Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Bygga upp en High-throughput Screening plattform att bedöma heterogenitet HER2 genen amplifiering i bröstcancer

doi: 10.3791/56686 Published: December 5, 2017

Summary

Heterogen fördelning av HER2-positiva celler kan observeras i en delmängd av bröstcancer och genererar kliniska dilemman. Här introducerar vi en pålitlig och kostnadseffektiv protokoll för att definiera, kvantifiera och jämföra HER2 intra-tumör genetisk heterogenitet i en stor serie av heterogeneously bearbetade bröstcancer.

Abstract

Riktade terapier mot human epidermal tillväxtfaktor receptor 2 (HER2) har radikalt förändrat resultatet hos patienter med HER2-positiv bröstcancer. Ett fåtal fall visar emellertid en heterogen fördelning av HER2-positiva celler, som genererar stora kliniska utmaningar. Hittills har har inga tillförlitliga och standardiserade protokoll för karakterisering och kvantifiering av HER2 heterogena gen amplifiering i stora kohorter föreslagits. Här presenterar vi en hög genomströmning metod för att samtidigt bedöma den HER2-statusen i olika topografiska områden av flera bröstcancer. I synnerhet illustrera vi det laboratorieförfarande att konstruera förbättrade vävnad microarrays (TMAs) införliva en riktade mappning av tumörer. Alla TMA parametrar har optimerats speciellt för den silver i situ -hybridisering (SISH) av formalin-fast paraffin-inbäddat (FFPE) bröstvävnad. Immunhistokemisk analys av de prognostiska och Prediktiva biomarkörer (dvs, ER, PR, Ki67 och HER2) bör utföras med automatiserade procedurer. En anpassad SISH-protokoll har genomförts för att möjliggöra en hög kvalitet molekylär analys över flera vävnader som genomgick olika förfaranden för fixering, bearbetning och lagring. I denna studie ger vi ett proof-of-principle att specifika DNA-sekvenser kan vara lokaliserade samtidigt i skilda topografiska områden av flera och heterogeneously behandlas bröstcancer med hjälp av en effektiv och kostnadseffektiv metod.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

HER2 är en proto-onkogener som i ökad utsträckning och förstärks i 15-30% av alla invasiva breast cancer1,2. HER2 överuttryck är slutsatsen av närvaron av > 10% celler med stark membran immunhistokemisk (IHC) färgning (3 +), medan den gen förstärkningen kan bedömas när HER2/centromer förhållandet är ≥2 eller antalet gen kopia är ≥6, på inventering på minst 20 celler genom in situ hybridisering (ISH)3.

Intra-tumör genetisk heterogenitet har varit allmänt beskrivs i bröstcancer, att vara ett potentiellt negativa bidrag till biomarkörer utvärdering och behandlingar svar4. Enligt den College av amerikanska patologer (GJP), HER2 olikheter finns om HER2 förstärks i > 5% och < 50% av infiltrera tumör celler5. Tyvärr, den faktiska förekomsten av HER2 rumslig heterogenitet i bröstcancer är fortfarande föremål för kontroverser bland patologer, med några författare att upprätthålla som det är en ytterst sällsynt händelse och andra tyder på att upp till 40% av fallen är HER2-heterogen1,5,6,7,8,9,10. Trots de biologiska mekanismer som ligger till grund för detta tillstånd är ännu inte fullt klargöras inte, de prognostiska och kliniska effekterna av intra-tumör HER2 heterogenitet är avgörande för bröstcancer cancer patienter11.

Ljusa fält molekylära tekniker, såsom kromogen ISH (CISH) och silver ISH (SISH), har nyligen dykt upp som tillförlitliga metoder för att upptäcka HER2 heterogenitet i FFPE vävnader, med vissa fördelar jämfört med fluorescerande ISH (fisk)12. Tyvärr, bulk analys av enstaka fall förblir opraktiskt i stor-kohort forskningsstudier. Flera grupper har föreslagit att kombinationen av histokemi, IHC och ISH med TMA teknik kan utgöra en värdefull strategi i studien av cancer biologi13,14,15,16. Med den här allmänt antagna metoden kan vävnadsprover från olika patienter analyseras samtidigt minimera vävnad och reagenser sysselsatt och därmed främja en enhetlig analys av ett stort antal fall14. Det finns dock inga protokoll för samtidig hög genomströmning molekylär karakterisering av flera vävnadsprover som genomgick olika behandling i form av reagenser, fixering gånger och bevarande metoder sysselsatta, sådan som arkivens block.

Prognostisk och klinisk konsekvenserna av HER2 rumslig heterogenitet i bröstcancer får utvecklat vi en integrerad molekylär plattform för att bedöma det i stora serier av heterogeneously bearbetade fall. Här, skildra vi de laboratorium strategierna för att generera och analysera intra-tumör heterogenitet HER2 amplifiering i högavkastande TMAs av bröstcancer genom SISH. Följande protokoll har utvecklats för tumörer mätning > 5 mm (> pT1b enligt den TNM 2017)17. För mindre lesioner rekommenderar vi utför analysen på heltäckande ansiktsskydd seriell avsnitt. Vårt förfarande möjliggör samtidiga IHC och SISH analys av upp till 30 bröstcancer, som omfattar ett medelvärde på 6 olika områden (intervall 4-8) för varje fall. Sammanlagt kommer 180 vävnad kärnor 1 mm i diameter, med 500 µm mellan kärnor och 2 mm mellan rutnät och kanter att genereras för varje TMA-block.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denna studie godkändes av den institutionella granskning brädor från IRCCS Ca' Granda Foundation, Policlinico-sjukhuset, Milano, Italien.

