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Immunology and Infection

Construindo uma plataforma High-throughput Screening para avaliar a heterogeneidade da amplificação do Gene HER2 no câncer de mama

doi: 10.3791/56686 Published: December 5, 2017

Summary

Distribuição heterogênea de células HER2-positivo pode ser observada em um subconjunto dos cancros da mama e gera dilemas clínicas. Aqui, apresentamos um protocolo confiável e econômico para definir, quantificar e comparar a heterogeneidade genética de HER2 intra-tumor em uma grande série de cancros da mama de forma heterogénea transformados.

Abstract

Terapias alvo contra o receptor do fator de crescimento epidérmico humano (HER2) de 2 mudaram radicalmente os resultados dos pacientes com câncer de Mama HER2-positivo. No entanto, uma minoria de casos exibe uma distribuição heterogênea de células HER2-positivo, que gera grandes desafios clínicos. Até à data, não há protocolos confiáveis e padronizados para a caracterização e quantificação de amplificação de gene HER2 heterogênea em grandes coortes têm sido propostos. Aqui, apresentamos uma metodologia de alta produtividade para avaliar simultaneamente o status HER2 em diferentes áreas topográficas de vários cancros da mama. Em particular, ilustramos o procedimento laboratorial para construir aprimorado os microarrays do tecido (TMAs) incorporando um mapeamento alvo dos tumores. Todos os parâmetros TMA foram otimizados especificamente para a prata em situ da hibridação (SISH) de formalina-parafina (FFPE) mama tecidos fixados. Análise imunohistoquímica de biomarcadores os prognósticos e preditivos (isto é, ER, PR, Ki67 e HER2) deve ser realizada utilizando procedimentos automatizados. Um protocolo personalizado de SISH foi implementado para permitir uma análise molecular de alta qualidade através de vários tecidos que passou por diferentes procedimentos de fixação, processamento e armazenamento. Neste estudo, nós fornecemos um prova de princípio que sequências específicas de DNA pode ser câncer de mama de forma heterogénea transformados e simultaneamente localizadas em áreas topográficas distintas de múltiplos usando um método eficiente e econômico.

Introduction

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HER2 é um proto-oncogene que é overexpressed e amplificado em 15-30% de mama invasivo todos os cancros1,2. Superexpressão de HER2 é inferido pela presença de > 10% células com membrana forte imuno-histoquímica (IHC) coloração (3 +), enquanto a amplificação do gene pode ser avaliada quando a proporção de HER2/Centrómero é ≥2 ou o número de cópia do gene é ≥ 6, na contagem de pelo menos 20 células por em situ da hibridação (ISH)3.

Heterogeneidade genética intra-tumor tem sido amplamente descrita em cânceres de mama, sendo um contribuinte potencialmente adverso para avaliação de biomarcadores e tratamentos resposta4. De acordo com a faculdade de americana patologistas (CAP), HER2 heterogeneidade existe se HER2 é amplificado em > 5% e < 50% do tumor infiltrando-se células5. Lamentavelmente, a incidência real da heterogeneidade espacial HER2 no câncer de mama continua a ser um assunto de controvérsia entre os patologistas, com alguns autores de manutenção que é um evento extremamente raro e outros, sugerindo que até 40% dos casos são HER2-heterogêneos1,5,6,7,8,9,10. Apesar dos mecanismos biológicos subjacentes a esta condição não são ainda totalmente esclarecido, os impactos clínicos e prognósticos da heterogeneidade de HER2 intra-tumor são cruciais para a de pacientes de câncer de mama11.

Recentemente, técnicas moleculares brilhante-campo, tais como o cromogênico ISH (CISH) e prata ISH (SISH), têm emergido como métodos confiáveis para detectar heterogeneidade HER2 em tecidos FFPE, com algumas vantagens em comparação com fluorescente ISH (FISH)12. Lamentavelmente, a análise em massa dos casos simples continua a ser impraticável em estudos de coorte-grande investigação. Vários grupos têm sugerido que a combinação da histoquímica, IHC e ISH com tecnologias TMA poderia representar uma estratégia valiosa no estudo de câncer biologia13,14,15,16. Com este método amplamente adotado, amostras de tecido de diferentes pacientes analisáveis simultaneamente, minimizando o tecido e os reagentes empregados e, assim, fomentar a análise uniforme de uma grande série de casos14. No entanto, não há protocolos estão disponíveis para a caracterização molecular de elevado-produção simultânea de múltiplas amostras de tecido que foram submetidos a diferentes de processamento em termos de reagentes, tempos de fixação e métodos de conservação empregados, tais como arquivamento blocos.

Tendo em conta as implicações clínicas e prognósticos da heterogeneidade espacial HER2 no câncer de mama, desenvolvemos uma plataforma integrada de molecular para avaliá-la em grande série de casos de forma heterogénea transformados. Aqui, podemos retratar as estratégias de laboratório para gerar e analisar a heterogeneidade intra-tumor de amplificação do HER2 em alto rendimento TMAs do câncer de mama por meio de SISH. O protocolo a seguir foi desenvolvido para medir os tumores > 5 mm (> pT1b de acordo com o TNM 2017)17. Para lesões menores, recomendamos realizar a análise em seções seriais Full-face. Nosso processo permite a análise simultânea de IHC e SISH até 30 dos cancro da mama, englobando uma média de 6 áreas distintas (intervalo de 4-8) para cada caso. No total, 180 núcleos de tecido de 1 mm de diâmetro, com 500 µm entre os núcleos e 2 mm entre a grade e bordas serão gerados para cada bloco TMA.

