Summary
網膜色素上皮細胞は乾燥加齢による黄斑変性症の高度なフォームのセル置換療法として役立つことができます。このプロトコルでは、地理的な萎縮の目の大きいモデルと病気のこのモデルにヒト胚性幹細胞由来網膜色素上皮細胞の網膜下移植の世代について説明します。
Abstract
地図状委縮 (GA)、乾燥 - 加齢黄斑変性症の末期は重要な網膜の構造 (例えば、光受容体) の後続の変性につながる網膜色素上皮 (RPE) 層の損失によって特徴付けられる原因重度の視覚障害。同様に、RPE 損失と視力の低下に見られる長期的なフォローを高度な湿式加齢による黄斑変性症 (AMD) 硝子体内抗血管内皮増殖因子 (VEGF) の治療を受ける患者の。したがって、一方で補充療法として役立つことができる無制限のソースから網膜色素上皮細胞を効率的に導出する基本です。一方、動作と必然的病気のモデルに派生セルの統合手術を評価することが重要だし、イメージングの方法として近い人間に適用することが可能。ここで、提供 GA の前臨床モデルの生成を説明する私たちの前の出版物に基づく詳細なプロトコル アルビノのウサギの眼を使用して人間の萌芽期の幹細胞の評価由来網膜色素上皮細胞 (hESC RPE) のために、臨床的に関連する設定。素朴な目や過ヨウ素3目に分化した hESC RPE 移植-25 G transvitreal パルス プラナ法を用いた GA のような網膜変性を誘発します。マルチ モーダル高解像度非侵襲的なリアルタイム イメージングによる退化および移植の分野の評価が実行されます。
Introduction
このプロトコルでは、網膜の網膜色素上皮移植の hESC の統合の評価を可能にする地理的な萎縮 (GA) の大きな眼の前臨床モデルの生成について説明します。詳細はここで説明する方法は、外側の網膜の損傷と GA のような表現型の作成と同様に悪名高く1からの網膜色素上皮細胞の濃縮、純粋、および機能人口の生産を示す 3 の最近の出版物で使用されています。生理食塩水 (すなわちBSS と PBS) または過ヨウ素3ウサギ目報2,3での網膜の注入によって誘起されます。さらに、悪名高く RPE のサブ網膜サスペンション移植視細胞救助能力2広範な機能性単分子膜を形成することを示しました。
いくつかの利点は、ウサギの眼の病気の GA モデルの生成用を伴います。まず、サイズ ウサギ目の大人の人間の目のボリュームは 70% です、小さなネズミ目 (1,000 細胞/μ L対50,000 細胞/μ L)4で日常的に使用されるより大いに低い細胞密度を用いた臨床的に意味のある移植を可能,5. 第二に、齧歯動物の手術は通常経脈絡膜網膜障壁を妥協し、潜在的炎症反応と拒絶の可能性6をトリガーを通じて。両方の要因一緒にべると移植細胞と乱れたネイティブ網膜組織の移植細胞の全体的な統合の凝集につながる可能性があります。ただし、ウサギの目の大きいモデルは、臨床の現場と同じ計測手技を実行できます。第三に、大きな目のモデルは、高解像度生体内イメージングおよび移植細胞および時間1,2,3を覆っている網膜の監視できます。したがって、正常と病気の網膜と網膜サブ空間の研究に関心を持つ人のための齧歯動物に魅力的な代替手段であるべき臨床的に関連する、コスト効率の高い臨床モデルをについて説明します。
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Protocol
次のプロトコル カロリンスカ Instituet の動物のケアのガイドラインに従います。ニュージーランドのアルビノのウサギ (資材表) を使用してすべての動物実験は、地域の動物倫理委員会 (取り入れ Norra Djurförsöksetiska Nämnd) によって承認されている (許可: dnr 56/15)。悪名高く (2011/745-31/3 dnr) の使用、転送と悪名高く RPE (dnr 2013/813-31/2) の操作はまたスウェーデンの立法、カロリンスカ研究所の規程に基づき、地域の人間の倫理委員会 (によって承認されています。Regionala Etikprövningsnämnden 私ストックホルム)。
1. ヨウ素酸ナトリウム (ナイオ3) の大きな眼の動物モデル注入網膜
- ケタミン 35 mg/kg の混合物で腿に筋肉内投与し、生理食塩水に 30 G の注射器を使用して 5 mg/kg キシラジン動物を麻酔し、0.75% 2.5% とシクロペントラート フェニレフリンのミックスを使用して局所点眼薬で瞳を広げます。適切な anesthetization を確認した動物がその後ろ側の脚のハードのピンチに反応しない場合。
