7 mg/kg の総線量を超えない) 皮下。
15. 傷のエッジを創傷清拭し、コネクタ/インプラント周囲の簡単な縫合で閉じる。ポビドン ヨードで傷口を消毒します。
16. Carprofene 5 mg/kg を皮下注入します。必要に応じて、この手順を繰り返します。
    注: 他の鎮痛薬は、ローカル倫理許可委員会によって設定された要件と一致する使用可能性があります。
17. 麻酔を中断、earbars とノーズピース、解放および意識を取り戻すために術後の回復ケージに動物を置きます。
18. 最初の術後の時間中に近い監督の下で動物が確実します。インプラント領域を定期的に監視し続けます。
    注: 動物残さないように無人までそれは胸骨の横臥を維持するために十分な意識を取り戻しました。プロシージャから完全復旧まで個別に動物の家。

Representative Results

慢性刺激電極 (図 1 b) の注入は、電極 (図 1D) の追加注入と組み合わせることができます。このような設定は、オン ・ デマンド記録と特定の脳の活動を妨害する刺激システムを形成する適しています。閉ループてんかん検出と介入システム、ロング ・ ラット自発性発作 (図 2 a)⁹を表現する適用の代表の結果をご紹介します。この緊張感・行動の症状てんかん (小発作) がない場合 (図 2 b) を見るに知られています。記録として、てんかん発作の場合皮質内信号をリアルタイムに分析、脳のスパイク波の活動を妨害する現時点で適切な分離刺激発生器に、トリガーを送信します。ターンでは、刺激発生器は、電荷平衡三相刺激両耳側の刺激電極による発作活動を中断するために提供します。

図 2-Dは、堅牢性と注入の刺激電極の信頼性を示す、16 週目に 1 週目から継続的な発作を中断する一時的ターゲット刺激の容量を示しています。図 2Eが中止された実験、二次組織が側頭骨と不適切なシーリングと電極のセメントによる電極表面の浸透のレコーディングを表示のコンテキストでこれらの結果を出す (の死体解剖、動物確認組織への浸潤)。刺激電極のインピー ダンスを増やす以外にも成長している組織が電気シャントを提供する可能性が。この実験では、刺激の実験中に信頼性が高く、再現性のある結果を達成するために慎重な分離の全くの重要性を強調します。

図 1: 刺激と記録電極作製の手順を実行します。(A) ツイスト ワイヤ穴ステッチし、空洞に皮をむいた電線をラップする前にパッケージを固定します。(B) 刺激電極の最終形態。Inset: ラップ、包装内部の配線(C) 記録電極の断面写真(D) 記録電極の平面図です。はめ込み: 記録サイトの先端 400 μ m 間隔。(E) 経頭蓋刺激電極配置の術中写真。刺激電極は、固定ネジのいくつかと共に既に注入します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2: このプロトコルの刺激電極を用いた閉ループ発作介入の代表の結果。(A) 閉ループ システムの概要。頭頂葉における三重項記録電極が埋め込まれた、刺激電極は頭蓋骨に bitemporally が配置されます。ラットは頭にアンプ搭載、リアルタイム発作検知システムに接続されています。(B) LFP トレース 1^stの介入を発作の連続スパイク波発作 (CとD) 例 LFP トレースと刺激の 16 週^目。織の増生刺激電極と側頭骨 (剖検で確認) の間の場合発作中断の失敗の (E) 例この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Discussion

このプロトコルの最も重要なステップは、骨表面に電極パッケージの接着です。不適切なシーリングの場合、骨と電極のギャップが形成され、二次瘢痕組織は刺激性を軽減このギャップに育てることができます。パッケージにこだわりの手順中に骨表面が完全に乾燥する必要があり、電極の不安定性が発生している場合にする必要があります削除して最良の結果を得るために新しいパッケージに置き換えられます。

このメソッドの制限は、手術後の皮膚が完全に閉じられていないと感染のリスクが比較的高いがあることです。消毒液と後で粉体、回復中に最初の 4-5 日で術後のケアは、感染症を防ぐのに役立ちます。我々 の経験でこの治療法は外の世界に向かって傷を閉じることができます完全に瘢痕組織の形成を促進します。

ここで提案電極作製が特別のニーズに応じて特定の実験の導電性材料の変更する必要があるなど、最も安い、最もアクセスしやすい方法の 1 つ、ケーブルの表面をコーティング非偏光電極インターフェイスの材料、例えばPEDOT:PSS。電極パッケージはカスタムメイドで、実験者によって変更された、3 D プリントすることができます、ケースで私たちの提言によって特定研究の要件が一致しません。私たちの経験では本研究で作製した経頭蓋電極のサイズ、体重 300 グラム以上の両方の男性と女性のラットにした絵を許可するが、刺激電極のサイズはプロトコルの手順で小さいストリップを切断することによって簡単に減らすことが1.3. さらに, すべての接着剤とプロトコルは、歯科用セメントは、外側の層が、組織と直接接触したがって生体適合性をする必要がありますを考慮した代替と交換できます。

本研究で我々 は提供プロトコル両耳側の刺激電極作製の注入は、長期にわたって実行する簡単な費用対効果、および信頼性の高いを技術的には、電気刺激実験を自由にできます。移動ラット⁹。側頭骨に刺激電極を配置すると、他の同腹全体水平頭蓋骨表面は保持されます。このメソッドは通常生理^15,16, 光¹⁷、併用とイメージング¹⁸技術、実験的プロトコルの多才な組み合わせの可能性を提供します。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cyanoacrylate liquid	Henkel	Loctite 401
Cyanoacrylate gel	Henkel	Loctite 454
Wire for stimulation electrodes	Phoenix Wire Inc.	36744MHW - PTFE Microminiature Hook-Up Wire
Board spacer	E-tec Interconnect	SP1-020-S378/01-55
Connector	E-tec Interconnect	P2510I-02
Tape packaging for stimulation electrodes	Nexperia	74HC1G00GW	Tape packaging of any integrated circuit with SOT-353 case can be used
Grip Cement Industrial Grade	Caulk Dentsply	675571 (powder) 675572 (solvent)
Electroconductive gel	Rextra	ECG Gel
Recording electrode wire	California Fine Wire Co.	.002 (50 micron) Tungsten 99.95% (CFW Material #: 100-211), HMl-Natural, cut to 3.0 inch pieces, Round, Cut length piece wire
Ultrafine scissors	Hammacher Instrumente	Stainless HSB 544-09
Stainless steel tube	Vita Needle Company	29 RW, 304SS Tubing, T.I.G. Welded and Plug
High speed rotary saw	Dremel	Model # 395
Rotary saw holder	Dremel	Model # 220
Rotary saw cut-off wheel	Dremel	Model # 409
Ocular sticks	Lohmann-Rauscher	Pro-ophta Ocular Sticks
Wet disinfectant	Egis	Betadine
Dry disinfectant	Wagner Pharma	Reseptyl-urea
Drilling machine	NSK-Nakanishi United Kingdom	Vmax35RV Pack
Anchoring screws	Antrin Miniature Specialties, Inc.	000-120x1/16 SL BIND MS SS