Summary
Un protocole amélioré est présenté pour la mesure de l’expression transitoire de constructions de journaliste dans les cellules d’aleurone orge après le bombardement par des particules. La combinaison d’automatisé grain de meulage avec essais enzymatiques plaque 96 puits offre un débit élevé pour la procédure.
Abstract
La couche d’aleurone de grains d’orge est un important système modèle pour l’expression génique réglé par hormone chez les plantes. Dans les cellules d’aleurone, gènes requis pour la germination ou du développement de la plantule sont activés par la gibbérelline (GA), tandis que les gènes associés à des réactions de stress sont activés par l’acide abscissique (ABA). Les mécanismes de signalisation de GA et ABA peuvent être interrogés en introduisant des constructions de gène de journaliste dans les cellules d’aleurone par bombardement par des particules, avec l’expression transitoire résultante mesurée à l’aide d’essais enzymatiques. Un protocole amélioré est rapporté que partiellement automatise et simplifie l’étape d’homogénéisation de grain et les dosages enzymatiques, ce qui permet un débit nettement plus que les méthodes existantes. Homogénéisation des échantillons de grain se faite avec un homogénéisateur tissus automatisés, et GUS (β-glucuronidase) essais sont effectués à l’aide d’un système de plaque à 96 puits. Les résultats représentatifs en utilisant le protocole suggèrent que l’activité phospholipase D jouerait un rôle important dans l’activation de l’expression de gène HVA1 par l’ABA, par le facteur de transcription TaABF1.
Introduction
La couche d’aleurone de l’orge est un système de modèle bien établi pour l’étude de l’expression génique réglé par hormone en plantes1. En particulier, un certain nombre de gènes nécessaires à la germination ou du développement de la plantule est activé par la gibbérelline (GA), tandis que les gènes associés à des réactions de stress sont activés par l’acide abscissique (ABA). Le GA et ABA, voies de signalisation sont entrelacées, comme l’expression de certains gènes activés par le GA est inhibée par l’ABA et vice versa1.
Une stratégie utile pour comprendre que le rôle des acteurs particuliers dans la signalisation de GA/ABA a été l’introduction d’effecteur gènes chimères par bombardement par des particules, suivi d’une expression transitoire de constructions de journaliste qui permettent l’effet qui en résulte sur expression des gènes en aval à déterminer. L’utilisation de gènes rapporteurs comme GUS (β-glucuronidase) ou de la luciférase permet la mesure sensible et quantitative de l’expression des gènes spécifiquement dans les cellules qui ont reçu la construction de l’effecteur. Par exemple, l’introduction d’une construction d’effecteur codant le facteur de transcription TaABF15,6 établi que gènes induite par l’ABA comme HVA1 sont induits par la TaABF1, tout en GA-induite des gènes tels que Amy32b sont réprimés. Bombardement de particules comme une stratégie expérimentale a été utilisé par plusieurs laboratoires pour étudier divers aspects de la GA/ABA de signalisation. Ce travail a conduit à l’identification des éléments du promoteur importants pour l’activation de gènes induite par l’ABA3et induite par le GA2 et à la découverte des protéines kinases4 et facteurs de transcription5 qui régulent la expression de ces gènes.
L’existant protocoles2,3,4,5,6 pour le bombardement par des particules et mesure subséquente d’expression transitoire sont travail très intensif, comme chaque ensemble de bombardé à peine les grains soit homogène à la main dans un mortier et un pilon et les dosages enzymatiques sont effectués individuellement. Ce manuscrit rapporte un protocole amélioré que partiellement automatise et simplifie l’étape d’homogénéisation et le GUS dosages pour permettre un débit nettement plus, permettant un plus grand nombre de traitements pour être testés dans la même expérience, ou la inclusion de plusieurs répétitions pour chaque traitement afin d’obtenir davantage de résultats statistiquement robuste. Résultats représentatifs sont indiqués pour l’expression de constructions journaliste HVA1 et Amy32b , régie par le facteur de transcription TaABF1, ainsi que par les GA, ABA et autres molécules régulatrices.