- 外科医 (図 1 a) に直面して頭手術顕微鏡下でウサギを配置します。ふたリトラクターを使用すると、汚染のリスクを最小限に抑えるための滅菌布でまぶたと瞬膜の膜を削除できます。使用は平衡塩類溶液 (BSS) 両方の目で麻酔中の乾燥を防ぐためです。
-
マイクロサージャリー、2 ポートを使用 (または省略可能な 3 ポート) の 25 G transvitreal 顕微鏡計測器 (図 1 b) の挿入のための非バルブ付きトロカールとプラナ法のパルスします。多機能硝子体手術マシンが注入カニューレ、endoillumination、vitrector、および endolaser を接続するためのポートです。網膜下注射、endoillumination だけは必須、2 ポートのセットアップに十分なるです。上の左のトロカールを介して、endoillumation を挿入し、網膜注入カニューレ上部右トロカールを使用します。
- 3 ポート セットアップ BSS 注入カニューレの低い時間トロカールを使用します。かどうか (、vitrector) などのオプション機器は、上部右のトロカールを挿入を使用する。
- 爪鉗子を使用してつかむ、挿入部位を覆う結膜を転置する角膜輪部から 1 ~ 2 ミリ上 2 トラカールを挿入します。
- トロカールは、30 ~ 45 ° 角膜輪部の平行角度で挿入された transsclerally、トロカールの先端の真ん中に進むことを確認します。目、目の後方のポールを目指して進出し、トロカール 90 ° を回します。この手順は、sclerotomies から手術後の漏洩を避けるため、また眼内炎 (目のすなわち、細菌伝染) のリスクを減少させます。トロカールの位置については、図 2 bを参照してください。
- 眼とコンタクト レンズ (図 1 a) のジェルとして合成の涙で、網膜を視覚化する角膜のシングルユース フラット コンタクト レンズを置きます。
- (アシスタントが運営) 延長チューブに接続して 1 mL 注射器に polytip の 38 G カニューレ (外科医によって運営) 500 μ L のナイオ3を描画します。
- 上部左のトロカールを介して endoillumination プローブと上部右トロカールを介して注入カニューレを挿入し、網膜、視神経乳頭のすぐ下を目指してに向かって硝子体空間を介してカニューレを進めます。
- 焦点のホワイトニングが表示されるまでゆっくりと網膜をタッチするカニューレの先端を許可します。注射そのものは、網膜下の配信を可能にする網膜に浸透します。これは、出血を引き起こす可能性がありますので、網膜を浸透カニューレてはいけないです。
- 5 s の期間にわたって subretinally ナイオ3の 50 μ L を注入します。基になる脈絡膜と網膜の間自然へき開面があるのではっきりと見える半透明ブレブ徐々 に注入中になります。
- 注入中には、ゆっくり針を撤回だが逆流を最小限に抑えるためにブレブで先端を維持を確認してください。
- Endoillumation と注入カニューレを除去した後爪鉗子を用いたトロカールを削除し、30 で軽く圧力をかけ先端または鉗子の鈍い端を使用して自己密封式縫合レス sclerotomies s。
- 脱水症状を防ぐために皮下生理食塩水 10 mL を与える post-surgically。手術後のステロイド外用剤や抗生物質を与えていません。鎮痛薬は、手術後 0.5 mL ブプレノルフィン 0.3 mg/ml 皮下後外科として日を与える。
- 使用後は、すべての楽器を浸漬した秒のカップルのためまず 70% エタノールで第二に 45% のエタノールで洗い、最後に蒸留水します。ペーパー タオルでそれらをきちんと乾燥します。
- 彼らは十分な意識を取り戻すし、それらのすべて 1 つの希を配置するまで動物に出席します。必要な場合 (例えば、免疫組織化学用)、100 mg/kg のペントバルビ タールの静脈注射によって動物の安楽死 (材料の表を参照してください)。
- HESC 網膜色素上皮細胞の移植を続行する 7 日を待ちます。
2. 網膜下移植扱われる動物の hESC RPE 細胞の
- 挿入時間下腹部の縁から 1-2 mm 1 週間、悪名高く RPE 移植前に 30 g の注射針を使用して麻酔下の動物トリアムシノロン硝子体内の 2 mg (100 μ L) を管理し、再管理すること 3ヶ月。先端レンズの接触を避けるために目の極を指すことを確認します。
- 前述1hESC 網膜色素単分子膜の文化.
