Summary
Riktade gene redigering med CRISPR/Cas9 har kraftigt underlättas förståelsen av de biologiska funktionerna av gener. Här använder vi metoden CRISPR/Cas9 till modell calreticulin mutationer i cytokin-beroende hematopoetiska celler för att studera deras onkogen aktivitet.
Abstract
Klustrade regelbundet mellanliggande kort palindromic repetitioner (CRISPR) är ett system för adaptiv immunitet i prokaryoter som har varit repurposed av forskarna att generera RNA-guidad nukleaser, såsom CRISPR-associerade (Cas) 9 för platsspecifika eukaryota genomet Redigera. Genomet engineering av Cas9 används för att effektivt, enkelt och kraftfullt sätt modifiera endogena gener i många biomedically-relevanta däggdjursceller linjer och organismer. Här visar vi ett exempel på hur man kan använda metoden CRISPR/Cas9 för att förstå den biologiska funktionen av specifika genetiska mutationer. Vi modell calreticulin (CALR) mutationer i murina interleukin-3 (mIL-3) beroende pro-B (Ba/F3) celler genom leverans av samma guide RNAs (sgRNAs) inriktning det endogena Calr locus i den specifika regionen där fastsättas och radering (ditsatta ) CALR mutationer förekommer hos patienter med myeloproliferativa neoplasier (MPN), en typ av blodcancer. SgRNAs skapa dubbel strand raster (DSBs) i den berörda regionen som repareras av icke-homolog slutet att gå (NHEJ) för att ge indels i olika storlekar. Vi sysselsätter sedan standard Ba/F3 cellulära omvandling analysen att förstå effekten av fysiologisk nivå uttryck för Calr mutationer på hematopoetiska cellulära transformation. Detta synsätt kan tillämpas på andra gener att studera deras biologiska funktion i olika däggdjur cellinjer.
Introduction
CRISPR/Cas9 tekniken revolutionerat nyligen riktade gen editering i levande celler och organismer. Det har blivit ett mycket kraftfullt verktyg för biomedicinsk forskning och är för närvarande utnyttjades som en potentiell aveny för behandling av genetiska sjukdomar1. Grunden för alla genomet redigeringsverktyg bygger på skapandet av en nuclease-inducerad DNA dubbel strandsatta paus (DSB) på den genomiska locus ändras. DSBs kan repareras av icke-homolog slutet-anslutning (NHEJ) eller homologi-regisserad reparation (HDR)2,3. Fördelen med den Cas9 nuclease över andra genomet engineering nukleaser, såsom zink finger nukleotider (motvilligt) och transkription aktivator-liknande effektor nukleaser (TALENs) är dess beroende RNA för inriktning på nuclease till en önskad DNA-sekvens, jämfört protein-DNA interaktion i motvilligt och TALENs2,3.
Efter upptäckten av CRISPR/Cas9 nuclease vägen som en adaptiva immunsystemet i prokaryota celler4,5, har mycket möda lagts ned anpassa vägen för användning i däggdjursceller linjer och modell organismer2, 3. som ett verktyg för redigering av genen, CRISPR/Cas9 vägen använder tredjeparts två huvudkomponenter: den Streptococcus pyogenes (Sp) härrör Cas9 nuclease och sgRNAs inriktning genen av intresse2,3. SgRNA består av 20 nukleotider som direkt Cas9 till en specifik plats på arvsmassan genom RNA-DNA baspar komplementaritet2,3. Målwebbplatsen av sgRNA måste ligga intill en protospacer intill motiv (PAM) webbplats i form av 5-' NGG, som är erkänd av den SpCas9 nuclease. Med dessa verktyg, kan Cas9 riktas till någon DNA-sekvens genom att utforma sgRNAs som mål regionen av intresse. I tillägg till Sp härrör Cas9, finns det ytterligare varianter för Cas9 med olika funktioner beroende på den specifika tillämpningen. Exempelvis finns det Cas9 varianter med högre specificitet för på målet redigering eller singel-strand klyvning kapacitet för DNA Hack6,7. Katalytiskt inaktiva Cas9 har dessutom nyligen utvecklats för Transkriptionsreglering8. Forskare har nu använt det CRISPR/Cas9-systemet för en mängd olika applikationer, såsom gen knockin och knockout att studera de biologiska funktionerna av gener9, förlust-av-funktion och gain-of-function bibliotek skärmar10 och genetiska konstruktion av modell organismer11.