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Protocol

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Este estudo foi aprovado pelas placas de revisão institucional da IRCCS Ca' Granda Foundation, Hospital Policlínico, Milão, Itália.

1. seleção de pacientes e espécimes de tecido

  1. Recuperar os slides arquivamento de todos os casos a serem analisados, incluindo todos os disponível hematoxilina e eosina (H & E) e slides de IHC do diagnóstico original e, se estiver presente, um H & E de correspondem tecido mamário não-neoplásicos (por exemplo, margem cirúrgica) .
  2. Execute avaliações de caso.
    Nota: Para esta tarefa, pelo menos dois patologistas com experiência em patologia mamária devem discutir os diagnósticos slides e resolver as divergências colegiadamente. Use um microscópio convencional ou ferramentas de telepathology (este último em estudos multicêntrico a favor). Se for o caso, exclua todos os casos discordantes.
    1. Realize a reclassificação histológica de todos os casos de acordo com a edição mais recente da classificação da Organização Mundial de saúde (OMS) de tumores de mama18.
    2. Certifique-se de que o tecido normal para cada caso, se estiver presente nas amostras clínicas de arquivamento, é composto pelo menos uma unidade ductal lobular terminal não-neoplásicos.
    3. Identificar todas as áreas tumorais que mostram heterogêneas citológicos, arquitectónico, ou características IHC, usando um microscópio de campo claro (a ser realizada em conjunto por uma patologista e o technician(s) quem vai construir os TMAs).
  3. Destaca as áreas topográficas discretas com um marcador sobre a lâmina de vidro ou com a ferramenta apropriada em um software de digital slide (figura 1A).
  4. Com base nos slides selecionados, recupere os blocos FFPE correspondentes a partir dos arquivos.
    Nota: Para otimizar a TMA construção, para evitar a depleção de tecido e para preservar o TMA socar integridade estrutural, casos com < 1 mm de espessura tecido residual deve ser excluído.

2. projetar e construir TMAs baseadas na técnica Kononen

  1. Criar e abrir um novo arquivo de planilha, incorporando os registros das áreas distintas de cada caso. Incluir os seguintes dados em colunas separadas, como exemplificado na tabela 1: caso ID, ID de bloco, área ID, tipo de tecido (por exemplo, tecido normal, histotype componente invasivo, em situ histotype de componente), topografia (e.g., núcleo do tumor, parte dianteira invasiva), morfologia (por exemplo, grau nuclear, arquitetura, mitoses, características citológicas), status de biomarcadores (ou seja, receptor de estrógeno (ER), receptores de progesterona (PR), Ki67 e HER2) e todas as outras características IHC disponíveis.
    1. Salve o documento.
  2. Crie um projeto TMA.
    1. Instalar e abrir o software de design de TMA.
    2. Definir o destinatário TMA bloco (s): acesso através do menu Arquivo > Novo > bloco ou usando CTRL + B.
    3. Clique no primeiro campo para preencher ou pressione a tecla Tab e digite em dimensões do bloco de parafina: 35 (mm), altura 20 (mm) de largura. Tipo "2" como o valor da "margem" (ou seja, distância da borda de parafina em mm) (figura 1B). Salve os dados clicando no botão apropriado. O novo modelo de destinatário bloco agora é salvo e pronto para ser usado em modelos de matriz de tecido novo.
    4. Criar um projeto de matriz de tecido: acesso ao menu Arquivo > Novo > matriz de tecido ou usando CTRL + T.
    5. Preencher em nome da matriz de tecido, comentários e autor e, em seguida, clique em "next". Clique no ícone de "importação", escolher o arquivo de modelo de bloco destinatário criado anteriormente e clique em "next".