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Protocol
1. préparation des effecteurs et gène rapporteur construit
- Construire des constructions d’effecteur qui emploient un promoteur constitutif (p. ex. maïs ubiquitine, UBI) à l’expression de la voiture d’un cadre de lecture souhaité. Par exemple, construire un plasmide contenant UBI::TaABF1 à disque forte l’expression constitutive de TaABF15.
- Construire des constructions de journaliste qui incluent le promoteur dont l’activité consiste à mesurer, placé en amont d’un cadre de lecture ouvert comme GUS. Par exemple, construire un plasmide contenant HVA1::GUS permettant de mesurer l’expression de la HVA1 promoteur2,5.
- Construire une structure de contrôle interne (p. ex. UBI::luciférase).
- À l’aide d’une colonne de silice liaison protocole (voir Table des matières), préparer le plasmide de haute qualité pour chacune des constructions gène nécessaire. En utilisant la spectroscopie ultraviolette (voir Table des matières), soigneusement mesurer la concentration de chaque préparation de plasmide.
2. préparation des Grains d’orge bombardement
- Mettre en place une feuille de calcul (voir Figure 1 pour un exemple) indiquant les plasmides qui seront bombardés, les traitements appropriés de l’hormone et autres informations pertinentes pour chaque traitement qui fera partie de l’expérience.
- À l’aide d’une planche à découper et une lame de rasoir stérile, couper les embryons de grains d’orge Himalaya (40 pour chaque traitement comprise dans le test). Exclure les grains qui sont décolorés ou sensiblement inférieur à la moyenne.
- Placez tous les grains d’embryoless dans un tube de 50 mL. Ajouter 40 mL d’eau et de roche pendant 10 minutes.
- Versez l’eau soigneusement (pour éviter de perdre des grains), ajouter 40 mL d’eau de Javel de 10 %. Rock pendant 20 minutes.
- Versez l’eau de Javel, ajouter 40 mL d’eau stérile. Rock pendant 5 minutes. Répéter ce lavage à l’eau stérile, quatre fois plus.
- Ajouter 40 mL de Solution d’imbibition (succinate sodique de 20 mM, 20 mM chlorure de calcium, pH 5.0) et 40 μL de solution étalon de chloramphénicol (10 mg/mL).
- Transférer la plus grande partie de la Solution de s’imbiber (avec chloramphenicol) du tube dans une assiette de Vermiculite (voir Table des matières). Puis transférez les grains à la surface du papier filtre humide dans les plaques de Vermiculite. Étaler uniformément les grains. Verser dans une solution assez on pour garder les grains partiellement (mais pas complètement) immergé. Placez le couvercle sur la plaque de Vermiculite.
- Incuber les grains embryoless à 24 ° C pendant environ 48 heures avec un éclairage fluorescent. Ajouter la Solution de s’imbiber supplémentaires si nécessaire.
- Ouvrir une boîte de Pétri plastique 90 mm et verser 20 mL de Solution s’imbiber dans le plat lui-même et 20 mL dans le couvercle inversé. Ajouter 20 μL de chloramphénicol (10 mg/mL) à chacun. Stériliser les deux paires de pinces à pointe fine en les plongeant dans de l’alcool.
- Placez quelques uns des grains embryoless dans le couvercle de la boîte de Pétri. À l’aide de la pince, retirez délicatement le tégument (transparent) de chaque grain. Tout en éliminant les téguments de la graine du côté du grain lisse, ne pas endommager les cellules (aleurone) sous-jacentes. Transférer le grain Pelé dans la boîte de Pétri contenant la Solution de s’imbiber.
- Après avoir épluché les téguments de la graine de tous les grains, les retourner à la plaque de Vermiculite. Incuber les grains embryoless pelées à 24 ° C pendant 16 à 20 heures.
- Juste avant d’utiliser les grains pour le bombardement, enlever l’humidité de surface par les secousses entre papier-filtre dans une boîte de Pétri.
3. préparation d’ADN plasmidique de bombardement
- Étiqueter un tube de 1,5 mL pour chaque traitement qui figurera dans l’expérience de bombardement. Dans chaque tube, ajouter 2,5 µg d’UBI:: plasmide contrôle interneluciférase , 2,5 µg d’un plasmide de journaliste de GUS et la quantité désirée (en général 0,025 µg à 2,5 µg) d’un plasmide effecteur. Ajouter de l’eau pour porter le volume total à 5 µL.