I detta protokoll kombinerar vi metoden CRISPR/Cas9 med Ba/F3 cellulära omvandling analys att förstå den biologiska funktionen av CALR mutationer. BA/F3-celler är en murint IL-3 beroende hematopoetiska cellinje som kan återges IL-3 oberoende vid uttryck för vissa onkogener såsom BCR-ABL12. För att förstå huruvida mutant calreticulin kan omvandla Ba/F3 celler cytokin oberoende tillväxt, vi riktade exon 9 av den endogena Calr locus använder CRISPR/Cas9 för att införa ditsatta mutationer och sedan återtog IL-3 från cellerna att tillämpa en positiva val tryck, med målet att går igenom gain-of-function CALR mutationer finns i MPN patienter. Protokollet omfattar utformning, kloning och leverans av sgRNAs, utvecklingen av stabila Cas9 uttrycker celler och screening för CRISPR på målet gen redigering. Detta protokoll kan tillämpas på olika gener och olika cytokin-beroende cellinjer av intresse och är speciellt värdefullt i modellering och studerar den biologiska funktionen av gener som är inblandade i cancer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. sgRNA Design med hjälp av onlineverktyg13
-
Design sgRNAs inriktning genen av intresse med hjälp av fritt tillgängliga online-verktyg.
- Kopiera och klistra in NCBI referens sekvensen av genen sevärdheter i Broad Institute sgRNA designer webbverktyget: (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
Obs: Det här verktyget identifierar sgRNA sekvenser med klyvning platser inom exoner och dem som spänner över intron/exon gränsen men ändå klyva inom exon. - Ladda ner och öppna utdata textfilen i excel.
- Fokus på kolumnerna befolkade med sgRNA sekvenser och sgRNA ramen sekvenser. Observera att sgRNA sekvenserna inte innehåller protospacer angränsande motivet (PAM) men de sammanhang sekvenserna göra.
- Observera att på målet effekt Poäng listar det förutspådda klyvning effektivitet betygsatt på en skala från 0 till 1 där en poäng 1 betecknar en klyvning verkningsgrad.
- Använd funktionen 'sortera' av excel att antingen beställa målen av den effekt poängen eller läge inom genen från målet genom kolumnen 'Target Cut %'.
Obs: Sortering av läge inom genen är användbara för att identifiera sgRNAs som är avsedda för en specifik domän eller exon sevärdheter. - Välj 3-6 sgRNAs som är inriktade på området av intresse med hög (> 0,6) effekt noter på målet. Det kan vara bra att veta vilka typer av mutationer kan vara ansvarig för den fenotyp som är önskat (vänligen se figur 1 förklarar den inriktning strategi som används för calreticulin).
Obs: sgRNAs det föreslagna 0.6 effekt Poäng tröskelvärdet bör övervägas när det finns en brist på andra bra kandidater. - Använd verktyget MIT gärna analys web till skärmen för potentiella off-target effekter (http://crispr.mit.edu/). För varje sgRNA som valts, kör sekvensen mål (inklusive PAM).
Obs: Broad Institute sgRNA designer webbverktyget kunde också användas till skärmen för off-target effekter (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).- Observera att verktyget MIT sgRNA noter varje sgRNA på en skala från 1-100 där 100 poäng betecknar högre specificitet. En poäng som är större än 70 är perfekt och representerar en sgRNA med minsta off-target effekter. Denna webbplats också genererar en lista av off-target hits med sin plats i arvsmassan och hur många glapp de har med guiden kandidat.
Obs: Off-target träffar med fyra missmatchningar eller större anses säker14. Off-target träffar med mindre än fyra missmatchningar kan vara problematiskt om de faller inom exoner14.
- Observera att verktyget MIT sgRNA noter varje sgRNA på en skala från 1-100 där 100 poäng betecknar högre specificitet. En poäng som är större än 70 är perfekt och representerar en sgRNA med minsta off-target effekter. Denna webbplats också genererar en lista av off-target hits med sin plats i arvsmassan och hur många glapp de har med guiden kandidat.
- Välja 2-3 sgRNAs som rikta olika platser inom regionen av intresse för målgenen och som har den högsta Parade klyvning effektivitet och off-target värderingar (se tabell 1 för sgRNA sekvenser inriktning exon 9 av Calr).
Obs: Beroende på de experimentella mål, kan större tonvikt läggas vid de olika värden som erhålls från de nämnda verktyg.
- Kopiera och klistra in NCBI referens sekvensen av genen sevärdheter i Broad Institute sgRNA designer webbverktyget: (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
2. kloning sgRNA Oligos13
-
Generera den framåt oligo
- Skapa en lista över sgRNA sekvenser utan webbplatsen PAM.
- Lägga till ett G i 5' slutet av sekvensen om 5' sgRNA sekvensen inte avslutas ett G.
Obs: Denna G är nödvändigt för att maximera U6-driven sgRNA transkription nivå. Tillägg av ett G är nödvändigt för m1 sgRNA (tabell 1). - Lägga till sekvensen ”CACC” 5' slutet av sekvensen G-optimerade guide (ingen PAM) (tabell 2) för att generera överhäng krävs för ligering av glödgad oligos in BsmBI rötas lentiGuide vektor (se steg 3).
-
Generera den omvänd oligo
- Omvänd komplement sekvensen G-optimerade guide (ingen PAM).
- Lägga till sekvensen ”AAAC” 5' slutet av sekvensen omvänd kompletteras G-optimerade guide (tabell 2).
- Beställa den designade oligos från en primer syntes företag.