    6. Escolha 1 mm como o tamanho de ponto, clicando o botão redondo. Escolha a 500 µm como espaçamento local, que é o espaço entre dois centros de manchas vizinhas. Clique no ícone da calculadora para calcular o número total de spots criados, que deve ser 231. Clique em "next".
    7. Defina o modo de numeração ponto clicando uma vez nele. Clique no botão "definir" para criar grades e redes de sub. Apagar a linha central (linha 6) e as colunas 8 e 15. Manter 3 pontos da linha 1 para orientação. O mapa final deverá abranger um número total de 183 pontos, conforme representado na Figura 2.
    8. Definir a lista de tipos de tecido: acesso através do menu Arquivo > Novo > lista de tipos de tecido ou usando CTRL + L.
    9. Inserir as descrições de tecido previamente definidas. Pressione a seta para baixo ou clique sobre o botão + para adicionar uma linha.
    10. Definir o projeto: acesso através do menu Arquivo > Novo > projeto de Booster ou usando CTRL + P.
    11. Preencher em nome da matriz de tecido, comentários e autor e, em seguida, clique em "next". Importe o arquivo de folha de cálculo, lista de tipos de tecido e o modelo de matriz de tecido previamente criado clicando os ícones adequados.
    12. Clique em "selecionar tudo" e definir o número de pontos para cada tipo de tecido; Clique no botão de "partida" para aplicar as configurações. Aparecerá uma tabela que lista o número total de núcleos que serão amostrados e transferido para o destinatários blocos neste projeto. Salve o projeto e fechar o programa.
  3. Prepare os aceitador de blocos (figura 1B).
    1. Preencher os moldes de metal limpos com elasticized parafina a 65 ° C.
    2. Deixe os blocos de parafina arrefecer à temperatura ambiente durante a noite dentro dos moldes de metal.
    3. Extrai os blocos de parafina dos moldes de metal. Se ocorrerem rachaduras, descartar o bloco e repita etapas 2.3.1-2.3.3.
  4. Construa o TMA usando um arrayer automático ou semi-automático de19.
    1. Recupere blocos FFPE todos selecionados e as seções correspondentes a H & E com anotações.
    2. Ativar o arrayer e inserir o bloco (s) aceitador no carrossel arrayer.
    3. Abra o software de estação de controle de arrayer, clique em "Nova matriz de tecido" e carregar o projeto criado anteriormente (Figura 1).
    4. Clique em "Continuar" e selecione a posição dos blocos doador do menu.
    5. Definir a posição inicial para cada bloco de destinatário: use as teclas de seta para mover a luz do laser e alinhá-lo com a borda superior esquerda na parafina do bloco de destinatário.
    6. Clique em "next" e repita para o alinhamento vertical.
    7. Clique em "Avançar" para automaticamente criar um buraco no quadrante definido anteriormente do bloqueio de destinatários (aceitador).
    8. Esvazie o soco.
    9. Posicione o bloco de doador para amostragem e remover um núcleo de tecido da área anteriormente anotada de interesse.
    10. Inserir o núcleo do tecido doador no orifício de bloqueio de destinatários (aceitador).
    11. Remova o bloco de doador do arrayer.
    12. Repita etapas 2.4.5-2.4.11 até o TMA é concluído.
  5. Coloque o lado do tecido do bloco recém-gerado TMA em um slide em branco estéril e colocá-los no forno laboratório a 45 ° C por 5 min.
  6. Pressione suavemente o bloco do slide para 5 s para achatar os núcleos de tecido. Repita uma vez (para um total de 2 vezes).
  7. Retire o bloco TMA juntamente com o slide do forno, lançá-los e delicadamente Retire o bloco a partir do slide.
  8. Cubra a superfície do tecido TMA com uma fina camada de parafina elasticized a 65 ° C.
  9. Deixe o bloco TMA em temperatura ambiente por 2 h.
  10. Transferência do bloco TMA a 4 ° C por 24 h.
    Nota: O bloco do TMA pode ser armazenado a 4 ° C até a exaustão.