1. urval av patienter och vävnadsprover

  1. Hämta arkivens bilder i alla fall ska analyseras, inklusive alla tillgängliga hematoxylin och eosin (H & E) och IHC diabilder från den ursprungliga diagnosen och, i förekommande fall, en H & E av matchade icke-neoplastiska bröstvävnad (t.ex., kirurgisk marginal) .
  2. Utföra fall recensioner.
    Obs: För denna uppgift, minst två patologer med erfarenhet av bröst patologi bör diskutera de diagnostiska bilderna och lösa meningsskiljaktigheter kollegialt. Använda ett konventionellt Mikroskop eller telepathology verktyg (gynna den senare i multicentric studier). Om någon, utesluta alla disharmoniska fall.
    1. Utföra den histologiska omklassificering av alla fall enligt den senaste utgåvan av Världshälsoorganisationen (WHO) klassificering av tumörer av bröstcancer18.
    2. Se till att den normala vävnaden för varje fall, om den finns i arkivens kliniska prover, består av minst en icke-neoplastisk terminal duktal-lobulär enhet.
    3. Identifiera alla neoplastiska områden som visar heterogena Cytologisk, arkitektoniska, eller IHC funktioner med ljusa fält Mikroskop (skall utföras gemensamt av en patolog och den technician(s) som kommer att bygga TMAs).
  3. Markera de diskreta topografiska områdena med en markör på en glasskiva eller med de rätta verktygen på en digital bild programvara (figur 1A).
  4. Baserat på de markerade bilderna, hämta de motsvarande FFPE-block från arkiven.
    Obs: för att optimera TMA konstruktion, att undvika vävnad utarmning, och att bevara TMA punch strukturell integritet, fall med < 1 mm tjock kvarvarande vävnad bör uteslutas.

2. designa och konstruera TMAs bygger på Kononen teknik

  1. Skapa och öppna en ny kalkylbladsfil som innehåller poster av de olika områdena i varje fall. Inkludera följande data på separata kolumner, som exemplifieras i tabell 1: fall-ID, Block-ID, områdes-ID, vävnadstyp (t.ex., normal vävnad, invasiv komponent tidstrender, i situ komponent tidstrender), topografi (t.ex., det tumör core, invasiva framsidan), morfologi (t.ex., kärnteknisk kvalitet, arkitektur, mitoser, cytologiska funktioner), biomarkörer status (dvs, östrogenreceptor (ER), progesteronreceptorn (PR), Ki67 och HER2), och alla andra IHC funktioner tillgängliga.
    1. Spara dokumentet.
  2. Skapa ett TMA-projekt.
    1. Installera och öppna programvaran TMA designer.
    2. Definiera TMA mottagaren kvarter: åtkomst via menyn Arkiv > Nytt > Block eller genom att använda CTRL + B.
    3. Klicka i det första fältet att fylla eller trycker på TABB och skriv i dimensioner av paraffin blocket: Bredd 35 (mm), höjd 20 (mm). Typ ”2” som ”marginal” värde (dvs., avståndet från paraffin kant i mm) (figur 1B). Spara data genom att klicka på korrekt. Den nya mallen av mottagaren block sparas nu och redo för att användas i ny vävnad matris mallar.
    4. Skapa en vävnad array-projektet: tillgång till menyn Arkiv > Nytt > vävnad matris eller genom att använda CTRL + T.
    5. Fyll i namn av vävnad matris, kommentarer och författare, klicka på ”Nästa”. Klicka på ”Importera”-ikonen, välja mallfilen av mottagaren block skapade tidigare och klicka på ”Nästa”.
    6. Välj 1 mm som spot storlek genom att klicka på den runda knappen. Välj 500 µm som spot avstånd vilket är utrymmet mellan två centrerar av närliggande ställen. Klicka på ikonen kalkylator beräkna det totala antalet ställen som skapade, som bör vara 231. Klicka på ”Nästa”.
    7. Definiera de spot numrering-läget genom att klicka en gång på den. Klicka på knappen ”definiera” för att skapa stödraster och underrutnät. Ta bort den centrala linjen (linje 6) och kolumnerna 8 och 15. Upprätthålla 3 ställen på linje 1 för orientering. Sista kartan bör omfatta totalt 183 ställen, som representerade i figur 2.
    8. Definiera listan över vävnadstyper: åtkomst via menyn Arkiv > Nytt > lista över vävnadstyper eller genom att använda CTRL + L.
    9. Infoga vävnad beskrivningarna tidigare definierats. Tryck på NEDPIL eller klicka på den + knappen för att lägga till en rad.
    10. Definiera projektet: åtkomst via menyn Arkiv > Nytt > Booster projekt eller genom att använda CTRL + P.
    11. Fyll i namn av vävnad matris, kommentarer och författare, klicka på ”Nästa”. Importera kalkylbladsfilen, lista av vävnadstyper och vävnad matris modellen tidigare skapat genom att klicka på ikonerna för korrekt.
    12. Klicka på ”Markera alla” och definiera antalet platser för varje vävnadstyp; Klicka på knappen ”match” för att tillämpa inställningarna. En tabell över det totala antalet kärnor som kommer att provtas och överförs till mottagaren block i detta projekt kommer att visas. Spara projektet och Stäng programmet.
  3. Förbereda de acceptor (n) (figur 1B).
    1. Fylla rengjord metall formar med elastisk paraffin på 65 ° C.
    2. Lämna de paraffinblock svalna i rumstemperatur över natten inne i metall formarna.
    3. Extrahera de paraffinblock från metall formarna. Om sprickor uppstår, kassera blocket och upprepa steg 2.3.1-2.3.3.
  4. Konstruera de TMA med hjälp av ett automatiskt eller halvautomatiskt arrayer19.
    1. Hämta alla valda FFPE-block och motsvarande H & E avsnitt med anteckningar.
    2. Aktivera arrayer och infoga de acceptor (n) på arrayer karusellen.
    3. Öppna programvaran arrayer kontroll station, klicka på ”ny vävnad matris” och ladda projektet skapade tidigare (figur 1 c).
    4. Klicka på ”Fortsätt” och välja position för de givare (n) från menyn.
    5. Definiera startpositionen till varje mottagare blocket: Använd piltangenterna för att flytta laserljuset och justera det mot övre vänstra kanten på paraffinet av mottagarens blocket.
    6. Klicka på ”Nästa” och upprepa för lodrät justering.
    7. Klicka på ”Nästa” för att automatiskt skapa ett hål i den tidigare definierade koordinaten för mottagaren (acceptor) blocket.
    8. Töm punsch.
    9. Placera givaren blocket för provtagning och tar bort en vävnad kärna från området tidigare kommenterad av intresse.
    10. In givaren vävnad kärnan i hålet i blocket mottagaren (acceptor).
    11. Ta bort givaren blocket från arrayer.
    12. Upprepa steg 2.4.5-2.4.11 tills TMA är klar.
  5. Sätta vävnad sida av nygenererad TMA block på en steril tom bild och placera dem i lab ugnen vid 45 ° C i 5 min.
  6. Tryck försiktigt på blocket i bilden för 5 s platta vävnad kärnar ur. Upprepa en gång (för sammanlagt 2 gånger).
  7. Ta bort TMA blocket tillsammans med bilden från ugnen, vänd dem och försiktigt loss blocket från bilden.
  8. Täcka TMA vävnadsytan med ett tunt lager av elastisk paraffin på 65 ° C.
  9. Lämna TMA blocket i rumstemperatur i 2 h.
  10. Överföra TMA blocket vid 4 ° C under 24 h.
    Obs: TMA blocket kan lagras vid 4 ° C tills utmattning.