-
Glödga och fosforylera oligos
- Tillsätt 1 µL av framåt oligo (100 µM), 1 µL omvänd oligo (100 µM), 10 x T4 ligering 1 µL buffert, 0,5 µL av T4 polynucleotide kinase (PNK) och 6,5 µL av H2O till en PCR-röret (totalt = 10 µL).
- Kör följande program i termocyklern: 37 ˚C för 30 min, 95 ˚C för 5 min, ramp från 95 till 25 på 0,1 ° C/s.
- Späd 1: 250 H2O. reaktionsprodukten
3. nedbrytning av lentiGuide-Puro vektor13
-
Digest lentiGuide-Puro vektor
- Montera en 50 µL matsmältningen reaktion med följande komponenter: 5 µg cirkulärt plasmid, 2 µL (30 enheter) av BsmBI restriktionsenzym, 5 µL restriktionsenzym buffert och upp till 50 µL av H2O.
- Kör reaktionen för 2 h vid 55 ° C. Efter den första timmen, tillsätt 1 µL mer BsmBI restriktionsenzym.
-
Dephosphorylate skär ryggraden
- Lägga till 7 µL av fosfatas reaktion buffert och 2 µL av fosfatas enzym smält vektorn.
- Inkubera i 30 minuter vid 37 ° C.
- PCR rena snitt och defosforyleras ryggraden med en kommersiella kit.
Obs: Suppleant medföljande rosa färgade kolumner med miniprep kit blå färgade kolumner eftersom dessa rymmer bättre stor plasmid storlekar. Avkastningen kan ökas genom att värme eluering bufferten i en 90 ° c värme block före eluering och eluering DNA från kolumnen två gånger på slutet (kör eluerade DNA från den första elueringen tillbaka genom en andra gång).
4. ligering ofAnnealed Oligos in rötas ryggraden13
- Tillsätt 50 ng av smält ryggraden, 1 µL glödgas oligo utspädning, 10 x T4 ligering 1 µL buffert, 1 µL av T4 ligase och upp till 10 µL av H2O till en PCR-röret. Inkubera i 1 h i rumstemperatur
- Omvandla Stbl3 celler med 2 µL av ligering reaktionen. Skylt på lysogeny buljong (LB) agar plåt med 100 µg/mL ampicillin och inkubera över natten vid 37 ° C.
- Plocka 3 kolonier och Inokulera till en mini prep kultur.
-
Validera rätt oligo införande
- Utföra en miniprep för varje kultur och sekvens genom oligo insticksstället start från en primer i U6 arrangören med en kommersiella kit.
- Utföra en midi-prep eller en maxi-prep av sekvens-verifierade kultur.
5. generering av Cell lLines stabilt uttrycker SpCas9
Obs: Detta protokoll innebär leverans av pLX_TRC311-Cas9 plasmid genom lentiviral infektion. Detta protokoll är beskrivs i detalj för murina interleukin-3 (mIL-3) beroende pro-B (Ba/F3) celler, en suspension cellinje och kan anpassas till andra celltyper som använder Rekommenderad kultur villkoren för varje celltyp. Odlingssubstrat för Ba/F3 celler består av RPMI kompletteras med 10% fetalt bovint serum, 1% penicillin/streptomycin/L-glutamin och 10 ng/mL murina interleukin 3.
-
Transfect HEK-293T celler
- Seed 3 x 106 HEK-293T celler per 10 cm vävnadsodling maträtt. Hålla seedade celler över natten innan transfection.
Obs: HEK-293T celler är en vidhäftande cellinje och används rutinmässigt för virus produktion. Cellerna finns kvar i DMEM kompletteras med 10% fetalt bovint serum, 1% penicillin/streptomycin/L-glutamin. Cellerna bör vara 80% konfluenta vid tidpunkten för transfection. - Före varm minskade serum media (Opti-MEM) och odlingsmedium.
- Tillsätt 500 µL av minskade serum media, 7 µg pLX_TRC311-Cas9 konstruera, 4 µg av pCMV-VSV-G lentiviral förpackning plasmid och 4 µg psPAX2 lentiviral förpackning plasmid i ett rör
Obs: Totala DNA per 10 cm skålen av 293T celler är 15 µg. - Blanda DNA väl och tillsätt 45 µL transfection reagens. Blanda försiktigt och låt den stå i 20 min.
Obs: Det är viktigt att använda minskade serum media eftersom serum kommer att hämma komplexa bildandet mellan transfection reagens och plasmid DNA. - Sug ut det gamla mediet i 293T plattan och tillsätt 5 mL av nya odlingsmedium.
- Lägga till DNA och transfection reagens mixen i en droppe klokt sätt 293T plattan. Snurra försiktigt och inkubera vid 37 ° C och 5% CO2 för 24 h.
- Skörda viral supernatanterna vid 24 och 48 h post transfection. Passera genom ett 0,22 µm filter och delprov i ett cryovial rör (1,6 mL/tub och 1,5 mL kommer att användas för infektion).
- Lagra viral supernatanten vid-80 ° C.