- Préparer 1,6 µm or microporteurs (voir Table des matières) protocoles6publiés.
- Pour chaque traitement, ajouter 50 µL de suspension microporteurs dans le tube de 1,5 mL contenant l’ADN de plasmide. Enrober les microporteurs avec l’ADN de plasmide selon protocoles6 du fabricant.
- Dans l’étape finale, lorsque les plasmide-enduit microporteurs sont suspendus dans 48 µL 100 % d’éthanol, pipette 8 μL des microporteurs suspendu sur chacun des cinq macrocarriers et laissez-les à l’air sec.
4. particules bombardement de Grains d’orge Embryoless
- Mettre en place l’appareil de bombardement de particules (voir la Table des matières)6.
- Placez un disque de rupture 1550 lb/po2 dans la PAC retenue et installez-le sur l’instrument.
- Placez un macrocarrier contenant la combinaison désirée plasmidique (avec un écran d’arrêt) dans l’ensemble de lancement avec des microporteurs. Insérer l’ensemble dans la fente supérieure de la chambre de bombardement. La distance entre le disque de rupture, garder le cap et le macrocarrier du couvercle à la distance standard (6 mm) et y déposer le support d’écran arrêt la position centrale (standard), ce qui permet une distance de voyage macrocarrier de 11 mm (Figure 2 a).
- Disposer 8 grains d’embryoless dans un modèle radial serré (avec les extrémités plus minces pointant vers l’intérieur) sur un cercle de papier filtre qui est collé à plat sur le couvercle d’une boîte de Pétri 90 mm (voir Figure 2 b).
- Placez le plat avec les grains dans la chambre de bombardement, à une distance de 6 cm de l’écran de s’arrêter.
- Évacuer la chambre de bombardement à 95 kPa et puis bombarde l’échantillon.
- Après avoir relâché le vide, transférer les grains ont bombardé à un marqué 60 mm boîte de Pétri contenant 4 mL de Solution s’imbiber contenant 1 mg/ml de chloramphénicol.
- Répétez jusqu'à ce que tous les bombardements sont terminés. Incuber (sur une plateforme vibrante à 100 tr/min) à 24 ° C pendant 24 heures.
5. extraction des protéines solubles des Grains ont bombardé
- À l’aide de pinces, retirer les 8 grains ont bombardé un plat de Pétri de 60 mm et épongez les sécher sur du papier absorbant. Diviser les grains en deux tubes étiquetés 2,0 mL (4 grains par tube) chacun contenant 800 μL tampon de meulage (100 mM Na phosphate pH 7,2, 5 mM DTT, 10 µg/mL leupeptine, 20 % de glycérol) et une bille en acier inoxydable de 5 mm. Répétez ce processus pour tous les grains ont bombardé.
- Placer (jusqu'à 48) 2,0 mL tubes dans les deux paniers de l’homogénéisateur de perle (voir Table des matières). Monter les supports sur l’homogénéisateur.
- Agiter les échantillons à 30 Hz pendant 3 minutes.
- Retirer les grilles de l’homogénéisateur de l’homogénéisateur et placez-les sur la glace (5 min) pour re-refroidir les échantillons.
- Monter les supports sur l’homogénéisateur - dans le sens opposé. Agiter à nouveau les échantillons à 30 Hz pendant 3 minutes.
- Refroidir les grilles sur la glace, puis répétez les étapes 5.3 à 5.5. Cela s’ajoutera jusqu'à un total de 12 minutes d’agitation.
- Centrifuger les extraits de grains à 16 000 x g à 4 ° C pendant 10 minutes.
- Décanter immédiatement après la centrifugation, le surnageant clair dans une seconde série de tubes de microcentrifuge. Donner à chaque tube un tourbillon rapide. Stocker les tubes sur la glace.
- Après avoir transféré le surnageant, récupérer les billes en acier de boulettes donc ils peuvent être lavés et réutilisés.
6. mesure de l’activité de la luciférase dans des extraits de Grain
- Pour chaque tube d’extrait de grain à doser, préparer un tube de verre de 12 mm x 75 mm contenant 200 μl du mélange d’essai luciférase (45 mM Tris sulfate pH = 7,7, 15 mM MgCl2, 20 mM DTT, 1,5 mM EDTA, luciférine de 1 mM, 1 mM ATP).