3. histochemical och immunhistokemiska analyser

  1. Skär TMA sektioner.
    1. Placera de TMA acceptor (n) med paraffin-underlag-10 ° C i ca 10 min till chill paraffinet.
    2. Fyll ett floatation bad med ultrarent vatten och Ställ in värmen till 38 ° C.
    3. Placera ett nytt blad på en roterande mikrotom och infoga blocket i mikrotomen chucken så vax blocket ansikten bladet och är justerad i vertikalplanet.
    4. Närma blocket noggrant med blad och skär några tunna sektioner för att säkerställa att placeringen är korrekt. Justera vid behov.
    5. Skär 3 µm tjocka sektioner.
    6. Plocka upp avsnitten använda pincett och flyta dem på bad vattenytan.
    7. Plocka i avsnitt ut vattenbadet på regelbunden och IHC/ISH glasskivor.
    8. Placera glasen på ett galler och förvara dem i ugn på 45 ° C över natten.
      Obs: När förberett, bör avsnitten TMA färgas inom 24 h.
  2. Utföra histochemical färgning (H & E) använder en autostainer.
    1. Infoga bilderna i autostainer rack och placera dem vid 60 ° C i 10 min.
    2. Öppna ett laddningsfacket autostainer och infoga racket med TMA glider i en av belastning stationer med ett standard H & E klipp utåt.
    3. När lådan är stängd, klippet identifieras automatiskt av systemet och följande protokoll startar: ugn station vid 37 ° C (6 min), xylen (2 min), xylen (2 min), etanol 100% (2 min), etanol 100% (2 min), etanol 95% (2 min), etanol 95% (2 min) , destillerat vatten (4 min), Carazzi's hematoxylin (9 min), lågtryck rinnande vatten (2 min), eosin 1% (1 min), lågtryck rinnande vatten (2 min), etanol 95% (20 s), etanol 95% (20 s), etanol 95% (20 s), etanol 95% (20 s), etanol 100% (15 s), etanol 100% (15 s) , xylen (30 s), xylen (30 s).
    4. Lasta rack från lådan och montera bilden med ett täckglas.
      1. Samla en droppe av mount med en pipett och sätta det i yttre kanten på locket bilden.
      2. Placera täckglaset våta sida på bilden och låt fästet torka i 30 min.
  3. Utföra IHC färgning för ER, PR, Ki67 och HER2 med hjälp av en automatiserad immunostainer.
    Obs: Innan du börjar en färgning körning, starta upp systemet, och kontrollera förbrukningsmaterial reagensflaskorna (Tabell av material) och slösa behållare.
    1. Placera TMA glasen att analysera vid 60 ° C i 10 min.
    2. Starta immunostainer instrument och programvara.
    3. På vyn hem klicka på protokoll och sedan på Skapa/redigera protokoll.
    4. Välj den standarda DAB (3, 3'-Diaminobenzidin) IHC förfarandet att ändra den grundläggande mallen.
    5. Flagga ”avparaffinering” i lista och ställa in Medium temperatur vid 72 ° C.
    6. Flagga cc1 Demaskering lösningen, ställa in Medium temperatur vid 95 ° C, och inkubationstiden på 36 min.
    7. Flagga rutan primär antikropp, infoga ID för ER inline dispensern (instrumentet programvaran känner igen fördelaren på reagens karusellen) och ange inkubationstiden på 16 min.
    8. Flagga Counterstaining rutan, Välj Hematoxylin jag och uppsättning inkubationstiden på 12 min.
    9. Klicka på knappen ”Spara som” och namn i protokollet.
    10. Upprepa de steg 3.3.3-3.3.9 för de kvarvarande antikroppar med hjälp av följande primära antikroppar inkubationstider: PR 16 min, Ki67 16 min och HER2 12 min. använder pre utspädda ready-to-use (RTU) antikroppar.
    11. Klicka på knappen Skapa etikett på vyn hem.
    12. Klicka på protokoll och Lägg ER, PR, Ki67 och HER2 protokollen för vart och ett av TMA att analysera.
    13. Klicka på knappen Stäng /Print.
    14. Som etikett mall visas, ange de TMA-ID för etiketten.
    15. Klicka på knappen Print för att skriva ut etiketter och sedan applicera dessa på TMA bilderna.
    16. Klicka på ikonen instrument och ställa instrumentet startläge som ”klar”.
    17. Öppna huven som täcker reagenser karusellen, placera för upptäckande och primära antikroppar, sedan Stäng huven.
    18. Klicka på en bild-låda för att öppna det, Ladda objektglasen TMA och Stäng lådan genom att klicka på samma knapp främre knappen.
    19. Ställ in instrumentet startläge som ”kör” och följ instruktionerna.
    20. I slutet av den köra, lasta TMA glider genom att trycka på öppna alla lådor med klar bilder knappen på instrumentet skjut kontroll och skölj varmt dem i tvålvatten för att ta bort alla återstående reagenser.
    21. Tvätta bilderna under lågtryck rinnande kallt vatten, torka TMA bilderna och tillämpa ett täckglas till varje bild.
  4. Utföra IHC analys av ER, PR och HER2 efter amerikanska samhället av klinisk onkologi (ASCO) / CAP riktlinjer, och av Ki67 enligt rekommendationerna från den internationella Ki67 i arbetsgruppen för bröstcancer (tabell 2).
    Obs: Denna analys bör utföras separat i diskreta vävnad fläckar av en patolog med erfarenhet i bröst patologi.
    1. Bedöma ER uttrycket som positivt om ≥ 1% av tumören cellkärnorna är immunreaktiva20,21,22,23.
    2. Bedöma PR uttrycket som positivt om ≥ 1% av tumören cellkärnorna är immunreaktiva20,21,22,23.
    3. Bedöma det HER2 uttrycket som: (a) betyg 3 + om omkretsriktningen membran färgning som är komplett och intensiv, b) betyg 2 + om omkretsriktningen membran färgning är ofullständig eller svag/måttlig och > 10% av de invaderande tumörcellerna eller komplett och omkretsriktningen membran färgning är intensiv och inom ≤ 10% av invasiva tumörcellerna, c) poäng 1 + om ofullständiga membran färgning är svag/knappt märkbara och > 10% av invasiva tumörcellerna, d) negativa om ingen färgning är närvarande eller membran färgningen är ofullständig och svimma/knappt märkbara och inom ≤ 10% av den invasiv tumören celler3,24.
    4. Bedöma Ki67 index som procentandelen celler med nukleär färgning i minst 1000 neoplastiska celler slumpmässigt utvalda över 10 high-power fält (förstoring, 400 X)25.