Obs: lentiviral supernatanten kan användas inom 6 månader. Om möjligt, bör spinfection transductions utföras med färska virus).
- Seed 3 x 106 HEK-293T celler per 10 cm vävnadsodling maträtt. Hålla seedade celler över natten innan transfection.
-
Lentiviral infektion i Ba/F3 celler
- Tina viral supernatanten på is, om de är frysta.
- Centrifugera celler vid 300 x g i 4 min.
- Aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna vid en koncentration på 3 x 106 celler/mL.
- Tillsätt 500 µL återsuspenderad celler, 1.5 mL av viral supernatanten, 4 µL av polybrene (lager: 2 mg/mL) och 10 ng/mL m-IL3 i en 6-väl vävnadsodling tallrik. Se till att inkludera en virusfri väl med 1,5 mL media istället för viral supernatanten som kontroll.
Obs: Mängden viral supernatanten lagt till bör motsvara en multiplicity av infektion (MOI) < 1. - Centrifugera plattan på 440 x g under 120 minuter vid 37 ° C.
- Ta plattan ur centrifugen och placera i 37 ° C och 5% CO2 inkubator och tillåta för att växa över natten.
- Snurra ner cellerna efter 24 h och resuspendera med 5 mL färsk varm media i en 6-bra platta.
-
Urval av Cas9 infekterade celler
- Snurra ner cellerna och resuspendera med färska varma media kompletteras med 5 µg/mL blasticidin, 48 h post spinfection.
- Markera cellerna i 9 dagar med blasticidin eller tills oinfekterade (negativ) kontroll celler är döda.
- När markeringen är klar, överföra de resistenta cellerna till medium med lägre koncentration av blasticidin.
6. reporter Assay för Cas9 verksamhet15
- Transduce föräldraledighet celler och celler som uttrycker stabilt Cas9 med pXPR-011 lentiviral infektion (se steg 5,1-5,2).
Obs: Den här vektorn innehåller både GFP och en guide som inriktning GFP. Celler som innehåller aktiva Cas9 kommer att resultera i en minskning av GFP (figur 2). - Markera cellerna i 3 dagar med 2 µg/mL puromycin, 48 h post spinfection.
- Analysera proverna för god Jordbrukarsed uttryck genom flödescytometri.
Notera: En god Jordbrukarsed minskning på 50% eller mer representerar optimal Cas9 aktivitet. En högre koncentration av blasticidin urval kunde användas för att öka Cas9 aktivitet om mindre än en 50-procentig minskning som observerats. Inte alla cellinjer kan tolerera blasticidin urval. I detta fall, kan användning av Cas9 vektorer med andra urval kassetter vara nödvändigt. Dessutom tål inte alla cellinjer stabilt uttryck för Cas9. I detta fall kan övergående transfection av Cas9 användas.
7. Spinfection av sgRNAs in Cas9 uttrycker cellerna
- Följ steg 5,1-5,2 för lentiviral infektion av sgRNAs in i cellerna av intresse.
Obs: I steg 5.1.3, ersätta pLX_TRC311-Cas9 konstruktion med den lentiGuide-Puro bygga validerade från avsnitt 4. - 48 h inlägg spinfection, markerar du cellerna i 3 dagar med 2 µg/mL puromycin.
- Överföra de resistenta cellerna till medium med lägre koncentration av antibiotika och fortsätter urval för ytterligare 4 dagar att möjliggöra tillräcklig redigering.
8. Ba/F3 cellulära omvandling och positiva urval använder m-IL3 uttag
Obs: Denna analys beskrivs för mIL-3 underordnade Ba/F3 celler men skulle kunna tillämpas på alla cytokin beroende cellinje.
- Snurra ner exponentiellt växande Ba/F3-celler som ectopically uttrycker Cas9 och sgRNA av intresse.
- Sug ut supernatant och tvätta cellerna med 5 mL av fosfat buffrad saltlösning (PBS).
- Snurra ner cellerna och upprepa tvättningen i 8,2 fyra gånger (det här steget säkerställer att media är gratis för IL-3).
- Aspirera PBS och resuspendera cellerna i 5 mL färsk media utan IL-3.
- Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer eller en cell livskraft analyzer.
- Utsäde cellerna i tre exemplar i en 6-väl vävnadsodling tallrik med en koncentration på 1 x 105 celler/mL i en total volym på 2 mL färsk media utan IL-3.
- Övervaka och räkna cellerna varannan dag för sammanlagt 8 dagar.
Obs: Ba/F3 celler saknar IL-3 vanligtvis dör 2 dagar efter IL-3 svält. Det är viktigt att inkludera en negativ kontroll i analysen (vanligtvis en icke-targeting guide används som en kontroll).
9. screening för CRISPR på målet redigering
- Utforma CRISPR screening primers uppströms och nedströms av webbplatsen sgRNA klyvning
Obs: Använd primers minst 100 bp från webbplatsen förutspådda klyvning för att säkerställa identifiering inte skulle påverkas av en stor fastsättas och radering (ditsatta) på webbplatsen sgRNA mål. - Isolera genomiskt DNA (gDNA) från transformerade celler (i slutet av tillväxtkurvan) och celler pre-cytokin uttag.
Obs: Inkludera alltid celler överuttryck guiden icke-inriktning som en kontroll för genen redigering. Isolera gDNA från celler innan och efter omvandling kommer att identifiera kloner som valdes positivt för och har en proliferativ fördel. - Montera en 50 μl PCR med följande komponenter: 25 µL av 2 x PCR mix, 1 µL framåt primer (10 µM), 1 µL reverse primer (10 µM), 50-100 ng gDNA och H2O upp till 50 µL.
Obs: Många HiFi-polymeraser kan användas i steget 9,3. - Köra prover i en termocykler med följande parametrar: 95° C i 1 min, 30 cykler av (94 ° C i 1 min, 52 ° C för 30 s, 72 ° C under 30 s), och 72 ° C i 10 min. Detta PCR är optimerad för Calr primers som anges i tabell 3. Optimera PCR-villkor för primer par utformad i steg 9.1 baserat på testa den på gDNA.
- Kör 5 µL av proverna på en 2% agarosgel på 10 V/cm med 1 x Tris-acetat-EDTA (TAE) buffert. Undersöka prov för närvaron / frånvaron av ett förstärkt band motsvarande i storlek till genen av intresse.
- Använd resten av PCR-reaktionen (45 µL) för att utföra en PCR-rening.
- Klona amplikoner med en PCR kloning kit i en plasmid vektor. Exempelvis används vanligtvis pGEM T-lätt vektorer.
- Förvandla plasmiden i Stbl3 celler eller andra kompatibla celler och plattan på LB agarplattor med relevanta antibiotika. Välj 10-20 kolonier, mini prep varje en, och underkasta varje klon Sanger sekvensering att karakterisera den indels som skapats från CRISPR/Cas9 redigering.
Obs: Om så önskas, enda cell fluorescens aktiverad cell sortering (FACS) kan utföras på huvuddelen redigeras befolkningen för att isolera en klon med en specifik ditsatta. Nästa generation sequencing (NGS) metoder kan dessutom användas för att mer kraftfullt kvantifiera på målet redigering med djupsekvensering av PCR-amplikoner som spänner över sgRNA målregionen. Till exempel kan spårning av Indels genom nedbrytning eller TIDVATTNET användas istället för subkloning att exakt bestämma spektrum och frekvensen av riktad mutationer som genereras i en pool av celler (https://tide.nki.nl/#about)16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med metoden som beskrivs här, är målet med detta experiment att studera de funktionella effekterna av att införa ditsatta mutationer det endogena Calr locus på hematopoetiska celltransformation. CRISPR/Cas9 systemet används som ett verktyg för att skapa endogena Calr mutationer i Ba/F3 celler. Två sgRNAs var valt som målgrupp exon 9 av Calr (figur 1), i regionen där infogningar eller radering (ditsatta) mutationer förekommer vanligtvis i CALR-mutant MPN patienter17,18. Den första sgRNA (m1) valdes baserat på dess höga klyvning effektivitet och gynnsamma off-target noter (tabell 1). Den andra sgRNA (m2) valdes främst för dess läge i exon 9 och brist på ytterligare sgRNAs i regionen för att redigera med höga klyvning effektivitet och gynnsamma off-target noter (tabell 1). Två distinkta sgRNAs (m1 eller m2) användes i separata infektioner för att säkerställa att de observerade effekterna berodde på målet gen redigering. Off-target effekter är osannolikt att delas av flera oberoende sgRNAs. Icke-targeting kontroll (scramble) användes också som en negativ kontroll. Rekrytering av den Cas9 Amiiiiin till Calr exon 9 förutspås för att skapa DSBs på detta locus. DSBs skulle sedan repareras av NHEJ, som kan generera indels av varierande storlekar (figur 1).
För att utveckla den i vitro CRISPR/Cas9-system i Ba/F3 celler, genomfördes celler som stabilt uttrycker proteinet Cas9 av lentiviral-medierad transduktion enligt de protokoll som beskrivs ovan. Stabil Cas9 uttryck resulterar i robust Cas9 aktivitet. Cas9 aktivitet i Ba/F3-Cas9 celler mättes genom pXPR-011, en reporter konstruktion som innehåller både god Jordbrukarsed och en guide som inriktning GFP15. Celler som innehåller aktiva Cas9 kommer att resultera i en minskning av GFP15. GFP mättes i cellerna med hjälp av flödescytometri. BA/F3-Cas9 celler visas en minskning med cirka 76% i GFP, motsvarar robust Cas9 aktivitet (figur 2).
Skriv 1 cytokin-receptorer, som trombopoetin receptorn (MPL), erytropoietin receptorn (EPOR) och den granulocyt granulocytkolonistimulerande faktor receptor (G-Tjeckoslovakien) var varje individuellt, stabilt uttryckt i Ba/F3-Cas9 celler att bestämma deras kooperativitet med muterade calreticulin i inducerande omvandling av Ba/F3 celler. Transduktion av sgRNA konstruktioner (m1, m2 eller en rusning (icke-targeting guide)) genomfördes sedan i varje av Ba/F3 cellinjer stabilt uttrycker Cas9 och receptorn av intresse. Celler valdes sedan ut för 7 dagar med puromycin att ge tillräcklig tid för CRISPR/Cas9 gen redigering. En positiv selektionstryck tillämpades sedan genom att svälta cellerna av cytokin (mIL-3). Målet med detta svält tryck är att identifiera om indels i Calr exon 9, liknar dem som observerats hos patienter som MPN, väljs för, vilket resulterar i cytokin-oberoende tillväxt och omvandling av Ba/F3 celler. Tillväxtkurvan genomfördes sammanlagt 8 dagar och cellerna räknades varannan dag för att mäta deras omvandling (figur 3)19. Cell pellets för genomisk DNA-extraktion samlades innan starten av tillväxtkurvan och i slutet av tillväxtkurvan för att kontrollera på målet redigering och att övervaka de indels som expanderat post cytokin svält (figur 3)19.
Cytokin oberoende tillväxt observerades hos Calr-riktade Ba/F3-MPL-Cas9 celler (figur 4B), men inte Calr-riktade föräldraledighet Ba/F3-Cas9 celler (figur 4A) eller Ba/F3-Cas9 celler ectopically uttrycker EPOR (figur 4 c ) eller G-Tjeckoslovakien (figur 4 d)19. För att bekräfta att mIL-3 oberoende tillväxt i Calr-riktade Ba/F3-MPL-Cas9 celler var ett resultat av på målet gen redigering, celler skördas 8 dagar post mIL-3 uttag och genomiskt DNA var extraherade19. En 422 bp region som spänner över målplatsen förstärktes med primers som anges i tabell 3. Sub kloning av PCR-amplikoner utfördes och 30 enskilda kloner sändes till Sanger sekvensering. För m1 eller m2 Calr-riktade Ba/F3-MPL-Cas9 celler, alla sub kloner innehöll indels av varierande storlekar på avsedda skär webbplats (figur 5)19. 11 av 13 m1 sub kloner konstaterades att innehålla indels som ledde till + 1 bp frameshift mutationer (figur 5), liknande dem som finns i patienter. För m2 Calr-riktade celler, 10 av 17 sub kloner befanns innehålla indels som ledde till + 1 bp bassubstitutioner (figur 5)19. Dessa uppgifter bekräftar att CRISPR/Cas9-medierad införandet av + 1bp frameshift mutationer att den endogena Calr exon 9 locus är tillräcklig för att ge onkogen aktivitet till Calr19. Sekvensering data i figur 5 tyder också på att införandet av heterozygot + 1bp frameshift mutationer det endogena Calr locus är tillräcklig att förvandla Ba/F3-MPL celler, konsekvent med observationen att CALR mutationer är vanligtvis heterozygot i MPN patienter17,18. Eftersom NHEJ reparation resulterar i hög heterogenitet mellan indels, kunde enda cell sortering för att isolera en klon av intresse utföras. Detta skulle göra det möjligt för forskaren att studera effekterna av specifika mutationer skapad av CRISPR/Cas9.
Figur 1: Schemat för CRISPR/Cas9 genredigering inriktning av exon 9 av Calr. Två sgRNAs var utformade för att rikta en webbplats inom regionen mus Calr exon 9 motsvarar som riktas av den + 1bp frameshift mutationer i mänskliga MPN (röd stapel). Målet sekvenser med PAMs (mörkblå) visas, och beräknade platser av klyvning av Cas9 indikeras med röda trianglar. DSBs genereras av CRISPR/Cas9 sedan repareras av NHEJ, vilket förväntas generera indels av variabel längd19. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Cas9 aktivitet assay. Föräldraledighet Ba/F3 och Ba/F3 celler överuttryck Cas9 var sensorik med pXPR-011 att mäta Cas9 aktivitet. En minskning av GFP korrelerar med ökad Cas9 aktivitet. Föräldraledighet Ba/F3 celler är ~ 100% FITC + jämfört med Ba/F3-Cas9 celler där FITC minskas med ~ 76%. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: tidslinjen för infektion och urval av sgRNAs i Ba/F3 celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Införandet av + 1 bp frameshift mutationer i den endogena Calr locus är tillräcklig för att ge onkogen aktivitet till Calr. (A-D) tillväxtkurvor i föräldraledighet Ba/F3-Cas9 celler (A) Ba/F3-MPL-Cas9 celler (B), Ba/F3-EPOR-Cas9 celler (C), och Ba/F3-G-tjeckiska-Cas9 celler (D) visar IL-3 oberoende tillväxt i Calr-riktade Ba / F3-MPL-Cas9 celler bara19. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Sanger sekvensering verifiering. Bekräftelse på målet redigering av endogena Calr (exon 9) i Ba/F3-MPL celler. + 1 bp frameshift mutationer indikeras i svart19. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Målgenen | sgRNA ID | Målet sekvens (5' till 3') | Strand | Klyvning effektivitet | Off-target Poäng | ||
| Calr | M1 | AGAGGACAAGAAGCGTAAAGAGG | + | 0,7 | 70 | ||
| Calr | m2 | GAGGCTTAAGGAAGAAGAAGAGG | + | 0,3 | 28 | ||
Tabell 1:20-mer protospacer sekvenser inklusive PAM webbplats (i fetstil) för två sgRNAs inriktning exon 9 av Calr 19.
| Primer-ID | Sekvens (5' till 3') |
| M1-F | CACCGAGAGGACAAGAAGCGTAAAG |
| M1-R | AAACCTTTACGCTTCTTGTCCTCTC |
| m2-F | CACCGAGGCTTAAGGAAGAAGAAG |
| m2-R | AAACCTTCTTCTTCCTTAACCTC |
Tabell 2: Protospacer sekvenser och deras omvänd kompletterar med ”CACC” och ”AAAC” läggas till för kloning i pLenti-Guide vektor med BsmBI restriktionsenzym 19.
| Primer-ID | Sekvens (5' till 3') |
| Calr_Fwd | ACCACCTGTCTTTCCGTTCT |
| Calr_Rev | GGCCTCTACAGCTCATCCTT |
Tabell 3: CRISPR screening PCR primers uppströms och nedströms av webbplatsen sgRNA klyvning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här visar vi användningen av CRISPR/Cas9 gen redigering för att studera den biologiska funktionen av CALR mutationer i hematopoetiska celler. Framgången med detta protokoll är starkt beroende av flera faktorer. Först, är det viktigt att veta vilka typer av mutationer kan vara ansvarig för den fenotyp som önskas. I detta protokoll, utslaget är omvandlingen av Ba/F3 celler till mIL-3 självständighet och typerna av mutationer är indels i exon 9 av CALR. Dock om önskad mutationen är en enda baspar substitution, är HDR-medierad reparation att föredra eftersom det kan införa precisa punktmutationer eller infogningar från en enda-strand eller dubbelsträngat DNA givare mall2, 3. om det är önskvärt att knockout genen, sedan skapandet av storskalig genomisk borttagningar inriktning tidiga kodande exoner är program20.
Andra måste raden cell vara cytokin-beroende för att möjliggöra positiva urval tryck post cytokin tillbakadragandet. Det är viktigt att notera att inte alla cellinjer kan tolerera stabilt uttryck för Cas9 (se steg 6.3). Detta kan bero på en blasticidin selektering som inte tolereras av alla cellinjer. I detta fall, kan val av andra Cas9 konstruktioner med olika urval kassetter vara nödvändigt. En varning för att använda cytokin-beroende cellinjer, som Ba/F3 celler är att de är mottagliga för spontana cytokin oberoende tillväxt, ibland till följd av förvärvet av mutationer i genen ectopically uttryckt intresse efter cytokin uttag21. Följaktligen krävs användning av lämpliga kontroller för att vara säker på att den observerade cellulära omformningen beror på målet CRISPR gen redigering. I detta protokoll, vi inte iaktta cellulära omvandling i Ba/F3-MPL sensorik med en icke-inriktning sgRNA kontroll eller i Ba/F3-EPOR och Ba/F3-GCSFR celler sensorik med Calr-riktade sgRNAs. Detta ger ytterligare förtroende att cellulära omvandling i Ba/F3-MPL celler är ett resultat av på målet redigering av det endogena Calr -locus.
I detta protokoll introducerar DNA-reparation av NHEJ indels i varierande storlekar som kan ses i figur 5. Analys av Sanger sekvensering utfördes på delmängder av bulk befolkningen av redigerade celler för att leta efter utbyggnaden av indels som leder till + 1 bp frameshift mutationer post cytokin uttag. Nästa generations sekvensering som nämns i steg 9,9 är ett mer robust sätt att kvantifiera på målet redigering för bulk cellpopulationer. Om analys på en specifik klon önskas, då är enda cell sortering av bulk befolkningen nödvändigt. Enstaka cell sortering är fördelaktiga i att förstå den biologiska effekten som följd av en viss typ av mutation och är användbart när målet är att förstå skillnaderna mellan två olika typer av mutationer.
Ett bekymmer med CRISPR/Cas9-systemet är off-target effekter som klyvning händelser utanför den berörda regionen. Att bedöma specificiteten av CRISPR/Cas9 systemet och se till att de transformerade populationerna inte innehåller någon off-target effekter som leder till den observerade omvandlingen, skulle vi behöva undersöka om gen editering inträffade utanför regionen intresse. Detta kan göras genom att leta bevis för Cas9/NHEJ-driven gen editering på potentiella off-target genomisk loci med betydande sekvens likhet till det avsedda målet. För detta, nästa generations sekvensering kan också användas för att kvantitativt bedöma frekvensen av off-target effekter på angivna platser längs genomet. För att minska risken för off-target effekter, skulle olika faktorer kunna införlivas i protokollet. Som nämnts i resultaten, säkerställer studera flera sgRNAs inriktning regionen av intresse att fenotypen är ett resultat av en händelse som på målet. Nyligen genomförda studier har dessutom föreslagit att stympad sgRNAs med 17 nukleotider kan minska frekvensen av off-target klyvning händelser22. Dessutom kan kan långvarig exponering för Cas9 från stabil uttryck resultera i en högre frekvens av off-target effekter. Det är viktigt att notera att en dual vector systemet som innehåller både Cas9 och sgRNA kunde användas i protokollet i stället för stabil uttryck av Cas9; men tenderar dessa vektorer att vara mycket stora och resultera i en låg lentiviral titer och lägre infektion effektivitet. Som ett resultat, kunde övergående transfection för den Cas9 construct i cellerna av nucleofection användas. Senaste rapporter har också utvecklat Cas9 konstruktioner med högre specificitet för på målet redigering, såsom eSpCas9 konstruera6.
Sammanfattningsvis representerar CRISPR/Cas9 en effektiv, billig och pålitlig arvsmassa tekniska verktyg, vilket möjliggör studier av genetiska mutationer på fysiologiska uttryck nivåer. Här använder vi CRISPR/Cas9 gen redigering som en robust och effektiv metod för att främja förståelsen av de funktionella effekterna av CALR mutationer i hematopoetiska celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inga intressekonflikter som relaterade till detta betänkande.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av NIH (R01HL131835), en Damon Runyon klinisk utredare award och Starr Cancer Consortium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BsmBI | New England Biolabs | R0580L | |
| Blasticidin | Sigma Aldrich | 15025 | |
| Puromycin | Life Technologies | A1113803 | |
| Stbl3 cells | Life Technologies | C737303 | |
| TransIT-LT1 | Thermo Fisher Scientific | MIR2300 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 51985034 | |
| RPMI | Thermo Fisher Scientific | MT10040CV | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Omega Scientific | FB-11 | |
| Penicillin/streptomycin/L-glutamine | Life Technologies | 10378016 | |
| mIL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| psPAX2 | Addgene | N/A | |
| pCMV-VSV-G | Addgene | N/A | |
| pLX_TRC311-Cas9 | Addgene | N/A | |
| polybrene | Sigma Aldrich | H9268 | |
| pXPR-011 | Addgene | N/A | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genessee Scientific | 25-507 | |
| TAE buffer | Thermo Fisher Scientific | FERB49 | |
| LentiGuide-Puro | Addgene | Plasmid #52963 | |
| PNK | New England Biolabs | M0201S | |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Miniprep kit | Qiagen | 27104 |
References
- DeWitt, M. A., et al. Selection-free genome editing of the sickle mutation in human adult hematopoietic stem/progenitor cells. Sci Trans Med. 8, 360 (2016).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 4, 347-355 (2014).
- Gaj, T., Gerbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31 (7), 397-405 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Wiedenheft, B., Samuel, S. H., Doudna, J. A. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archea. Nature. 482 (7385), 331-338 (2012).
- Slaymaker, I. M., Gao, L., Zetsche, B., Scott, D. A., Yan, W. X., Zhang, F. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science. 351 (6268), 84-88 (2016).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
- Larson, M. H., et al. CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression. Nat Protoc. 8 (11), 2180-2196 (2013).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Kim, H. S., et al. CRISPR/Cas9-mediated Gene-knockout screens and target identification via Whole genome sequencing uncover host genes required for picornavirus infection. J Biol Chem. 10, 1074 (2017).
- Heckl, D., et al. Generation of mouse models of myeloid malignancies with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing. Nat Biotechnol. 32 (9), 941-946 (2014).
- Daley, G. Q., Baltimore, D. Transformation of an interleukin 3-dependent hematopoietic cell line by the chronic myelogenous leukemia-specific bcr/abl protein. Proc Natl Acad Sci USA. 85, 9312-9316 (1988).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17, 148 (2016).
- Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nat Biotechnol. 32, 1262-1267 (2014).
- Brinkman, E. K., et al. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucl Acid Res. 42, e168 (2014).
- Klampfl, T., et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. N Engl J Med. 369, 2379-2390 (2013).
- Nangalia, J., et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. N Engl J Med. 369, 2391-2405 (2013).
- Elf, S., et al. Mutant Calreticulin requires both its mutant C-terminus and the thrombopoietin receptor for oncogenic transformation. Cancer Discovery. 6 (4), 368-381 (2016).
- Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell lines via CRISPR/Cas9. J. Vis. Exp. (95), e52118 (2015).
- Watanabe-Smith, K., et al. Analysis of acquired mutations in transgenes arising in Ba/F3 transformation assays: findings and recommendations. Oncotarget. 8, 12596-12606 (2017).
- Fu, Y., et al. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. NatBiotechnol. 32, 279-284 (2014).