- Ajouter 100 μl de l’extrait de grain premier dans le premier tube de dosage. Vortex rapidement pour bien mélanger. Immédiatement , placer le tube dans le porte-tube de luminomètre et fermer la porte. Lorsque la mesure est terminée, retirer le tube du luminomètre – laissant la porte ouverte pour placer le tube suivant.
- Répétez ce processus jusqu'à ce que tous les échantillons ont été mesurés.
7. mesure de l’activité de GUS dans des extraits de Grain
- Ajouter 200 μl de tampon de GUS (50 mM Na phosphate, pH 7,2, 2,5 mM 4-méthylumbelliféryl - D-glucuronide, 10 mM TNT, 2 mM EDTA, 10 µg/mL leupeptine, 20 % de méthanol, 0,02 % d’azide de sodium) dans chaque puits d’une plaque 96 puits.
- Place 50 μL de chaque extrait de grain dans le bien qui correspond. Mélanger avec le bout après l’ajout. Sceller la partie supérieure avec film d’étanchéité.
- Incuber la plaque 96 puits à 37 ° C dans l’obscurité pendant 20 heures.
- Centrifuger la plaque 96 puits à 4 000 x g à 4 ° C pendant 10 minutes et placez-le sur la glace.
- Ajouter 250 μL de 0,2 M Na2CO3 dans chaque puits d’une plaque bien noir 96.
- Ajouter 6,25 μL de chaque mélange de dosage GUS centrifugé dans la correspond bien (contenant 0,2 M Na2CO3) de la black 96 bien plate. Mélanger avec le bout après l’ajout. Inclure les puits avec 6,25 μL de 10 μM, 40 μM et 100 μM 4-méthylumbelliférone comme normes.
- Placez la plaque noire dans un fluorimètre plaque et lire la fluorescence de la méthylumbelliférone. Prendre la lecture à une longueur d’onde d’excitation de 360 nm et une longueur d’onde d’émission de 460 nm. Réglez le gain de l’instrument tel qu’un bien contenant μL 6,25 de 40 μM 4-méthylumbelliférone et 250 μL de 0,2 M Na2CO3 donnent une lecture de 1000 unités de fluorescence.
8. analyse des données
- Entrez les valeurs de la luciférase et dosages de GUS dans un tableur. Exclure de tout échantillon avec une lecture de la luciférase d’inférieur à 20 000 luminescence relative unités s-1, car cela indique que les gènes chimères n’étaient pas correctement livrés pour les cellules d’aleurone.
- Pour chaque grain bombardé avec succès extrait (représentant un groupe de quatre grains d’embryoless), à calculer l’expression normalisée de GUS partir des données brutes de GUS et de la luciférase comme suit : normalisé GUS = [(expression GUS - GUS vide) x (2 000 000)] / (luciférase expression – luciférase vide).
Remarque : Cela normalise le volume d’activité GUS à ce qui serait ont été observé dans un bombardement qui a donné une lecture de la luciférase de 2 000 000. - Signaler le niveau relatif d’expression d’une construction particulière de journaliste en présence d’effecteur des constructions ou des traitements hormonaux testées en comparant le niveau d’expression en l’absence d’hormones ou les effecteurs.
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Representative Results
La technique décrite ici peut servir à introduire toute construction de test génétique dans des cellules d’aleurone de grains d’orge. Le niveau d’expression du gène de l’essai peut alors être idéalement mesuré (Figure 2). Le protocole de débit supérieur décrit ici grandement augmente l’efficacité de la graine de meulage et les étapes de test enzyme. Cette méthode a été utilisée pour évaluer la capacité de la transcription factor TaABF15,6 pour activer l’expression du gène induite par l’ABA HVA17. Dans les résultats représentatifs présentés ici, une construction de journaliste HVA1::GUS a été introduite dans des cellules d’aleurone avec un élément d’effecteur de UBI::TaABF1 (Figure 3 a). Tout en un TaABF1/HVA1 ratio de seulement 0,01 était suffisante pour entraîner une facteur 3 de l’induction du gène HVA1 journaliste en l’absence d’ABA exogène, des niveaux plus élevés de la construction TaABF1 a entraîné progressivement une plus grande HVA1 expression, de manière dose-dépendante (Figure 3 bC).