4. SISH analys av HER2

  1. Skär TMA sektioner (Upprepa steg 3.1).
  2. Utföra SISH för HER2 med hjälp av en automatiserad immunostainer.
    1. Placera TMA glasen att analysera vid 60 ° C i 10 min.
    2. Starta immunostainer instrument och programvara.
    3. På vyn hem klicka på protokoll och sedan på Skapa/redigera protokoll.
    4. Välj ”U dubbla ISH CKT” förfarandet för att ändra den grundläggande mallen.
    5. Flagga ”torkning” i lista och ange temperaturen vid 63 ° C i 20 min.
    6. Flagga ”Cell Conditioning” i lista, sedan ”Cell luftkonditionering CC2”, och Ställ in temperaturen vid 86 ° C och inkubation tid på 4 min.
    7. Flagga CC2 Mild (cykel 1), Standard (cykel 2) och Extended (cykel 3) för 8 min, 12 min och 8 min, respektive.
    8. Flagga ”ISH-proteas 3” i rutan listan och ange inkubationstiden på 16 min.
    9. Välj sonderna HER2DNP och CHR17DIG och ange inkubationstiden på 6 h.
    10. Ställ in tvättmaskinen på 76 ° C i 8 min.
    11. Ställ in SISH multimer (SIL ISH DNP HRP) inkubationstiden på 32 min.
    12. Ställ in silver kromogen (SIL ISH DNP GM) inkubationstiden på 4 min.
    13. Ställ in röda multimer (röda ISH gräva AP) inkubationstid 24 min.
    14. Ställ in röda kromogen (röda ISH gräva FR) inkubationstiden på 8 min.
    15. Flagga ”Counterstaining” i lista, Välj ”HEMATOXYLIN II” och ange inkubationstiden på 8 min.
    16. Flagga ”efter Counterstaining” i lista, Välj ”BLÅELSE reagens” och ange inkubationstiden på 4 min.
    17. Upprepa stegen från 3.3.11-3.3.15 (Välj modifierad U dubbla ISH CKT protokoll).
    18. Öppna huven som täcker reagenser karusellen, placera tvätten och ISH detection system och Stäng huven.
    19. Upprepa steg från 3.3.18-3.3.21.
  3. Utföra SISH analys för HER2: bedöma HER2 genen förstärkning som positivt om HER2/CEP17 förhållandet är ≥2, 0 med en genomsnittlig HER2 kopia nummer ≥4.0 signaler per cell, och negativa om HER2/CEP17 förhållandet är < 2.0 med en genomsnittlig HER2 Kopiera nummer < 4.0 signaler eller deponicell3,24.
    Obs: Liknar IHC, denna analys bör utföras separat i diskreta vävnad fläckar av en patolog med erfarenhet av bröst patologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Totalt 444 invasiv bröstcancer Cancer införlivades i 15 TMAs särskilt optimerat för ISH analyser. Bland de 2 664 ställen som ingick i urvalet, 2 651 (99,5%) var representativ för de tidigare valda områdena och därför bli föremål för senare analyser. Intra-tumör heterogenitet bestämdes genom IHC och SIH, med särskilt fokus på de heterogena fördelningorna av HER2-positiva kloner i de olika topografiska områdena av tumörer. Tabell 3 skildrar de biologiska egenskaperna av fallen analyseras, med fokus på ER, PR, Ki67 och HER2 status inom olika histotypes. I synnerhet 18% av fallen konstaterades för att Visa HER2-positiva celler i > 10% av tumörcellerna, och därför matchas egenskaperna för bedömning av HER2-positivitet. Intressant, är detta värde närmare den nedre änden av de rapporterade incidensen utbud av HER2-positiv bröstcancer. Däremot, var den HER2-statusen variabel i de diskreta områdena av både HER2-positiv och HER2-negativ bröstcancer (figur 3, tabell 4), som tillhandahåller ytterligare tilltro till uppfattningen att bröstcancer är en mycket heterogen sjukdom vid genomisk nivå. Andelen misslyckande SISH analysen var 0,8%, med ett totalt antal 2 629/2 651 ställen där dinitrofenol-taggade sonden bunden till målet sekvenser.