3. histochemical e análises imuno-histoquímica

  1. TMA seções de corte.
    1. Coloque o bloco (s) aceitador TMA com parafina-lado para baixo sobre uma superfície de-10 ° C por 10 min acalmar a parafina.
    2. Encher uma banheira de flutuação com água ultrapura e definir o calor de 38 ° C.
    3. Coloque uma lâmina nova em um micrótomo rotativo e insira o bloco no mandril micrótomo para que o bloco de cera enfrenta a lâmina e é alinhado no plano vertical.
    4. Aproximar o bloco cuidadosamente com a lâmina e cortar algumas secções finas para garantir que o posicionamento está correto; ajuste se necessário.
    5. 3 µm de espessura seções de corte.
    6. Pegar as seções usando uma pinça e eles flutuam na superfície da água de banho.
    7. Escolha as seções fora o banho de água em lâminas de vidro regular e IHC/ISH.
    8. Coloque os slides em uma cremalheira e armazená-los no forno a 45 ° C durante a noite.
      Nota: Uma vez preparados, as seções TMA devem ser manchadas dentro de 24 h.
  2. Executar a coloração histoquímicos (H & E) usando um autostainer.
    1. Insira os slides no rack autostainer e colocá-los a 60 ° C por 10 min.
    2. Abra a gaveta de carga do autostainer e insira que o cesto com o TMA desliza em uma das estações de carga com um clipe de H & E padrão voltado para fora.
    3. Uma vez que a gaveta está fechada, o clipe será automaticamente reconhecido pelo sistema e começará o seguinte protocolo: Estação de forno em 37 ° C (6 min), xileno (2 min), xileno (2 min), 100% de etanol (2 min), 100% de etanol (2 min), etanol 95% (2 min), etanol 95% (2 min) , destilada água (4 min), hematoxilina de Carazzi (9 min), água corrente de baixa pressão (2 min), eosina 1% (1 min), água corrente de baixa pressão (2 min), etanol 95% (20 s), etanol 95% (20 s), etanol 95% (20 s), etanol 95% (20 s), 100% de etanol (15 s), 100% de etanol (15 s) , xileno (30 s), xileno (30 s).
    4. Descarregue os cestos da gaveta e montar o slide com uma lamela.
      1. Coletar uma gota de montagem com uma pipeta e colocá-lo em uma borda exterior de deslizar a tampa.
      2. Coloque do lado molhado da lamínula no slide e deixe a montagem secar por 30 min.
  3. Realizar a coloração de IHC para ER, PR, Ki67 e HER2 usando um immunostainer automatizado.
    Nota: Antes de iniciar uma corrida de coloração, iniciar o sistema e verificar os frascos de reagente de consumíveis (Tabela de materiais) e contentor de lixo.
    1. Coloque os slides TMA para analisar a 60 ° C por 10 min.
    2. Começa o instrumento de immunostainer e software.
    3. Para o Vista Home, clique no botão de protocolos e clique em criar/editar protocolos.
    4. Selecione o padrão DAB (3, 3'-diaminobenzidine) procedimento IHC para modificar o modelo básico.
    5. Sinalizador "Deparaffinization" na lista da caixa e regule a temperatura do meio a 72 ° C.
    6. Bandeira de solução de desmascarar o cc1, definir a temperatura média em 95 ° C e o tempo de incubação a 36 min.
    7. Bandeira da caixa do anticorpo primário, inserir o ID do distribuidor ER inline (o software do instrumento reconhecerá o distribuidor no carrossel reagente) e definir o tempo de incubação em 16 min.
    8. Bandeira de caixa Counterstaining, selecione hematoxilina eu e definir o tempo de incubação em 12 min.
    9. Clique no botão "Salvar como" e o nome do protocolo.
    10. Repita as etapas 3.3.3-3.3.9 para os anticorpos restantes usando os seguintes tempos de incubação de anticorpos primários: PR 16 min, Ki67 16 min e HER2 12 min. usam anticorpos pré-diluídos ready-to-use (RTU).
    11. Para o Vista Home, clique no botão criar rótulo.
    12. Clique no botão de protocolos e adicione os protocolos de ER, PR, Ki67 e HER2 para cada um do TMA para analisar.
    13. Clique no botão fechar /Print.
    14. Como o modelo de rótulo aparece, digite as identificações de TMA para o rótulo.
    15. Clique no botão Imprimir para imprimir as etiquetas e aplique-os nas corrediças de TMA.
    16. Clique no ícone do instrumento e definir o modo de inicialização do instrumento como "Pronto".
    17. Abra o capô que cobre o carrossel de reagentes, coloque o sistema de detecção e anticorpos primários, em seguida, feche o capô.
    18. Clique no botão frontal em uma gaveta deslizante para abri-lo, carregar os slides TMA e fechar a gaveta, clicando no mesmo botão.
    19. Definir o modo de inicialização do instrumento como "funcionando" e siga as instruções.
    20. No final do executar, descarregar o TMA slides pressionando o aberto todas as gavetas com enxágue e botão concluído Slides sobre o instrumento de controlo de deslize-os em aquecer água e sabão para remover qualquer reagentes remanescentes.
    21. Lavar os slides sob água corrente fria de baixa pressão, desidratam corrediças de TMA e uma lamela de vidro para cada slide.
  4. Realizar análise IHC da ER, PR e HER2 seguindo a sociedade americana de oncologia clínica (ASCO) / tampão diretrizes e de Ki67 de acordo com as recomendações do Ki67 internacional no grupo de trabalho de câncer de mama (tabela 2).
    Nota: Esta análise deve ser realizada separadamente nos pontos discretos de tecido por um patologista com experiência em patologia mamária.
    1. Avalie a expressão de ER como positivo se ≥ 1% dos núcleos de células do tumor são imunorreativas20,21,22,23.
    2. Avalie a expressão de PR como positivo se ≥ 1% dos núcleos de células do tumor são imunorreativas20,21,22,23.
    3. Avaliar a expressão de HER2 como: a) marcar 3 + membrana circunferencial coloração que é completa e intensa, b) marcar 2 + se a coloração de membrana circunferencial é incompleta e/ou fraco/moderado e dentro > 10% das células do tumor invasivo ou completa e coloração de membrana circunferencial é intensa e ≤ 10% das células do tumor invasivo, c) marcar 1 + coloração de membrana incompleta é fraco/quase imperceptível e dentro > 10% das células do tumor invasivo, d) negativo se nenhuma mancha está presente ou membrana a coloração é incompleto e fraco/quase imperceptível e dentro ≤ 10% do tumor invasivo células3,24.
    4. Avaliar o índice Ki67 como a percentagem de células com coloração nuclear pelo menos 1.000 células neoplásicas aleatoriamente selecionado mais de 10 campos de alta potência (ampliação, 400 X)25.