Ce protocole expérimental peut-être également intégrer l’utilisation d’hormones ou d’autres composés pendant la période d’incubation après bombardement afin d’évaluer le rôle de ces molécules dans la régulation de l’expression des gènes. Des travaux antérieurs par d’autres chercheurs a suggéré l’importance de la phospholipase D dans certains aspects de signalisation de l’ABA. Plus précisément, le produit de l’activité de la phospholipase D, l’acide phosphatidique, a été impliqué comme intermédiaire dans certaines réponses à ABA8,9. Le fait que 1-butanol, un inhibiteur de la phospholipase D (PLD), a été établi qu’à empêcher l’expression des gènes induits par ABA dans les cellules d’aleurone suggère que le PLD pourrait faire partie intégrante de signalisation de l’ABA dans ce tissu. Le protocole de bombardement a été utilisé pour tester si le butanol-1 pourrait inhiber expression HVA1 induite par l’ABA ou induite par le TaABF1. Comme prévu, soit exogène ABA ou TaABF1 pourrait induire fortement expression de la construction de journaliste HVA1::GUS (Figure 3). Dans les deux cas, la présence de 1-butanol inhibe fortement l’induction HVA1 . Ceci suggère que le PLD pourrait jouer un rôle important dans l’activation de l’expression génique HVA1 par l’ABA, par l’intermédiaire de TaABF1.
Outre son rôle dans le développement et la germination des grains, ABA est également critique pour réguler l’ouverture des stomates dans les feuilles. Dans les cellules de garde des stomates, la production d’acide phosphatidique est stimulée par l’oxyde nitrique (NO), qui est à son tour induite par le peroxyde d’hydrogène (H2O2). Pour certaines réponses, n et H2O2 peut se substituer à l’ABA9. Pour déterminer si c’est aussi le cas dans les cellules d’aleurone, le protocole de bombardement a été utilisé pour tester si le donneur de NO nitroprussiate de sodium (SNP) ou H2O2 pourrait remplacer ABA pour inhiber l’expression de le induite par le GA Amy32b gène. Alors que ABA pourrait fortement inhibent l’expression induite par le GA pour le journaliste Amy32b::GUS construire, H2O2 ni SNP causé aucune réduction significative (Figure 3D). Ces résultats, par conséquent, ne supportent pas un rôle pour NO et H2O2 dans les réponses des cellules ABA aleurone.
Figure 1 : Feuille de calcul pour une expérience typique bombardement. Le montant de chaque préparation de plasmide à placer dans le tube pour chaque bombardement est indiqué. Dans cette expérience, quatre coups de feu (8 grains chacun) ont été utilisés pour chaque traitement pour un total de huit échantillons possibles (4 grains) pour chaque traitement. Afin de maintenir la même concentration d’ADN totale dans chaque bombardement, un plasmide effecteur « fictive » a été utilisé pour remplacer le plasmide effecteur de UBI::TaBF1 dans certains cas. Le traitement A est un bombardement « en blanc » pour établir le niveau de fond de l’activité de GUS et de la luciférase dans les cellules d’aleurone. Les résultats de l’expérience de bombardement décrites dans cette feuille de calcul sont indiquées dans la Figure 3 b. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Schéma du protocole. (A) schéma de l’appareil de bombardement. (B) les particules d’or recouvertes d’une construction de journaliste transportant le promoteur à tester, un effecteur (si nécessaire) et un contrôle interne (UBI::luciferase) sont introduits dans les cellules d’aleurone de l’orge par bombardement par des particules. Après une incubation (généralement de 24h), les grains sont broyés et dosé pour activité GUS et activité de la luciférase. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Règlement des promoteurs HVA1 et Amy32b par des médiateurs potentiels de signalisation de l’ABA, ABA et TaABF1. (A) les constructions de journaliste et d’effecteur utilisées dans les expériences. (B) la construction de l’effecteur UBI::TaABF1 a été conjointement bombardée en cellules d’aleurone avec le journaliste HVA1::GUS et le concept de contrôle interne (UBI::luciferase). La quantité d’effecteur des UBI::TaABF1 (par rapport à la journaliste HVA1::GUS ) variait de 0 à 0,1, tel qu’indiqué ci-dessous les barres. Activité de GUS et de la luciférase a été mesurée après 24 h d’incubation. Données présentées sont le moyen (± écart type) de 6 à 8 répétitions biologiques. (C) le journaliste HVA1::GUS , a été bombardé conjointement dans les cellules d’aleurone avec le concept de contrôle interne (UBI::luciferase), en présence ou en absence de la construction de l’effecteur UBI::TaABF1. Le montant d’effecteur des TaABF1 (par rapport à la journaliste) est 1.0. Activité de GUS et de la luciférase a été mesurée après 24 h d’incubation avec ou sans 20 µM ABA et 0,4 % 1-butanol. (D) le journaliste de Amy32b::GUS a été conjointement ont bombardé en cellules d’aleurone avec le concept de contrôle interne (UBI::luciferase). Activité de GUS et de la luciférase a été mesurée après 24 h d’incubation en présence de 1 mM GA avec ou sans ABA 20 µM et 1 mM H2O2100 µM de nitroprussiate de sodium (SNP). Valeurs d’activité GUS sont relatives à l’expression de la journaliste de Amy32b::GUS en l’absence de GA. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
L’introduction du gène de l’effecteur construit par bombardement par des particules, suivie d’une expression transitoire de constructions de journaliste est une stratégie utile pour disséquer le rôle des acteurs particuliers dans la signalisation de GA/ABA et du gène réglementés hormone qui en résulte expression.
Cependant, les protocoles existants pour mener à bien de telles expériences dans l’orge aleurone cellules2,3,4,5,6 sont très demande beaucoup de travail. Chaque groupe de bombardés à peine grains doivent être homogénéisée dans un mortier et un pilon à la main, et les extraits qui en résultent sont testés individuellement pour activité GUS et la luciférase. Les protocoles actuels donc limitent le nombre de traitements distincts qui peuvent être inclus dans la même expérience et de limiter le nombre de réplicats biologiques qui peuvent raisonnablement être inclus pour chaque traitement. Ces limitations, il est plus difficilement d’effectuer des comparaisons entre plusieurs traitements globale et simultanées. Ces comparaisons peuvent être particulièrement difficiles si la différence de l’expression des gènes entre les traitements est modeste et un assez grand nombre de réplicats biologiques est nécessaire pour établir la signification statistique.
Un protocole simplifié est présenté ici que partiellement automatise la préparation d’extrait de grain et le GUS dosages pour permettre un débit nettement plus élevé. Cette nouvelle version de la fait de protocole possible d’inclure un plus grand nombre total d’échantillons dans une expérience, permettant une fois l’inscription de plus différents traitements par expérience et plus il se réplique pour chaque traitement. Pour la préparation d’extraits de grain après le bombardement et l’incubation, nous avons substitué un protocole de meulage en grande partie automatisé qui utilise un homogénéisateur de perle qui peut traiter 48 échantillons simultanément (en environ 20 minutes). Ainsi, un seul enquêteur peut préparer des protéines solubles extraits de près de 200 échantillons en moins de temps qu’il faudrait une équipe de quatre enquêteurs à main moudre seulement 100 échantillons. Le test mis à jour le de GUS, réalisé en plaques de 96 puits, exige aussi beaucoup moins de travail que le protocole original qui employait tube individuel des analyses.
Dans la préparation des mélanges de plasmide de bombardement (étape 3.1), il est possible d’utiliser un processeur d’effets au ratio de journaliste de 1.0, surtout pour des essais préliminaires déterminer si un effecteur particulier n’a aucun effet. Toutefois, en raison de la force du promoteur maïs ubiquitine (UBI), un fort effet peut souvent être observé avec des rapports beaucoup plus faibles, comme on le voit dans la Figure 2 b et rapports déjà publiés4,5,6. Autres étapes cruciales dans le présent protocole comprennent des peeling du tégument des grains d’orge et l’utilisation des réglages soigneusement définis dans l’appareil de bombardement. Si les téguments ne sont pas entièrement éliminés, l’or microporteurs serez empêché de pénétrer dans les cellules d’aleurone axillante. Mise en œuvre réussie de l’or microporteurs dans les cellules d’aleurone dépend également tout à fait le type de disque de rupture utilisée, la position du couvercle avec des microporteurs, écran d’arrêt et tissus à être bombardés. Les conditions rapportées ici typiquement résultat dans la mise en œuvre réussie des gènes chimères (voir étape 8.1) à un pourcentage élevé (≥70 %) des échantillons de grains d’orge ont bombardé. Il faut s’attendre à ce que les autres matériels biologiques nécessiterait différentes conditions pour la livraison de gène optimale.