Figure 1
Figur 1 : Representation av hörnsten faser i förverkligandet av en hög genomströmning plattform för analys av HER2 heterogenitet i stora kohorter av bröstcancer. (A) val av områden att provet bör inkludera identifiering och höjdpunkten på alla områden med Cytologisk, arkitektoniska, eller IHC heterogenitet. (B), en av de viktigaste stegen i detta förfarande är skapandet av en hög kvalitet acceptor block, eftersom även en mikroskopisk spricka kunde härleda samstämmigheten i de efterföljande i situ hybridisering analyserna. (C) det är viktigt att anställa en digitalt guidad arrayer med 1 mm diameter nål att konstruera högavkastande TMA bygger på Kononen teknik. (D) inrättandet av TMA projektet bör starta från definitionen av dimensionerna och gränsar av TMA. (E) alla IHC och ISH analyser bör utföras med hjälp av digital patologi verktyg för att snabbt navigera över TMA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Planimetriskt representation av den TMA insåg för detta protokoll. Ett totalt antal 180 ställen med 1 mm diameter, 500 µm mellanrum, möjliggör en optimal i situ -hybridisering. Tätare TMAs tillhandahåller improduktiva resultat när det gäller övergripande kvalitet och enhetlighet för reaktionerna över alla ställen, med en högre felfrekvens på en enda plats basis. Observera de ”orientering” ställen i topp - och mitten-vänster i rutnätet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Representativa micrographs visar silver i situ hybridisering analys av en HER2-heterogen bröstcancer. I denna paradigmatiska exempelvis två distinkta fläckar av en high-grade invasiv bröstcancer av ingen särskild typ (BR_121) visade olika resultat när det gäller HER2 genen (svart) förstärkning jämfört med centromeric uppräkning sonden 17 (röd). I synnerhet, ett område som hör till tumör kärnan och visar cytokeratin 7 oregelbundna färgningsmönster var HER2 förstärks (A), medan en enda plats framifrån invasiva (dvs, tumör kanten) visas en vildtyp HER2 mönstret (B). Skala barer = 50 µm (20 µm i inläggningar). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Ärende-ID Block-ID Områdes-ID Vävnad Topografi Morfologi ER PR Ki67 HER2 Andra funktioner i IHC
BR_121 A5 en Normal Kirurgisk marginal
BR_121 A1 en NST Tumör core G2 CK7 +
BR_121 A1 b NST Tumör core G3 CK7 + /-
BR_121 A3 en NST Tumör core Mucinous stroma 90 100 12 2 +
BR_121 A3 b NST Invasiva front Tubulär 100 100 35 2 +
BR_121 A4 en NST Invasiva front G3
BR_121 A3 c DCIS (EIC +) Anslutning till invasiv front Högvärdigt 100 100 45 2 +

Tabell 1: representativa post ett fall ingick i studien. Detta fall (BR_121) var en high-grade invasiva carcinom av ingen speciell typ med fokal myxoid stroma, visar en mindre tubulär komponent på peripheryen av lesionen och fokal-oregelbunden förlust av CK7 immunoexpression. De immunhistokemiska funktioner, inklusive biomarkörer rapportering, refererar till de analyser som utförs vid tidpunkten för diagnos. NST, invasiva carcinom ingen speciell typ; DCIS, duktal cancer in situ; EIC +, omfattande intraduktalt komponent; CK7, cytokeratin 7.

Markör Klon Företaget Utspädning Dewaxing Antigen retrieval Antikropp inkubation Poängsystem
ER SP1 Ventana RTU EZ prep vid 72 ° C CC1 vid 95 ° C för 36 min 16 min ASCO/CAP riktlinjer23
PR 1E2 Ventana RTU EZ prep vid 72 ° C CC1 vid 95 ° C för 36 min 17 min ASCO/CAP riktlinjer23
HER2 4B5 Ventana RTU EZ prep vid 72 ° C CC1 vid 95 ° C för 36 min 18 min ASCO/CAP riktlinjer3
Ki67 30-9 Ventana RTU EZ prep vid 72 ° C CC1 vid 95 ° C för 36 min 12 min Internationella Ki67 i bröstcancer arbetar gruppen rekommendationer25

Tabell 2: lista av antikroppar, kloner, utspädningar, antigen retrieval metoder och poängsystem som antagits för immunhistokemiska analyser. ER, östrogenreceptor; PR, progesteronreceptorn; RTU, färdiga att använda.

Tidstrender n (%) ER + (%) PR + (%) Ki67-låg (%) KI-67-hög (%) HER2 + (%)
Invasiva carcinom av ingen speciell typ 344 (77,5) 301 (87,5) 257 (74,7) 85 (24,7) 259 (75,3) 71 (20,6)
Invasiv lobulär cancer 53 (11,9) 53 (100,0) 44 (83,0) 36 (67,9) 17 (32,0) 4 (7,5)
Invasiva carcinom, blandad typ 9 (2.0) 8 (88,9) 6 (66,7) 0 (0,0) 9 (100,0) 1 (11,1)
Tubular carcinoma 8 (1,8) 8 (100,0) 8 (100,0) 8 (100,0) 0 (0,0) 0 (0,0)
Mucinous karcinom 11 (2,4) 11 (100,0) 9 (81,8) 7 (63,6) 4 (36,4) 0 (0,0)
Micropapullary karcinom 7 (1.6) 7 (100,0) 7 (100,0) 5 (71,4) 2 (28,6) 2 (28,6)
Invasiva carcinom med apocrine featueres 5 (1,1) 3 (60,0) 1 (20,0) 1 (20,0) 4 (80,0) 3 (60,0)
Papillär cancer 1 (0,2) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 1 (100,0) 0 (0,0)
Medullär cancer 4 (0,9) 0 (0,0) 1 (25,0) 0 (0,0) 4 (100,0) 0 (0,0)
Metaplastiska karcinom 2 (0,5) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 2 (100,0) 0 (0,0)
Totalt 444 391 (88,0) 333 (75,0) 142 (32,0) 302 (68,0) 81 (18,2)