- 24 ウェル合流 hESC RPE 単層の細胞分化メディア (材料の表を参照) を削除し、それぞれを洗う 500 μ L の PBS Ca2 +と Mg2 +なしでも。2 洗浄の合計のためもう一度この操作を繰り返します。
- 上澄みを廃棄、好評につき、トリプシンを 500 μ l 添加し、37 ° C で 12 分間インキュベート
- プレートを傾けるし、トリプシン (セルのプレートに接続されている必要がありますまま) を慎重に取り外します。穏やかなピペッティングまたは単一細胞懸濁液を得るに必要な場合をも削りによって新鮮な 37 ° C prewarmed 分化メディアの 800 μ L のセルを収集します。
注: は、細胞塊が認められた場合、40 μ m セル ストレーナーを使用します。 - 製造元の指示に従って、トリパン ブルーの 0.2% を使用して検定商工会議所でのセルを数える。
- 室温でメディアと遠心分離機の細胞の分化、5 分 300 x g の 5 mL を追加します。
- 上澄みを廃棄し、新鮮なフィルター滅菌 PBS (25 mm シリンジ フィルターを通過) を 1,000 細胞/μ L の最終濃度でペレットを再懸濁します。
- 因数 600 μ 因数や氷まで、手術中に前の細胞の懸濁液。
- 30 G の注射器を使用して生理食塩水で 35 mg/kg、ケタミン 5 mg/kg とキシラジンの混合物で腿に筋肉内投与で動物を麻酔します。0.75% 2.5% とシクロペントラート フェニレフリンのアミックスを使用して局所点眼薬で生徒を広げます。適切な anesthetization を確認した動物が戻ってその足でハードのピンチに反応しない場合。
- 外科医が直面している頭にウサギを配置します。ふたリトラクターを使用すると、汚染のリスクを最小限に抑えるための滅菌布でまぶたと瞬膜の膜を削除できます。両方の目で麻酔中の乾燥を防ぐために BSS を使用します。
-
マイクロサージャリー、2 ポートを使用 (または省略可能な 3 ポート) の 25 G transvitreal 手順 1.3 と図 2で説明したように、同じ位置に配置のトロカールとプラナ法のパルスします。以前の sclerotomies が表示されている場合実行トロッカー挿入だけ隣接するが、これら術後の漏れのリスクを最小限に抑えることではなく。
- 眼とコンタクト レンズ (図 1 a) の連絡先ゲルとして合成の涙で、網膜を視覚化する角膜のシングルユース フラット コンタクト レンズを置きます。
- 適切なヒント (を参照してください手順 1.3.5 と 1.3.6) を配置後、軽く混合 hESC RPE の懸濁液 (50,000 セル) の 50 μ L を subretinally 注入します。特徴的な「金属」遠藤照明反射によって区別ナイオ3前処理領域の中心を目指してください。麻痺の網膜は、簡単にはっきりと見えるブレブを作成を分ける必要があります。ウサギ/後滅菌 H2O の間で針を使用針セル目詰まりを避けるためにフラッシュに凝集します。目詰まり時の針の変更に気づいたです。
- 注入中には、ゆっくり針を撤回だが逆流を最小限に抑えるためにブレブで先端を維持を確認してください。
- Endoillumation と注入カニューレを除去した後爪鉗子を用いたトロカールを削除し、30 で軽く圧力をかけ先端または鉗子の鈍い端を使用して自己密封式縫合レス sclerotomies s。
- 脱水症状を防ぐために皮下生理食塩水 10 mL を与える post-surgically。手術後のステロイド外用剤や抗生物質を与えていません。鎮痛薬は、手術後 0.5 mL ブプレノルフィン 0.3 mg/ml 皮下後外科として日を与える。
- 使用後は、浸すことによってそれら、秒のカップルのためまず 70% エタノールで第二に 45% のエタノールですべての楽器を洗浄し、最後に、蒸留水します。ペーパー タオルでそれらをきちんと乾燥します。
- 彼らは十分な意識を取り戻すし、それらのすべて 1 つの希を配置するまで動物に出席します。(例:免疫組織化学のため)、必要な場合 100 mg/kg のペントバルビ タールの静脈注射によって動物の安楽死します。
3生体内で網膜と網膜イメージング。
-
スペクトル領域光干渉断層レントゲン写真撮影 (SD-10 月) デバイスを使用し付属のソフトウェア (材料の表を参照) の製造元の指示に従って、扱われた動物の断面 b-スキャンを取得します。画質劣化を避けるために、すべての 30-60 s 局所生理食塩水でフラッシュすることにより、角膜を湿った保つことことを確認します。
- ウサギ網膜へ楽器の光源から遮るもののないパスを取得する調整可能なマウントに (手順 1.1 および 2.10 参照) 麻酔は、瞳孔拡張動物を配置します。
- 同時赤外線共焦点走査レーザー眼底検査で少なくとも 3 OCT スキャン注入領域の上下、中央部分を表す (IR cSLO) 反射率参照画像を取得します。