Bien qu’il n’est pas décrit ici, il serait possible de simplifier davantage la procédure en effectuant les essais de la luciférase flash en plaques bien 96. Cependant, la production de lumière de la luciférase doit être mesurée dans un luminomètre immédiatement après le mélange de la protéine extrait avec le substrat (luciférine), cela nécessiterait l’utilisation d’un luminomètre flash de plaque avec injecteurs, un instrument qui est beaucoup plus cher qu’un luminomètre tube unique.
Les résultats représentatifs présentés ici confirment que le facteur de transcription TaABF1 peut activer HVA1 expression en l’absence de5,6de l’ABA exogène. Activation de HVA1 par TaABF1 ou ABA exogène a été empêchée par le PLD inhibiteur butan-1-ol, suggérant que la production d’acide phosphatidique par PLD pourrait être requise pour l’activation HVA1 . Ces résulats HVA1 règlement de TaABF1 et de l’ABA sont semblables à ceux obtenus par Zou et al. 10 pour l’activation de HVA22 par le facteur de transcription LtWRKY21 et ABA. La conclusion selon laquelle H2O2 ou SNP ne pas substituer d’ABA exogène en supprimant l’expression aleurone de Amy32b, confirme que certains aspects de signalisation de l’ABA dans les céréales sont différents de ce qui se passe dans les cellules de garde des stomates. La conclusion que H2O2 ne fait pas de downregulate Amy32b expression concorde avec les résultats observés par Ishibashi et al. 11 pour l’activité de l’enzyme amylase.
Le protocole d’un débit plus élevé est maintenant utilisé pour réaliser une étude approfondie des effets de la phosphorylation de TaABF1 sur sa capacité à réguler l’expression des gènes en aval. Comme les autres membres de l’ABF, famille de facteurs de transcription peut être phosphorylée dans un certain nombre de sites différents12,13,14,15,16, phosphorylation putative multiples sites sur TaABF1 doivent être testés. Le débit plus élevé autorisé par le présent Protocole permettra à un grand nombre de versions mutantes de TaABF1 (avec potentiellement phosphorylable sérine et thréonine résidus modifiés) pour être interrogé, chacune avec un grand nombre de biologique réplique.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Greyson Butler et Margaret Barrett pour les aider à réaliser les expériences, Judy Stone pour obtenir des conseils sur l’homogénéisation de grain et Lynn Hannum pour obtenir des conseils sur la fluorométrie. Ce travail a été soutenu par la National Science Foundation (IOB 0443676), par une sentence de développement institutionnel (IDeA) de la National Institute of General Medical Sciences, de la National Institutes of Health, sous le numéro de licence P20GM0103423 et par des subventions de la Division de Colby College des Sciences naturelles.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GeneElute HP plasmid Maxiprep kit | Sigma | NA0310-1KT | |
| UV-vis spectrophotometer | Nanodrop | ND-1000 | |
| Himalaya barley grains | / | / | A variety of hulless barley (store in the dark at 4° C) |
| sodium succinate | Sigma | S2378 | Reagent for Imbibing Solution |
| calcium chloride (dihydrate) | Fisher | C79-500 | Reagent for Imbibing Solution |
| Imbibing Solution | home made | / | 20 mM sodium succinate, 20 mM calcium chloride, pH 5.0. Sterilize by autoclaving before use. |
| chloramphenicol | Sigma | C0378 | Prepare a 10 mg/mL stock solution in 70% ethanol. |
| vermiculite | Fisher | NC0430369 | Used for vermiculite plates. |
| filter paper circles (90 mm) | Whatman | 1001 090 | Used for vermiculite and for pre-bombardment grain preparation |
| Vermiculite Plates | home made | / | Add 50 mL of vermiculite to a glass petri dish. Place a 90 mm paper circle on top of the vermiculite. Autoclave. |
| forceps (fine pointed) | Fisher | 13-812-42 | Used for removing seed coat from barley grains. |
| forceps (ultra fine point) | Fisher | 12-000-122 | Used for removing seed coat from barley grains. |
| gold microcarriers (1.6 μm) | BioRad | 1652264 | |
| macrocarriers | BioRad | 1652335 | |
| calcium chloride (dihydrate) | Fisher | C79-500 | Prepare a 2.5 M stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| spermidine | Sigma | S0266 | Prepare a 100 mM stock solution and store 500 μL aliquots at -20° C (use within 2 months). |
| rupture discs (1550 psi) | BioRad | 1652331 | |
| stopping screens | BioRad | 1652336 | |
| macrocarrier holders | BioRad | 1652322 | |
| Biolistic particle delivery system | BioRad | PDS-1000/He | |
| sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2 |
| sodium phosphate dibasic | Sigma | S9763 | Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2 |
| 1M sodium phosphate pH 7.2 | home made | / | Combine 6.9 g of sodium phosphate monobasic monohydrate with 7.1 g of sodium phosphate dibasic. Add water to 100 mL. Add NaOH to get pH 7.2. |
| dithiothrietol (DTT) | Sigma | 43819 | Dissolve in water to 1 M. Store at -20° in 1 mL aliquots. |
| leupeptin | Sigma | L2884 | Dissolve in water to 10 mg/mL. Store at -20° C. |
| glycerol | Sigma | G5516 | Prepare a 50% solution in water. |
| Grinding Buffer | home made | / | Combine 10 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 500 μL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/mL leupeptin, and 40 mL of 50% glycerol. Add water to 100 mL. |
| stainlesss steel beads (5 mm) | Qiagen | 69989 | |
| 2.0 mL tubes | Eppendorf | 22363352 | This specific model of tube is recommended for use with the homogenizer. |
| bead homogenizer (TissueLyser) | Qiagen | 85210 | |
| 12mm x 75 mm glass test tubes | Fisher | ||
| luciferin | Goldbio | LUCK-100 | Prepare a 25 mM stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| ATP | Sigma | A7699 | Prepare a 100 mM stock solution and store 250 μL aliquots at -20° C. |
| Tris base | Sigma | T1503 | Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7. |
| sulfuric acid | Sigma | 258105 | Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7. |
| 1M Tris sulfate pH 7.7 | home made | / | Dissolve 12.1 g Tris base in 100 mL of water. Adjust pH to 7.7 with sulfuric acid. |
| magnesium chloride | Sigma | M9397 | Dissolve in water to 2 M. |
| Luciferase Assay Buffer (LAB) | home made | / | Combine 3 mL of 1 M Tris sulfate pH 7.7, 500 μL of 2 M magnesium chloride, 1 mL of 1 M DTT, and 200 μL of 0.5 M EDTA. Add water to 50 mL. |
| Luciferase Assay Mixture | home made | / | Combine 15 mL of LAB, 800 μL of 25 mM luciferin, 200 μL of 100 mM ATP, and 4 mL of water. This makes enough assay mixture (20 mL) for 100 luciferase assays. |
| luminometer (Sirius) | Berthold | / | |
| 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG) | Goldbio | MUG1 | Dissolve in DMSO to 100 mM. |
| sodium azide | Sigma | S8032 | Prepare a 2% stock solution in water and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| 96 well plates (standard) | Fisher | 12565501 | |
| GUS assay buffer | home made | / | Combine 2.5 mL of MUG, 5 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 400 μL of 0.5 M EDTA, 1 mL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/ml leupeptin, 20 mL of methanol, and 1 mL of 2% sodium azide. Add water to 100 mL. |
| TempPlate sealing film | USA Scientific | 2921-1000 | |
| 96 well plates (black) | Costar | 3916 | |
| sodium carbonate | Sigma | S7795 | Prepare a 200 mM solution in water. |
| 4-methylumbelliferone | Sigma | M1381 | Prepare a 100 μM solution in water. Freeze 1 mL aliquots at -20° C. |
| microplate fluouresence reader | Bio-Tek | FLX-800 |
References
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