Tabell 3: Breast cancer histotypes, receptor status och HER2 heterogenitet status. ER, östrogenreceptor; PR, progesteronreceptorn; Ki67-låg, Ki67 index < 18%. Ki67-hög, Ki67 > 18%.

Tolkningsbara neoplastiska ställen HER2-positiv ställen (%) Hormon receptorer status HER2-heterogena fall
6 5 (83) positivt 10
6 5 (83) negativa 1
6 4 (67) positivt 7
6 4 (67) negativa 1
6 2 (33) negativa 1
6 1 (17) positivt 1
5 3 (60) positivt 10
5 1 (20) positivt 2
4 3 (75) positivt 9
4 2 (50) positivt 8
4 1 (25) negativa 1
3 2 (67) positivt 5
3 1 (33) positivt 2
46 25 (54) 53 (93) 57

Tabell 4: HER2 uttryck, hormon receptor status och HER2-heterogena fall. Bland 57 HER2-heterogena fall var 4 (7%) fall ER-negativ och PR-negativ, bekräftar den kliniska betydelsen av bedömning av HER2 heterogenitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Här, har vi detaljerade strategier för laboratoriet att utföra SISH analyser av HER2 -genen och dess motsvarande Centromeren i högavkastande TMAs av heterogeneously bearbetade bröstcancer. Metoden är kostnadseffektiv och kan utföras i de flesta laboratorier för studien av HER2 genen förstärkning heterogenitet i stora kohorter av bröst cancer Hämtad form patologi arkiv.

På grund av den kliniska betydelsen av HER2 testning i bröstcancer och de utmaningar som genereras av dess heterogena uttryck, utvecklade vi en hög genomströmning tester protokoll för att bedöma intra - och inter - tumor HER2 genetisk heterogenitet. De analyserade områdena inkluderar pre invasiva och invasiva komponenter, på grundval av specifika Cytologisk, arkitektoniska och IHC funktioner.

I området i närheten finns det flera kritiska faser som bör hanteras försiktigt i detta protokoll. Ett viktigt steg är urvalet av regioner i intresse. Vi har fastställt att annotering av olika topografiska områden genom ett multidisciplinärt angreppssätt är avgörande för att säkerställa kvaliteten på den slutliga molekylära analysen. I synnerhet den gemensamma översynen av de diagnostiska bilderna utförs av en patolog och en tekniker öka enormt antalet lämpliga ställen (dvs, ställen som återspeglar området identifieras i bilden) och därefter minska andelen misslyckande singel-spots analysen. Dock kan flera tumör fläckar gå förlorade efter seriell avsnitt för flera IHC och ISH analyser. För att övervinna detta besvär, rekommenderar vi att konstruera TMAs i två eller tre exemplar, om alls möjligt baserat på vävnad tillgänglighet. Dessutom lyfter vi fram vikten av att definiera strikt laboratorierutiner för skapandet av acceptor FFPE block för TMAs. Faktiskt har vi observerat att en minimal spricka i blocket TMA kan härleda hela ISH analys när det gäller kvalitet, reproducerbarhet och tydlighet av reaktionen. Om sprickor uppstår, inte blocket givare bör beaktas för TMA konstruktion. Det bör erkännas, dock att IHC kunde utföras även i suboptimala TMAs, och inga tecken på tekniska problem under sådan analys har observerats hos vår erfarenhet.

Trots att detta protokoll är särskilt optimerat för HER2 SISH analyser av högavkastande bröst TMAs, det är att notera att andra analyser, såsom fisk och IHC, kan tillförlitligt utförs i flera vävnadstyper av, som tidigare beskrivits14, 19,26. Dock har vi häri definierat idealisk antalet ställen och topografiska kännetecken av TMA att säkerställa hög kvalitet och reproducerbara SISH analyser av HER2 -genen i bröst cancer exemplar. En annan väsentlig punkt representeras av en ny utformning av standardprotokoll automatiserade SISH att matcha egenheten att de flera proverna som ska analyseras. Faktiskt, tillverkarnas riktlinjer görs i allmänhet för molekylära analyser av konventionella heltäckande ansiktsskydd sektioner och är därför inte kunna nå höga standarder på heterogeneously bearbetade vävnader prover, såsom i TMAs från arkivens FFPE-block. I detta syfte har vi tillhandahållit en stegvis beskrivning av ett pålitligt anpassade protokoll för SISH analyser i dessa problematiska prover.

Det vore mycket fördelaktigt att utforska heterogenitet HER2 uttryck och gen amplifiering i respekt till en heterogen fördelning av andra kliniskt angripbara molekylära markörer i bröstcancer. I detta syfte behövs translationell forskning ytterligare studier att utforska giltigheten av vår metod för andra kliniskt relevanta molekylära analyser, såsom matrix-assisted laser desorption/jonisering masspektrometri imaging (MALDI-MSI)27. Nyligen har blivit förvaltningen av FFPE vävnader för MALDI-MSI analys möjlig, om än utmanande. Denna i situ proteomiska teknik möjliggör visualisering av den rumsliga fördelningen av proteiner och peptider i patologiska vävnadssnitt, inklusive bröstcancer.