- アン顔に青、緑、赤外線、およびマルチカラー レーザー反射率 (すなわち、複数同時のレーザーの色)、それぞれ cSLO と眼底画像を取得します。
- SD 10 月装置の青色光レーザー機能を使用して青い光蛍光 (BAF) 画像をキャプチャします。
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Representative Results
BAF、IR cSLO、および通常のアルビノのウサギ網膜の SD-10 月の代表的な生体内のイメージは図 2のとおりです。SD 10 月楽器によってキャプチャされた光の反射の特徴的なレベルでさまざまな網膜層に注意してください。
サブ網膜鉱物を作成するセットアップを示す図 1 a 図 1 b: ふたリトラクターを配置すると、レンズを避けるために 3 のトロカール (図 1 b) 角膜輪部から 1-2 mm の挿入を許可するようにまぶたを施すタッチ、そして 30-45 ̊ 角膜輪部の平行角度で。トロカールは、軽くて、強膜を介して注射針ほかの省略可能な注入カニューレの導入を可能になります。手術の手順は、実行中、フラット コンタクト レンズと瞳孔は眼底画像とサブ網膜領域の表示を促進します。
1 mM ナイオ3ソリューションの 50 μ L 注入後注射後 3ヶ月を図 3 aで SD 10 月図のように解決し、徐々 に退化して外側の網膜下腔で、ブレブが作成されます。こうして GA のような表現型を再作成する RPE 損失に対応する SD 10 月とハイポ BAF エリアで最も外側上方層の間伐を感謝してください。損傷部の同定、50 μ L のボリュームで 50,000 hESC RPE は移植、BAF と図 3Bの多色 (MC) 画像のように解決する 2 番目ブレブを作成する再挿入されました。下方に損傷、MC 画像の発色領域の不在とともに SD OCT スキャンに示すネイティブの RPE の慢性的なストレスの指標の領域の境界線上、焦点距離増加ハイパー - baf は中程度のハイパー BAF 領域に軽度を認識します。HESC RPE (50,000 セル) を (MC) イメージと SD OCT スキャンでよく保存された網膜構造の色素細胞のパッチを示す非前処理の目の 50 μ l 注入に対応するブレブが比較 (図 3) に表示されます。
総称して、このプロシージャおよび方法論を可能にする hESC RPE の網膜下懸濁液移植の統合化に関する研究関連モデルのジョージア州
図 1: インジェクションを設置す(A) 写真はサブ網膜注射のため手術のセットアップを描いたします。動物 (左) 手術顕微鏡下に置かれると外科医を保持、左手で左のトロカールを挿入 endoillumination プローブと硝子手術器具 (例えば網膜注入カニューレ) を挿入右手 (中央) 左トロカール。フラット コンタクト レンズ角膜上に配置により、(右) 手術中に眼底の拡大表示ができます。(B) とオプションの導入を容易にするトロカールとともに 30 ~ 45 ° 平行角度で挿入と縁深いから 1-2 mm のトロカールから乳首ふたリトラクターでアルビノのウサギの眼の回路図表示を閉じる注入カニューレ、光、および注入用の針。瞳孔の上に位置するフラット コンタクト レンズは、手術中に眼底画像の方のビューを取得するのに役立ちます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 通常のアルビノのウサギ網膜生体内イメージングします。生体内で通常のアルビノのウサギ網膜を表す BAF、IR cSLO、および SD OCT の画像。SD OCT 画像に異なる網膜層の対応するラベルと SD 10 月の爆破が見られる: GCL (神経節細胞層)、IPL (内側の網状層)、INL (内部の核層)、OPL (外網状層)、ONL (外核層)、OLM (外側膜を制限する)、EZ (楕円体ゾーン)、OS (外側セグメント)、網膜色素上皮 (網膜色素上皮)、BM (ブルッフ膜)。スケール バー = 1 mm (BAF と IR cSLO 画像) 200 μ m (SD OCT 画像)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 大きな目をした家兎モデルにおける網膜下懸濁液注射。損傷誘導後 1 mm ナイオ3 3 ヶ月網膜注入の (A) BAF、MC、および SD OCT 画像。水疱と SD-9 日 (B) BAF は、MC、退化した neuroretina に対応するハイパー BAF 領域に囲まれたハイポ BAF にメモして、1 週間に 5万人の網膜下移植のナイオ3 1 mm 目の SD OCT 画像前処理懸濁液および移植後 3 ヵ月分析 hESC RPE。BAF イメージ、MC で統合された色素細胞と網膜下移植後 3 ヵ月非前処理の素朴な目に対応する SD-10 月 (C) 三菱商事と SD OCT 画像の萎縮性 neuroretina の不在のハイパー BAF 領域に注意してください。懸濁液の hESC RPE。メモ MC 画像上色素性の領域と保存された上方構造 SD 10 月 10 月の SD のスキャン面 (緑の矢印) がマークされます。白い矢印は、アンの顔と SD OCT 画像の鉱物の境界線をマークします。スケール バー = 1 mm (BAF と MC 画像)、200 μ m (SD OCT 画像)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルでは hESC RPE 統合生体内評価 GA とその臨床使用の大きな目モデルの生成を説明します。
クリニック7に GA と関連疾患の再生治療の翻訳、開発し、忠実に移植とイメージングの臨床方法をキャプチャする方法を最適化することが重要です。ウサギは、この側面の魅力的な: 眼内手術および標準の画像の使用を許可する比較的大きな目があり安くて簡単に収容された大きな目の他の動物と比較されます。
サブ網膜の損傷を誘発するまたは悪名高く網膜色素上皮を移植するサブ網膜の鉱物の作成の標準 transvitreal 25 ゲージ pars プラナ硝子体手術テクニックの使用について述べる。当初、我々 はプロシージャの間に、硝子体手術を行った場合に、注入ポート (トロッカー) を使用するつもりでした図 1 bで示すよう 3 ポート設定を使用しました。しかし、以来、我々 はサブ網膜注射を適用するため必要があると硝子体手術を見つかっていない、注入ポートが省略されています。それにもかかわらず、3 番目のポート オプションは、プロシージャはさらに適応し、硝子体手術を行う場合でなければなりません。
大きな目ウサギ解剖学と生理学の蓄積されたデータと老舗眼モデルである過去世紀8。ウサギ易いハンドルと経済的に魅力的な品種 (例えば購入、住宅、および維持)、しかも、大きな目をした哺乳類の他のモデルに比べて容易に入手できます。大きな目をしたモデルの主な利点は、ターンで時間をかけて網膜移植 hESC RPE 細胞の追跡を可能にする高解像度の臨床イメージング技術の使用できます。しかし、にもかかわらず、ウサギ目の動物系統の齧歯動物よりも人間に近いが、それする必要があります記載 merangiotic 網膜と視覚縞、底部網膜と黄斑霊長類9で現在と比較して所有しています。Merangiotic 網膜手段内部の網膜の血液のほとんどを供給する毛細血管、性病変や出血のリスクを増やすことができますので検討する必要があります違いに由来します。実験的利点の 1 つは、GA 以前に実証1,3されている生理学的なソリューションだけで、網膜の鉱物を次の初期の段階をモデル化できるということです。これらの研究提案 merangiotic 環境の中で一時的な網膜低酸素症を引き起こす網膜のブレブが視細胞死を引き起こすのに十分かもしれないことしかし、この文脈において最も可能性の高い 1 mL シリンジと 50 μ L ブレブ ボリューム、神経網膜萎縮を促進する順番ランダムな現象を使用してサブ網膜流れによって生成される RPE 損失を示されています。したがって、ブレブのボリュームより有害になる網膜ストレッチ被害、意味が大きく使用量 (例えば、100 μ L、他の研究10で使用されて) に直接影響を持つことができます。
挿入されたセルの統合を確保するための重要なステップは、硝子体に注入、網膜内の針の位置を決めながら細胞の逆流を避けるためです。深すぎるに配置されている場合外網膜障壁/脈絡膜が侵入して免疫細胞が免疫抑制の使用にもかかわらず免疫拒絶反応を引き起こす、サブ網膜のスペースに侵入します。移植成功のためのもう一つの重要な側面は、硝子体の状態です。現在のモデルでは、硝子体手術は逆流と外科的外傷を最小限にするために実行されません。ただし、いくつかの目、それは大小もない鉱物の形成につながる前網膜硝子体界面で先端をはまり、網膜に適切な先端位置を取得することは困難ですが注目されています。比較的まれなイベントですが、硝子体のウサギの変動は、手術および手術後の分析中に考慮する必要があることを示すわけ。
さらに、triamcinolon の適切な注入は手術と手術後の眼底 SD 10 月可視化を妨げるし、白のステロイド結晶による眼底をあいまいにしないために重要です。、この問題を最小限に抑える triamcinolon の注入は、時間下腹部にされるべきであります。同様に、毛様体や針で不釣合いに大きいウサギ レンズに触れてから硝子体出血を避けるために角膜輪部から 1-2 mm のトロカールを入れなければなりません。レンズ タッチはサブ網膜領域の術後イメージ投射の間の適切な可視化を妨げる順番が白内障になります。
トリアムシノロンを含むステロイド自体は時間の経過とともに白内障を引き起こす可能性があります。我々 はないトリアムシノロン投与まで 8 ヶ月間これを観察しました。ただし、トリアムシノロンを管理する広範な期間の場合ステロイド性白内障を開発する可能性が高いです。
説明の方法は、手術トレーニングとセル統合の機能ここで、私たちの前の出版物に従って分析の両方に使用できます。メソッドも、サブ網膜ウイルスベクターの管理の関連性の高い今いくつかの遺伝性網膜ジストロフィーの臨床試験。将来の変更は、シート キャリアや biogels などのより複雑な材料の移植を含めることができます。臨床イメージング手法が出現、これらはおそらく変更することがなく、ウサギの眼に容易に適応になります。
In conclusion、大きな目をした家兎モデルを実証して齧歯動物モデル i) ジョージア州のさまざまな段階の概説、ii) 患者に関連する手術・ イメージング メソッド、および iii の適用に比べていくつかの利点は、関連する前臨床モデル) GA と関連疾患の細胞補充療法として使用するドナー細胞の統合を評価します。
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Disclosures
作者が競合する利益または矛盾した興味あります。
Acknowledgments
本研究は、カロリンスカ研究所、視覚障害者、眼科研究、スウェーデンの目財団、王 Gustav V 財団、ARMEC ヨルダン財団法人エドウィン ・皇太子妃マルガレータの財団からの補助金によって支えられました。リンデベリ財団と Cronqvist 財団。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NutriStem hESC XF differentiation medium –bFGF and –TGFb | Biological Industries | 06-5100-01-1A | |
| TrypLE Select 1x | Gibco, ThermoFisher Scientific Corp | 12563-011 | |
| PBS without Ca2+ and Mg2+ | Gibco, ThermoFisher Scientific Corp | 14190-094 | |
| Cell strainer 40 μm Nylon | VWR | 732-2757 | |
| Needle 30 G 0.5’’; 0.3 mm x 13 mm | BD Microlance | 304827 | |
| Acrodisc 25 mm Syringe Filter | Acrodisc | PN4612 | |
| 0.4% trypan blue | ThermoFisher Scientific Corp | 15250061 | Use at 0.2% |
| NaIO3 | Sigma-Aldrich Corp | S4007 | |
| BSS | Alcon Nordic A/S | 65079550 | |
| 70% Ethanol | Solveco AB | 1047 | |
| Ketaminol, 100 mg/mL | Intervet, Boxmeer | 511519 | Use 35 mg/kg ketamine |
| Rompun vet, 20 mg/mL | Bayer Animal Health | 22545 | Use 5 mg/kg xylazine |
| Triescence, 40 mg/mL | Alcon Nordic A/S | 412915 | 2 mg intraviterial |
| Cyklopentolat-phenylephrine, 0.75% + 2.5% | APL | 321968 | Use 1 drop in each eye |
| Viscotears | Laboratoires Théa | 597562 | |
| Topical saline | Apotea AB | 7053249369080 | |
| Allfatal vet. 100 mg/mL | Omnidea | 77168 | Use 100 mg/mL pentobarbital |
| Extension tube (Hammer) | MedOne Surgical Inc | 3223 | |
| 25 G/38 G polytip subretinal cannula | MedOne Surgical Inc | 3219 | 25 G/38 G |
| Single Use Flat Lens | Volk | #VWFD10 | |
| Barraquer Colibri lid retractor | AgnTho's AB | 42-020-030 | |
| Non-valved trocars | Alcon Nordic A/S | 8065751448 | |
| Clawed forceps | Bausch & Lomb Nordic AB | ET1811 | |
| Alcon Accurus 400VS Vitrectomy machine | Alcon Nordic A/S | 8065740238 | |
| Accurus 25+ Gauge Vitrectomy TotalL Plus Pak | Alcon Nordic A/S | 8065751493 | |
| SD-OCT device | Heidelberg Engineering | Spectralis HRA+OCT | Use Heidelberg Eye Explorer version 1.9.10.0 |
| 24 well plates | Sarstedt | 83.3922 | |
| Neubauer hemocytometer | VWR | 631-0925 | |
| New Zealand albino rabbits | Lidköpings Rabbit Farm, Sweden | ||
| hESC-RPE cells | See reference number 1 | ||
| Buprenodale Vet, 0.3 mg/ml | Dechra | 660500 | Use 0.5 mL buprenorphine subcutaneously |
References
- Plaza Reyes, A., et al. Xeno-Free and Defined Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells Functionally Integrate in a Large-Eyed Preclinical Model. Stem Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2016).
- Bartuma, H., et al. In Vivo Imaging of Subretinal Bleb-Induced Outer Retinal Degeneration in the Rabbit. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (4), 2423-2430 (2015).
- Petrus-Reurer, S., et al. Integration of Subretinal Suspension Transplants of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells in a Large-Eyed Model of Geographic Atrophy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 1314-1322 (2017).
- Carido, M., et al. Characterization of a mouse model with complete RPE loss and its use for RPE cell transplantation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5431-5444 (2014).
- Lund, R. D., et al. Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats. Cloning Stem Cells. 8 (3), 189-199 (2006).
- Vugler, A., et al. Elucidating the phenomenon of HESC-derived RPE: anatomy of cell genesis, expansion and retinal transplantation. Exp Neurol. 214 (2), 347-361 (2008).
- Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
- Hughes, A. A schematic eye for the rabbit. Vision Res. 12 (1), 123-138 (1972).
- Blanch, R. J., Ahmed, Z., Berry, M., Scott, R. A., Logan, A. Animal models of retinal injury. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 2913-2920 (2012).
- Nork, T. M., et al. Functional and anatomic consequences of subretinal dosing in the cynomolgus macaque. Arch Ophthalmol. 130 (1), 65-75 (2012).