4. SISH análise de HER2

  1. Seções TMA (repita o passo 3.1) de corte.
  2. Execute SISH para HER2 usando um immunostainer automatizado.
    1. Coloque os slides TMA para analisar a 60 ° C por 10 min.
    2. Começa o instrumento de immunostainer e software.
    3. Para o Vista Home, clique no botão de protocolos e clique em criar/editar protocolos.
    4. Selecione o procedimento "U Dual ISH CKT" para modificar o modelo básico.
    5. Sinalizador "Secagem" na lista da caixa e definir a temperatura a 63 ° C por 20 min.
    6. Na lista da caixa, então "célula condicionado CC2", bandeira "Célula condicionado" e definir a temperatura em tempo de incubação e 86 ° C em 4 min.
    7. Bandeira CC2 suave (ciclo 1), norma (ciclo 2) e Extended (ciclo 3) por 8 min, 12 min e 8 min, respectivamente.
    8. Sinalizador "ISH-Protease 3" na lista da caixa e defina o tempo de incubação em 16 min.
    9. Selecione as sondas HER2DNP e CHR17DIG e defina o tempo de incubação em 6 h.
    10. Defina a lavagem a 76 ° C durante 8 min.
    11. Defina o tempo de incubação SISH multimer (SIL ISH DNP HRP) em 32 min.
    12. Defina o tempo de incubação de prata cromogénio (SIL ISH DNP CRHC) em 4 min.
    13. Defina o tempo de incubação multimer vermelho (vermelho ISH CAVAR AP) em 24 min.
    14. Defina o tempo de incubação de cromogénio vermelho (vermelho ISH CAVAR FR) em 8 min.
    15. Bandeira "Counterstaining" na lista da caixa, selecione "HEMATOXILINA II" e defina o tempo de incubação em 8 min.
    16. Bandeira "pós-Counterstaining" na lista da caixa, selecione "BLUING reagente" e defina o tempo de incubação em 4 min.
    17. Repita as etapas de 3.3.11-3.3.15 (modificado de selecionar protocolo U Dual ISH CKT).
    18. Abra o capô que cobre o carrossel de reagentes, coloque a roupa e os sistemas de detecção de ISH e, em seguida, feche o capô.
    19. Repita as etapas de 3.3.18-3.3.21.
  3. Realizar análise SISH para HER2: avaliar a amplificação do gene HER2 positiva se a relação de /CEP17 do HER2é ≥ 2.0 com uma média HER2 cópia número ≥4.0 sinais por célula e negativo se a relação de /CEP17 do HER2é < 2.0 com uma média de HER2 copiar número < 4.0 sinais/célula3,24.
    Nota: Similar ao IHC, esta análise deve ser realizada separadamente nos pontos discretos de tecido por um patologista com experiência em patologia mamária.

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Representative Results

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Em geral, 444 mama invasivo cânceres foram incorporados em 15 TMAs especificamente otimizados para análises ISH. Entre os 2.664 pontos amostrados, 2.651 (99,5%) eram representativas das áreas previamente selecionadas e, portanto, considerado favorável para análises subsequentes. Heterogeneidade de intra-tumor foi determinada por meio de IHC e SIH, com particular ênfase para as distribuições heterogêneas de clones de HER2-positivo nas áreas topográficas distintas dos tumores. Tabela 3 mostra as características biológicas dos casos analisados, focando o status de ER, PR, Ki67 e HER2 dentro de diferentes histotypes. Em particular, 18% dos casos foram encontrados para exibir células HER2-positivo em > 10% das células do tumor e portanto corresponder as características para avaliação de positividade de HER2. Curiosamente, esse valor aproxima-se para a extremidade inferior dos cancros da mama relatado incidência gama de HER2-positivo. Por outro lado, o status do HER2 era variável nas áreas discretas tanto HER2-positivo e negativo HER2 do cancro da mama (Figura 3, tabela 4), proporcionando mais credibilidade para a noção de que o câncer de mama é uma doença extremamente heterogênea em o nível de genômico. A taxa de falha da análise SISH foi 0,8%, com um número total de 2.629/2.651 pontos em que a sonda dinitrofenol-tag vinculado para as sequências de destino.

Figure 1
Figura 1 : As fases de representação da pedra fundamental na realização de uma plataforma de alta produtividade para a análise da heterogeneidade do HER2 em grandes coortes de cancros da mama. (A) seleção das áreas, a amostra deve incluir a identificação e destaque de todas as áreas com citológicos, arquitectónico, ou heterogeneidade IHC. (B), um dos passos mais importantes deste processo é a criação de um bloco de aceitador de alta qualidade, dado que nem uma rachadura microscópica poderia inferir a consistência das análises subsequentes em situ da hibridação. (C) é importante empregar um arrayer digitalmente guiada com 1 agulha mm de diâmetro para construir TMA de alto rendimento, com base na técnica Kononen. (D) a criação do projeto TMA deve começar a partir da definição das dimensões e fronteiras da TMA. (E) todos IHC e ISH análises devem ser realizadas utilizando ferramentas de patologia digital, a fim de navegar rapidamente através do TMA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Representação planimétrica da TMA realizado para esse protocolo. Um número total de 180 pontos de 1 mm de diâmetro, 500 µm, permite uma óptima em situ da hibridação. TMAs mais densos fornecem resultados produtivos em termos de qualidade e uniformidade das reações em todos os pontos, com uma maior taxa de falha em um único local base. Note as manchas de "orientação" na parte superior e médio-esquerda da grade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Representante micrografias mostrando a prata em situ análise de hibridização de um câncer de Mama HER2-heterogêneos. Neste exemplo paradigmático, dois pontos distintos de um câncer de mama invasivo de alta qualidade de nenhum tipo especial (BR_121) mostraram resultados diferentes em termos de amplificação de HER2 gene (preto) comparado com a sonda centromérica Enumeração 17 (vermelho). Em particular, uma área pertencente ao núcleo do tumor e mostrando a citoqueratina 7 irregular coloração padrão era HER2 amplificado (A), enquanto um único ponto da parte dianteira invasivo (ou seja, borda de tumor) exibido um selvagem-tipo HER2 padrão (B). Barras de escala = 50 µm (20 µm nas inserções). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

ID do processo ID do bloco ID de área Tecido Topografia Morfologia PRONTO-SOCORRO PR Ki67 HER2 Outras características do IHC
BR_121 A5 um Normal Margem cirúrgica
BR_121 A1 um NST Núcleo do tumor G2 CK7 +
BR_121 A1 b NST Núcleo do tumor G3 CK7 + /-
BR_121 A3 um NST Núcleo do tumor Estroma mucinoso 90 100 12 2 +
BR_121 A3 b NST Parte dianteira invasiva Tubular 100 100 35 2 +
BR_121 A4 um NST Parte dianteira invasiva G3
BR_121 A3 c CARCINOMA DUCTAL IN SITU (EIC +) Adjacente à frente invasiva De alta qualidade 100 100 45 2 +

Tabela 1: registro representativo de um caso incluído no estudo. Neste caso (BR_121) era um carcinoma invasivo de alta qualidade de nenhum tipo especial com estroma mixoide focal, mostrando um componente tubular menor na periferia da lesão e perda focal irregular de CK7 fluorose. As características de imuno-histoquímica, incluindo biomarcadores relatórios, refere-se as análises realizadas no momento do diagnóstico. NST, carcinoma invasivo sem tipo especial; Carcinoma ductal in situ, carcinoma ductal in situ; EIC +, componente intraductal extenso; CK7, citoqueratina 7.

Marcador Clone Companhia Diluição Desparafinagem Recuperação do antígeno Incubação do anticorpo Sistema de Pontuação
PRONTO-SOCORRO SP1 Ventana RTU Preparação EZ em 72 ° C cc1 a 95 ° C para 36 min 16 min Diretrizes ASCO/CAP23
PR 1E2 Ventana RTU Preparação EZ em 72 ° C cc1 a 95 ° C para 36 min 17 min Diretrizes ASCO/CAP23
HER2 4B5 Ventana RTU Preparação EZ em 72 ° C cc1 a 95 ° C para 36 min 18 min Diretrizes ASCO/CAP3
Ki67 30-9 Ventana RTU Preparação EZ em 72 ° C cc1 a 95 ° C para 36 min 12 min Ki67 internacional no câncer de mama, trabalhando de recomendações do grupo25

Tabela 2: lista de sistemas de Pontuação adoptados para análises imuno-histoquímica, clones, diluições, métodos de recuperação de antígeno e anticorpos. ER, receptor de estrogênio; PR, receptores de progesterona; RTU, ready-to-use.

Histotype n (%) ER + (%) PR + (%) Ki67-baixo (%) Ki-67-alta (%) HER2 + (%)
Carcinoma invasivo sem tipo especial de 344 (77,5) 301 (87,5) 257 (74,7) 85 (24,7) 259 (75,3) 71 (20,6)
Carcinoma lobular invasivo 53 (11,9) 53 (100.0) 44 (83.0) 36 (67,9) 17 (32.0) 4 (7,5)
Carcinoma invasivo, tipo misto 9 (2.0) 8 (88,9) 6 (66,7) 0 (0,0) 9 (100.0) 1 (11.1)
Carcinoma tubular 8 (1.8) 8 (100.0) 8 (100.0) 8 (100.0) 0 (0,0) 0 (0,0)
Carcinoma mucinoso 11 (2.4) 11 (100.0) 9 (81,8) 7 (63,6) 4 (36,4) 0 (0,0)
Carcinoma de Micropapullary 7 (1.6) 7 (100.0) 7 (100.0) 5 (71,4) 2 (28,6) 2 (28,6)
Carcinoma invasivo com apócrinas featueres 5 (1.1) 3 (60,0) 1 (20,0) 1 (20,0) 4 (80,0) 3 (60,0)
Carcinoma papilar 1 (0,2) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 1 (100.0) 0 (0,0)
Carcinoma medular 4 (0,9) 0 (0,0) 1 (25,0) 0 (0,0) 4 (100.0) 0 (0,0)
Carcinoma de metaplastic 2 (0,5) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 2 (100.0) 0 (0,0)
Total 444 391 (88,0) 333 (75,0) 142 (32.0) 302 (68,0) 81 (18,2)

Tabela 3: mama câncer histotypes, status do receptor e status de HER2 heterogeneidade. ER, receptor de estrogênio; PR, receptores de progesterona; Ki67-baixo, Ki67 índice < 18%; Ki67-alto, Ki67 > 18%.

Interpretáveis pontos tumorais. Manchas de HER2-positivo (%) Status de receptores hormonais Casos de HER2-heterogêneos
6 5 (83) positivo 10
6 5 (83) negativo 1
6 4 (67) positivo 7
6 4 (67) negativo 1
6 2 (33) negativo 1
6 1 (17) positivo 1
5 3 (60) positivo 10
5 1 (20) positivo 2
4 3 (75) positivo 9
4 2 (50) positivo 8
4 1 (25) negativo 1
3 2 (67) positivo 5
3 1 (33) positivo 2
46 25 (54) 53 (93) 57

Tabela 4: HER2 expressão, status do receptor de hormônio e HER2-heterogêneos casos. Entre 57 casos HER2-heterogêneos, 4 casos (7%) foram ER-negativo e PR-negativo, confirmando a importância clínica de avaliação HER2 heterogeneidade.

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Discussion

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Aqui, temos as estratégias de laboratório para realizar análises SISH do gene HER2 e sua correspondente Centrómero em alto rendimento TMAs dos cancros da mama de forma heterogénea transformados detalhados. Este método é econômico e pode ser realizado na maioria dos laboratórios para o estudo da heterogeneidade de amplificação do gene HER2 em grandes coortes de mama câncer obtida forma patologia archives.

Devido a importância clínica do HER2 testes em câncer de mama e os desafios gerados pela sua expressão heterogênea, desenvolvemos um protocolo de teste de alta produtividade para avaliar intrae inter - anti-tumorais HER2 heterogeneidade genética. As áreas analisadas incluem componentes pre-invasivos e invasivos, com base em específico citológico, arquitectónico e características IHC.

Existem várias fases críticas que devem ser gerenciadas cuidadosamente neste protocolo. Um passo essencial é a seleção das regiões de interesse. Nós determinamos que a anotação das diferentes áreas topográficas através de uma abordagem multidisciplinar é essencial para garantir a qualidade da análise molecular final. Em particular, a revisão conjunta dos slides diagnósticos realizado por um patologista e um técnico aumentar enormemente o número de pontos adequados (ou seja, manchas, refletindo a área identificada no slide) e posteriormente reduzir a taxa de falha de a análise de single-manchas. No entanto, vários spots de tumor podem ser perdidos após seções seriais para múltiplas análises IHC e ISH. Para ultrapassar este inconveniente, recomendamos construir TMAs em duplicado ou triplicado, se de todo viável com base na disponibilidade de tecido. Além disso, destacamos a importância de definir procedimentos rigorosos de laboratório para a criação de blocos FFPE aceitador para os TMAs. Com efeito, temos observado que uma rachadura mínima no bloco TMA pode inferir da análise ISH inteira em termos de qualidade, reprodutibilidade e a clareza da reação. Se ocorrerem rachaduras, o bloco de doador deve ser desconsiderado para construção de TMA. Há que reconhecer, no entanto, que IHC poderia ser realizada mesmo em qualidade inferior TMAs, e nenhuma evidência de problemas técnicos durante tal análise foram observadas em nossa experiência.

Apesar de que este protocolo é especificamente otimizado para análises SISH HER2 de peito alto rendimento TMAs, é digno de nota que outras análises, como peixes e IHC, podem ser realizadas com fiabilidade em vários tipos de tecido, como descrito anteriormente,14, 19,26. No entanto, neste documento definimos o número ideal de pontos e a característica topográfica da TMA para garantir alta qualidade e reprodutíveis análises SISH do gene HER2 em espécimes de câncer de mama. Outro ponto significativo é representado pela remodelagem de protocolos padrão de SISH automatizados para coincidir com a peculiaridade das múltiplas amostras a analisar. Com efeito, as orientações dos fabricantes geralmente são feitas para as análises moleculares de seções usavamos convencionais e, portanto, não são capazes de alcançar altos padrões em amostras de tecidos de forma heterogénea transformados, tais como em TMAs de arquivamento blocos FFPE. Para este fim, nós fornecemos uma descrição passo a passo de um protocolo personalizado e confiável para análises SISH nestas amostras problemático.

Seria extremamente benéfico explorar a heterogeneidade da expressão de HER2 e a amplificação do gene em respeito à distribuição heterogênea de outros biomarcadores clinicamente acionáveis moleculares no câncer de mama. Para este efeito, mais estudos de investigação de translação são necessários para explorar a validade de nosso método para outras análises moleculares clinicamente relevantes, tais como a laser assistida por matriz dessorção/ionização espectrometria de massa da imagem latente (MALDI-MSI)27. Recentemente, a gestão dos tecidos FFPE para análise de MALDI-MSI tornou viável, embora desafiadora. Esta técnica de proteomic em situ permite a visualização da distribuição espacial de proteínas e peptídeos em secções de tecido patológico, incluindo câncer de mama.

Este protocolo tem vários passos críticos que potencialmente possam interferir com a análise final. Primeiro, particular atenção para os diferentes mecanismos subjacentes a amplificação do HER2 . Por exemplo, cromossomo 17 polysomy é uma aberração genética que pode ocorrer na mama câncer11, que representa um mecanismo alternativo conhecido para o maior número de cópia de HER2 . Esta condição, embora não frequente, pode afetar não só as características biológicas do câncer e de gerenciamento de paciente, mas também as análises ISH. Em segundo lugar, tem sido descrito que a heterogeneidade genética intra-tumor ocorre também em um nível de célula única e não apenas em diferentes áreas tumorais. Este protocolo não é capaz de aumentar o poder de deteção desta condição particular em comparação com as seções Full-face. Além disso, é importante destacar que o TMA-com base em estudo da heterogeneidade espacial tem algumas limitações intrínsecas, incluindo a falta de uma análise abrangente da seção inteira. Neste estudo, no entanto, deve ser considerado um prova de princípio que a heterogeneidade da amplificação do gene HER2 pode ser avaliada por meio de uma plataforma de alto rendimento e baixo custo, usando equipamento de laboratório padrão. Mais estudos analisando seriais Full-face seções dos casos HER2-heterogêneos, juntamente com os estudos moleculares de ponta e dados clínicos dos pacientes deverão validar este protocolo.

Em conclusão, o mapeamento completo do status de HER2 no heterogêneos espécimes de câncer de Mama HER2 e a investigação de possíveis mutações genéticas do motorista em componentes de HER2-negativo devem depender da análise de várias regiões neoplásicas. Esta análise exigiria custos insuportáveis e esforços usando facilidades de diagnósticos padrão. Este método representa uma ferramenta confiável para a caracterização simultânea de heterogeneidade genética HER2 em grandes conjuntos de múltiplo e cânceres de mama de forma heterogénea transformados.

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Disclosures

Os autores não têm nenhum conflito de interesses.

Acknowledgments

Nenhum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgipath Paraplast Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU 39601006 Tissue embedding medium, 56 °C melting point
Eosin Y  1% water solution Bio Optica, Milan, Italy, EU 510002 Eosin yellowish, water-soluble
Carazzi’s hematoxylin Bio Optica, Milan, Italy, EU 506012 Alum hematoxylin ripened using potassium iodate
Diamond quality Laboindustria, Arzergrande, Italy, EU 33533 26x76 mm microscope slides
Leica CV Mount Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU 14046430011 Mounting medium, with no monomers, based on polymers of butylmethacrylate in xylene
FLEX IHC microscope slides Agilent Technologies (Dako),  Santa Clara, CA, USA K8020 Coated microscope slides for adhesion of FFPE for use in IHC
BenchMark ULTRA Ventana medical system, Tucson, AZ, USA N750-BMKU-FS Slide staining system
CONFIRM anti-Estrogen Receptor (ER) (SP1) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4324 Primary antibody, ready-to-use
CONFIRM anti-Progesterone Receptor (PR) (1E2) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-2223 Primary antibody, ready-to-use
CONFIRM anti-Ki-67 (30-9) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4286 Primary antibody, ready-to-use
PATHWAY HER2 (4B5) Rabbit Monoclonal Primary Antibody Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-4493 Primary antibody, ready-to-use
ultraView Universal DAB Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-500 Indirect, biotin-free system for detecting mouse IgG, mouse IgM and rabbit primary antibodies
INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4422 INFORM HER2 Dual ISH assay - Dual color in situ hybridization FDA approved automated assay for determining HER2 gene status in breast cancer patients 
ultraView Silver ISH DNP Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 800-098
ultraView Red ISH DIG Detection Kit Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 800-505
ISH Protease 3 Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4149 Used in the ISH process to remove protein that surrounds the target DNA sequences of interest
Hematoxylin Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-2021 Modified Gill's hematoxylin counterstain reagent
Hematoxylin II Counterstaining Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 790-2208 Modified Meyer's hematoxylin counterstain reagent
Bluing reagent Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 760-2037 Aqueous solution of buffered lithium carbonate for bluing hematoxylin stained sections on glass slides
HybReady Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-4409 Formamide-based buffer for ISH assays
EZ Prep (10x) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-102 Concentrate solution for paraffin removal from tissue samples during IHC and ISH reactions, and to dilute 1:10.
SSC Buffer (10X) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-110 Sodium Chloride Sodium Citrate buffer solution is used for stringency washes and to rinse slides between staining steps and provide a stable aqueous environment for the in situ hybridization reactions. Dilute 1:5.
ULTRA LCS Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 650-210 Prediluted (ready-to-use) coverslip solution used as a barrier between the aqueous reagents and the air to prevent evaporation in the IHC and ISH reactions
Reaction Buffer (10x) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-300 Tris based buffer solution (pH 7.6 ± 0.2) to rinse slides between staining steps during IHC and ISH. Dilute 1:10.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-223 Pretreatment steps in the processing of tissue samples during IHC and ISH. Ready to use.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC1) Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 950-224
ultraView Silver Wash II Ventana medical system, Tucson, AZ, USA 780-003 Ready-to-use solution to rinse slides between IHC and ISH staining steps
Microtome Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU RM 2255 Automated rotary microtome
Multistainer Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU ST 5020 Workstation for automated staining and coverslipping
Minicore 1 Alphelys, Plaisir, France, EU 00-MICO-1 Semi-automatic arrayer for TMA contruction with TMA Designer 2 embedded software
Aperio ScanScope CS2 Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU K080254 Image capture device - digital pathology scanner
Tissue-Tek III Uni-Cassette Sakura Finetek Europe B.V 4135 Cassette
Tissue-Tek Paraform Standard Base Mold Sakura Finetek Europe B.V 7055 Stainless-Steel base metal mold

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References

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Construindo uma plataforma High-throughput Screening para avaliar a heterogeneidade da amplificação do Gene HER2 no câncer de mama
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Ercoli, G., Lopez, G., Ciapponi, C., Corti, C., Despini, L., Gambini, D., Runza, L., Blundo, C., Sciarra, A., Fusco, N. Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers. J. Vis. Exp. (130), e56686, doi:10.3791/56686 (2017).More

Ercoli, G., Lopez, G., Ciapponi, C., Corti, C., Despini, L., Gambini, D., Runza, L., Blundo, C., Sciarra, A., Fusco, N. Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers. J. Vis. Exp. (130), e56686, doi:10.3791/56686 (2017).

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