Detta protokoll har flera kritiska steg som kan potentiellt störa den slutliga analysen. Första, särskild uppmärksamhet bör ägnas mot de olika mekanismerna bakom HER2 förstärkning. Kromosom 17 polysomy är exempelvis en genetisk avvikelse som kan uppstå i bröst cancer11, som representerar ett välkänt alternativ mekanism för ökad HER2 kopienumret. Detta tillstånd, kan om än inte frekventa, påverka inte bara cancer biologiska funktioner och patienthantering men också ISH analyserna. För det andra har det beskrivits att intra-tumör genetisk heterogenitet uppstår också på en enskild cell nivå och inte bara i olika neoplastiska områden. Detta protokoll är inte kunna öka upptäckt kraften i detta särskilda villkor jämfört med heltäckande ansiktsskydd sektioner. Dessutom är det viktigt att framhålla att TMA-baserade studien av rumslig heterogenitet har vissa inneboende begränsningar, inklusive avsaknaden av en omfattande analys av hela avsnittet. Denna studie dock övervägas ett proof-of-principle att heterogenitet av HER2 genen förstärkning kan bedömas med hjälp av en hög genomströmning och kostnadseffektiv plattform, med vanlig laboratorieutrustning. Ytterligare studier analysera seriell heltäckande ansiktsskydd sektioner av HER2-heterogena fall, tillsammans med banbrytande molekylära studier och patienternas kliniska data kommer att behöva verifiera detta protokoll.

Sammanfattningsvis, bör omfattande kartläggning av HER2-status i heterogena HER2 breast cancer prover och utredning av potentiella driver genetiska mutationer i HER2-negativ komponenter lita på en analys av flera neoplastiska regioner. Denna analys skulle kräva outhärdlig kostnader och insatser med hjälp av diagnostiska standardfaciliteter. Denna metod representerar ett tillförlitligt verktyg för samtidiga karakterisering av HER2 genetisk heterogenitet i stora uppsättningar av flera och heterogeneously bearbetade bröstcancer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Ingen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgipath Paraplast Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU 39601006 Tissue embedding medium, 56 °C melting point
Eosin Y  1% water solution Bio Optica, Milan, Italy, EU 510002 Eosin yellowish, water-soluble
Carazzi’s hematoxylin Bio Optica, Milan, Italy, EU 506012 Alum hematoxylin ripened using potassium iodate
Diamond quality Laboindustria, Arzergrande, Italy, EU 33533 26x76 mm microscope slides
Leica CV Mount Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU 14046430011 Mounting medium, with no monomers, based on polymers of butylmethacrylate in xylene
FLEX IHC microscope slides Agilent Technologies (Dako),  Santa Clara, CA, USA K8020 Coated microscope slides for adhesion of FFPE for use in IHC
BenchMark ULTRA Ventana medical system, Tucson, AZ, USA N750-BMKU-FS Slide staining system
CONFIRM anti-Estrogen Receptor (ER) (SP1) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4324 Primary antibody, ready-to-use
CONFIRM anti-Progesterone Receptor (PR) (1E2) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-2223 Primary antibody, ready-to-use
CONFIRM anti-Ki-67 (30-9) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4286 Primary antibody, ready-to-use
PATHWAY HER2 (4B5) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4493 Primary antibody, ready-to-use
ultraView Universal DAB Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-500 Indirect, biotin-free system for detecting mouse IgG, mouse IgM and rabbit primary antibodies
INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4422 INFORM HER2 Dual ISH assay - Dual color in situ hybridization FDA approved automated assay for determining HER2 gene status in breast cancer patients 
ultraView Silver ISH DNP Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 800-098
ultraView Red ISH DIG Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 800-505
ISH Protease 3 Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4149 Used in the ISH process to remove protein that surrounds the target DNA sequences of interest
Hematoxylin Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-2021 Modified Gill's hematoxylin counterstain reagent
Hematoxylin II Counterstaining Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-2208 Modified Meyer's hematoxylin counterstain reagent
Bluing reagent Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-2037 Aqueous solution of buffered lithium carbonate for bluing hematoxylin stained sections on glass slides
HybReady Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4409 Formamide-based buffer for ISH assays
EZ Prep (10x) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-102 Concentrate solution for paraffin removal from tissue samples during IHC and ISH reactions, and to dilute 1:10.
SSC Buffer (10X) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-110 Sodium Chloride Sodium Citrate buffer solution is used for stringency washes and to rinse slides between staining steps and provide a stable aqueous environment for the in situ hybridization reactions. Dilute 1:5.
ULTRA LCS Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 650-210 Prediluted (ready-to-use) coverslip solution used as a barrier between the aqueous reagents and the air to prevent evaporation in the IHC and ISH reactions
Reaction Buffer (10x) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-300 Tris based buffer solution (pH 7.6 ± 0.2) to rinse slides between staining steps during IHC and ISH. Dilute 1:10.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-223 Pretreatment steps in the processing of tissue samples during IHC and ISH. Ready to use.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC1) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-224
ultraView Silver Wash II Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-003 Ready-to-use solution to rinse slides between IHC and ISH staining steps
Microtome Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU RM 2255 Automated rotary microtome
Multistainer Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU ST 5020 Workstation for automated staining and coverslipping
Minicore 1 Alphelys, Plaisir, France, EU 00-MICO-1 Semi-automatic arrayer for TMA contruction with TMA Designer 2 embedded software
Aperio ScanScope CS2 Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU K080254 Image capture device - digital pathology scanner
Tissue-Tek III Uni-Cassette Sakura Finetek Europe B.V 4135 Cassette
Tissue-Tek Paraform Standard Base Mold Sakura Finetek Europe B.V 7055 Stainless-Steel base metal mold

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Allison, K. H., Dintzis, S. M., Schmidt, R. A. Frequency of HER2 heterogeneity by fluorescence in situ hybridization according to CAP expert panel recommendations: time for a new look at how to report heterogeneity. Am J Clin Pathol. 136, (6), 864-871 (2011).
  2. Montemurro, F., Scaltriti, M. Biomarkers of drugs targeting HER-family signalling in cancer. J Pathol. 232, (2), 219-229 (2014).
  3. Wolff, A. C., et al. Recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer: American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists clinical practice guideline update. J Clin Oncol. 31, (31), 3997-4013 (2013).
  4. Ng, C. K., Pemberton, H. N., Reis-Filho, J. S. Breast cancer intratumor genetic heterogeneity: causes and implications. Expert Rev Anticancer Ther. 12, (8), 1021-1032 (2012).
  5. Vance, G. H., et al. Genetic heterogeneity in HER2 testing in breast cancer: panel summary and guidelines. Arch Pathol Lab Med. 133, (4), 611-612 (2009).
  6. Murthy, S. S., et al. Assessment of HER2/Neu status by fluorescence in situ hybridization in immunohistochemistry-equivocal cases of invasive ductal carcinoma and aberrant signal patterns: a study at a tertiary cancer center. Indian J Pathol Microbiol. 54, (3), 532-538 (2011).
  7. Ohlschlegel, C., Zahel, K., Kradolfer, D., Hell, M., Jochum, W. HER2 genetic heterogeneity in breast carcinoma. J Clin Pathol. 64, (12), 1112-1116 (2011).
  8. Chang, M. C., Malowany, J. I., Mazurkiewicz, J., Wood, M. 'Genetic heterogeneity' in HER2/neu testing by fluorescence in situ hybridization: a study of 2,522 cases. Mod Pathol. 25, (5), 683-688 (2012).
  9. Bartlett, A. I., et al. Heterogeneous HER2 gene amplification: impact on patient outcome and a clinically relevant definition. Am J Clin Pathol. 136, (2), 266-274 (2011).
  10. Seol, H., et al. Intratumoral heterogeneity of HER2 gene amplification in breast cancer: its clinicopathological significance. Mod Pathol. 25, (7), 938-948 (2012).
  11. Hanna, W. M., et al. HER2 in situ hybridization in breast cancer: clinical implications of polysomy 17 and genetic heterogeneity. Mod Pathol. 27, (1), 4-18 (2014).
  12. Sanguedolce, F., Bufo, P. HER2 assessment by silver in situ hybridization: where are we now? Expert Rev Mol Diagn. 15, (3), 385-398 (2015).
  13. Fusco, N., et al. The Contrasting Role of p16Ink4A Patterns of Expression in Neuroendocrine and Non-Neuroendocrine Lung Tumors: A Comprehensive Analysis with Clinicopathologic and Molecular Correlations. PLoS One. 10, (12), e0144923 (2015).
  14. Albanghali, M., et al. Construction of tissue microarrays from core needle biopsies - a systematic literature review. Histopathology. 68, (3), 323-332 (2016).
  15. Navani, S. Manual evaluation of tissue microarrays in a high-throughput research project: The contribution of Indian surgical pathology to the Human Protein Atlas (HPA) project. Proteomics. 16, (8), 1266-1270 (2016).
  16. Fusco, N., et al. HER2 in gastric cancer: a digital image analysis in pre-neoplastic, primary and metastatic lesions. Mod Pathol. 26, (6), 816-824 (2013).
  17. Amin, M. B., et al. AJCC Cancer Staging Manual. Eight, Springer International Publishing. (2017).
  18. Lakhani, S. R., Ellis, I. O., Schnitt, S. J., Tan, P. H., van de Vijver, M. J. WHO Classification of Tumours of the Breast. 4th, IARC press. (2012).
  19. Kononen, J., et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat Med. 4, (7), 844-847 (1998).
  20. Fusco, N., et al. Resolving quandaries: basaloid adenoid cystic carcinoma or breast cylindroma? The role of massively parallel sequencing. Histopathology. 68, (2), 262-271 (2016).
  21. Fusco, N., et al. Genetic events in the progression of adenoid cystic carcinoma of the breast to high-grade triple-negative breast cancer. Mod Pathol. 29, (11), 1292-1305 (2016).
  22. Fusco, N., et al. Recurrent NAB2-STAT6 gene fusions and oestrogen receptor-α expression in pulmonary adenofibromas. Histopathology. 70, (6), 906-917 (2017).
  23. Hammond, M. E., et al. American Society of Clinical Oncology/College Of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer. J Clin Oncol. 28, (16), 2784-2795 (2010).
  24. Fusco, N., Bosari, S. HER2 aberrations and heterogeneity in cancers of the digestive system: Implications for pathologists and gastroenterologists. World J Gastroenterol. 22, (35), 7926-7937 (2016).
  25. Dowsett, M., et al. Assessment of Ki67 in breast cancer: recommendations from the International Ki67 in Breast Cancer working group. J Natl Cancer Inst. 103, (22), 1656-1664 (2011).
  26. Dekker, T. J., et al. Determining sensitivity and specificity of HER2 testing in breast cancer using a tissue micro-array approach. Breast Cancer Res. 14, (3), R93 (2012).
  27. De Sio, G., et al. A MALDI-Mass Spectrometry Imaging method applicable to different formalin-fixed paraffin-embedded human tissues. Mol Biosyst. 11, (6), 1507-1514 (2015).
Bygga upp en High-throughput Screening plattform att bedöma heterogenitet HER2 genen amplifiering i bröstcancer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ercoli, G., Lopez, G., Ciapponi, C., Corti, C., Despini, L., Gambini, D., Runza, L., Blundo, C., Sciarra, A., Fusco, N. Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers. J. Vis. Exp. (130), e56686, doi:10.3791/56686 (2017).More

Ercoli, G., Lopez, G., Ciapponi, C., Corti, C., Despini, L., Gambini, D., Runza, L., Blundo, C., Sciarra, A., Fusco, N. Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers. J. Vis. Exp. (130), e56686, doi:10.3791/56686 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter