Summary
פרוטוקול משופרת מוצג עבור המידה של ביטוי גנים ארעי מן הכתב בונה בתאים aleurone שעורה לאחר הפגזה של חלקיקים. השילוב של תבואה אוטומטיות שיוף עם צלחת 96-ובכן אנזים מבחני מספק תפוקה גבוהה עבור ההליך.
Abstract
השכבה aleurone של גרגרי שעורה היא מערכת מודל חשוב על ביטוי גנים מוסדר הורמון בצמחים. בתאים aleurone, גנים הדרושים עבור נביטה או להתפתחות שתיל המוקדמת מופעלים על ידי ג'יברלין (ג'י אי), בעוד גנים הקשורים תגובות הלחץ מופעלים על ידי חומצה אבציסית (ABA). המנגנון של GA ו ABA איתות יכולה להיחקר על ידי החדרת כתב ג'ין בונה לתאים aleurone באמצעות הפגזה של חלקיקים, עם ביטוי ארעי וכתוצאה מכך נמדד באמצעות מבחני אנזים. פרוטוקול משופר הוא דיווח זה חלקית הופך לאוטומטיים ופישוט השלב המגון דגן, את מבחני אנזים, ומאפשר תפוקה יותר באופן משמעותי מאשר שיטות קיימות. המגון הדגימות תבואה מתבצעת באמצעות מהמגן רקמות אוטומטיות של, מבחני גאס (β-glucuronidase) מתבצעות באמצעות מערכת צלחת 96-ובכן. נציג תוצאות באמצעות הפרוטוקול מראים כי פעילות phospholipase D עשוי לשחק תפקיד חשוב ההפעלה של ביטוי גנים HVA1 על ידי ABA, דרך הפקטור שעתוק TaABF1.
Introduction
השכבה aleurone שעורה היא מערכת מודל ומבוססת על המחקר של ביטוי גנים מוסדר הורמון צמחי1. בפרט, יש מספר גנים הדרושים עבור נביטה או להתפתחות שתיל המוקדמת מופעלים על ידי ג'יברלין (ג'י אי), בעוד גנים הקשורים תגובות הלחץ מופעלים על ידי חומצה אבציסית (ABA). המשחק ואת ABA מסלולי איתות שלובים זה בזה, כפי הביטוי של גנים מסוימים מופעל GA מעוכבת על ידי ABA, ולהיפך1.
אסטרטגיה חשוב להבין שהתפקיד של שחקנים מסוים ב- GA/ABA איתות כבר המבוא של בונה ג'ין אפקטור באמצעות הפגזה של חלקיקים, ואחריו הביטוי ארעית של בונה כתב לאפשר את האפקט המתקבל על ביטוי גנים במורד הזרם נקבע. השימוש של הכתב גנים כמו גאס (β-glucuronidase) או לוציפראז מאפשר את המדידה רגיש, תפוקה של ביטוי גנים במיוחד בתוך התאים, כי קיבלו הבונה אפקטור. לדוגמה, כניסתה של הבונה אפקטור קידוד של פקטור שעתוק TaABF15,6 הוקם כי ABA-induced גנים כגון HVA1 הם המושרה על-ידי TaABF1, תוך כדי משחק-induced גנים כגון Amy32b . מדוכאים. הפגזה של חלקיקים כמו אסטרטגיית ניסיוני שימש על ידי מעבדות מרובים כדי לחקור היבטים שונים של GA/ABA איתות. עבודה כל כך הוביל לזיהוי של יזם אלמנטים חשובים עבור ההפעלה של GA-induced2 וגם הגנים ABA-induced3, לגילוי של חלבונים kinases4 , תמלול גורמים5 המסדירים ביטוי של גנים אלה.
קיימים פרוטוקולים2,3,4,5,6 עבור חלקיקים הפגזה ומדידה עוקבות של ביטוי גנים ארעי הם די עמל רב, כמו כל קבוצה של מופגז בקושי גרגרים הוא הומוגני על ידי יד ומכתש, מבחני אנזים מבוצעות בנפרד. כתב יד זה מדווח על פרוטוקול משופרת זה הופך לאוטומטיים ופישוט השלב המגון חלקית, מבחני גאס כדי לאפשר תפוקת יותר באופן משמעותי, המתיר מספר גדול יותר של טיפולים כדי שיהיה ניתן לבחון אותו אותו ניסוי, או הכללה של משכפל נוסף עבור כל טיפול להשיג תוצאות סטטיסטית חזקים יותר. נציג התוצאות יוצגו עבור הביטוי של בונה כתב HVA1 , Amy32b , מוסדר על ידי הגורם שעתוק TaABF1, כמו גם על ידי GA, ABA, מולקולות רגולטוריות אחרות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת אפקטור, מדווח בונה
- לבנות מבנים אפקטור כי מעסיקים מקדם מכוננת (למשל תירס אוביקוויטין, UBI) לביטוי נסיעה מן מסגרת קריאה פתוחה הרצוי. לדוגמה, בנו של פלסמיד המכיל UBI::TaABF1 לביטוי מכוננת חזקה נסיעה של TaABF15.
- לבנות מבנים כתב הכוללים ייצוג המקדם הפעילות נועד למדוד, ממוקמים במעלה הזרם של מסגרת קריאה פתוחה, כמו גאס. לדוגמה, בנו של פלסמיד המכיל HVA1::GUS כדי למדוד את הביטוי בין2,יזם HVA1 5.
- לבנות לבנות בקרה פנימית (למשל UBI::לוציפראז).
- באמצעות עמודת איגוד סיליקה פרוטוקול (ראה טבלה של חומרים), להכין פלסמיד באיכות גבוהה עבור כל אחד בונה הגן חובה. בעזרת ספקטרוסקופיית אולטרה סגול (ראה טבלה של חומרים), בקפידה למדוד את ריכוז כל הכנה פלסמיד.
2. הכנה של גרגרי שעורה הפגזה
- להגדיר את גיליון אלקטרוני (לקבלת דוגמה, ראה איור 1 ) המציין את פלסמידים זה תהיה מופגז, הטיפולים המתאימים הורמון, ומידע רלוונטי נוסף עבור כל טיפול זה יהיה חלק מהניסוי.
- באמצעות קרש חיתוך, סכין גילוח סטרילי, לחתוך את העוברים בין גרגרי שעורה ההימליה (40 הטיפול כלולה הניסוי). הכללת גרגרים דהוי או קטנים יותר באופן משמעותי מהממוצע.
- מניחים שכל הגרגרים embryoless לתוך צינור 50 מ. להוסיף 40 מ של מים, סלע במשך 10 דקות.
- שופכים את המים בזהירות (כדי להימנע מאובדן גרגרים) ולהוסיף 40 מיליליטר 10% מלבין. רוק במשך 20 דקות.
- שופכים את המלבין ולהוסיף 40 מיליליטר מים סטריליים. רוק למשך 5 דקות. חזור על זה לשטוף במים סטריליים ארבע פעמים נוספות.
- להוסיף 40 מ"ל של שתיית פתרון (succinate נתרן 20 מ מ, 20 מ מ סידן כלורי, pH 5.0) וμl 40 של פתרון מניות כלורמפניקול (10 mg/mL).
- להעביר את רוב הפתרון שתיית (עם כלורמפניקול) באמצעות הרכבת התחתית לתוך צלחת ורמיקוליט (ראה טבלה של חומרים). ואז להעביר את הגרגרים על גבי המשטח של נייר הסינון הרטוב בצלחת ורמיקוליט. שמתפזר הגרגרים. יציקת בפתרון imbibing מספיק כדי לשמור על הגרגרים חלקית (אבל לא לגמרי) במים. מקם את המכסה על גבי הלוח ורמיקוליט.
- דגירה החיטים embryoless ב 24 מעלות צלזיוס במשך כ- 48 שעות עם תאורת פלורוסנט. להוסיף פתרון שתיית נוספים לפי הצורך.
- להיפתח 90 מ מ פלסטיק פטרי, שופכים 20 מ של פתרון שתיית לתוך המנה עצמה, 20 מ"ל לתוך המכסה הפוך. להוסיף כל אחד μL 20 כלוראמפניקול (10 mg/mL). לעקר את שני זוגות של הצבע בסדר מלקחיים בטבילת אותם באלכוהול.
- מניחים כמה מן החיטים embryoless המכסה של הפטרי. עם המלקחיים, להסיר בעדינות קליפת הזרע (שקוף) כל גרגיר. בעת הסרת קליפת הזרע מן הצד חלקה של התבואה, לא לפגוע בתאים (aleurone) המשמש כבסיס. להעביר את התבואה קלופים הפטרי הכוללת שתיית פתרון.
- לאחר קילוף קליפת הזרע מכל הגרגרים, להחזיר אותם לצלחת ורמיקוליט. תקופת דגירה החיטים embryoless קלופים ב 24 ° C של 16-20 שעות.
- רק לפני השימוש הגרגרים עבור הפגזה, להסיר לחות משטח ע י ניעור אותם בין מסנן המסמכים בצלחת פטרי.
3. הכנה של פלסמיד DNA עבור הפגזה
- תווית צינור 1.5 mL עבור כל טיפול זה ייכלל הניסוי הפגזה. כדי כל שפופרת להוסיף 2.5 µg של UBI::לוציפראז בקרה פנימית פלסמיד, µg 2.5 פלסמיד כתב גאס , את הסכום הרצוי (בדרך כלל 0.025 µg כדי 2.5 µg) של פלסמיד אפקטור. מוסיפים מים כדי להביא את הנפח הכולל 5 µL.
- להכין 1.6 מיקרומטר זהב microcarriers (ראה טבלה של חומרים) בעקבות פרסום הפרוטוקולים6.
- עבור כל טיפול, להוסיף 50 µL של microcarriers על תנאי לתוך הצינור 1.5 mL המכילה DNA פלסמיד. מעיל של microcarriers עם פלסמיד הדנ א על פי פרוטוקולים של היצרן6.
- בשלב הסופי, כאשר microcarriers מצופים פלסמיד מושעים 48 µL 100% אתנול, pipet 8 μL של microcarriers על תנאי על גבי כל אחד חמש macrocarriers ולאפשר להם לאוויר יבש.
4. חלקיקים הפגזה של גרגרי שעורה Embryoless
- להרכיב את המערכת הפגזה של חלקיקים (ראה טבלה של חומרים)6.
- להכניס דיסק קרע 1550 psi בתוך הכיפה שהגנו והר אותה על המכשיר.
- המקום של macrocarrier המכילה את השילוב הרצוי פלסמיד (יחד עם מסך עצירה) לתוך מכלול ההשקה microcarrier. הכנס את מכלול לתוך החריץ העליון של התא הפגזה. קבעו את המרחק בין הדיסק קרע שמירה, פקקי מכסה כיסוי macrocarrier ממרחק סטנדרטי (6 מ מ), ולמקם את תמיכת מסך עצירה במיקום האמצעי (רגיל), המאפשר מרחק הנסיעה macrocarrier של 11 מ"מ (איור 2 א).
- לסדר את גרגרי embryoless 8 בדפוס רדיאלי חזק (עם מסתיים רזה הצבעה פנימה) על עיגול נייר סינון מודבקת למטה שטוח המכסה של צלחת פטרי 90 מ מ (ראה איור 2B).
- מקם את המנה עם הגרגרים אל החדר הפגזה, במרחק של 6 ס מ מן המסך עצירה.
- לפנות את החדר הפגזה 95 kPa, ואז להפציץ את הדגימה.
- לאחר שחרור האבק, להעביר החיטים bombarded צלחת פטרי עם תוויות 60 מ מ המכיל 4 מ"ל של שתיית פתרון המכיל 1 מ ג/מ ל כלורמפניקול.
- חזור עד כל הפגזות הושלמו. דגירה (על פלטפורמה חזק 100 סל"ד) ב 24 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
5. החילוץ של חלבון מסיס מן החיטים Bombarded
- באמצעות מלקחיים, להסיר את החיטים bombarded 8 צלחת פטרי 60 מ מ, למחוק אותם יבש על מגבת נייר. לחלק את הגרגרים mL 2.0 שכותרתו שני צינורות (4 גרגרים למחזור) שכל אחד מהם מכיל 800 μL טחינת מאגר (100 מ מ נה פוספט pH 7.2, 5 מ מ DTT, 10 leupeptin µg/mL, גליצרול 20%) וחרוז נירוסטה 5 מ מ. חזור על תהליך זה עבור כל הדגנים מופגז.
- להכניס צינורות 2.0 mL (עד 48) בתוך המדפים שני של מהמגן חרוז (ראה טבלה של חומרים). הר המדפים על מהמגן.
- לנער את הדגימות ב 30 הרץ במשך 3 דקות.
- להסיר את המדפים מהמגן מהמגן ולמקם אותם על קרח (5 דקות) מחדש לצנן את הדגימות.
- הר המדפים על מהמגן - בכיוון ההפוך. לנער את הדגימות שוב ב 30 הרץ במשך 3 דקות.
- מגניב המדפים על קרח, ואז חזור על צעדים 5.3 ל 5.5. זה יוסיף סך של 12 דקות של טלטול.
- Centrifuge תמציות דגן ב g 16,000 x ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- מיד לאחר צנטריפוגה, decant את supernatants ברור לתוך קבוצה שנייה של microcentrifuge צינורות. לתת כל שפופרת מערבולת מהירה. לאחסן הצינורות על קרח.
- לאחר העברת את תגובת שיקוע, לשחזר את החרוזים פלדה כדורי אז הם יכולים להיות שטופים לעשות בה שימוש חוזר.
6. מדידת פעילות לוציפראז מן התבואה תמציות
- לכל שפופרת של תבואה תמצית כדי להיות לבדיקה, להכין 12 מ"מ x 75 מ"מ זכוכית מבחנה המכילה 200 μL תערובת Assay לוציפראז (45 מ מ טריס חומצה גופרתית pH 7.7, 15 מ מ MgCl2, 20 מ מ DTT, 1.5 mM EDTA, luciferin 1 מ מ, 1 מ מ ATP).
- להוסיף 100 μL של תמצית תבואה הראשון הצינור assay הראשון. מערבולת במהירות כדי לערבב היטב. מיד למקם את הצינור לתוך צינור האוחז luminometer וסגור את הדלת. עם סיום המדידה, הסר את הצינורית luminometer – השארת הדלת פתוחה עבור מיקום של הצינור הבא.
- חזור על תהליך זה עד כל הדגימות נמדדו.
7. מדידה של גאס פעילות של תמציות של דגנים
- להוסיף 200 μL גאס Assay מאגר (50 מ מ נה פוספט pH 7.2, 2.5 מ מ 4-methylumbelliferyl - D-glucuronide, 10 מ מ DTT, 2 מ מ EDTA, leupeptin µg/mL 10, 20% מתנול, אזיד הנתרן 0.02%) כל טוב של צלחת טוב 96.
- במקום 50 μL של כל גרגיר לחלץ לתוך המתאימה היטב. מערבבים עם הטיפ לאחר הוספה. חותם העליון עם איטום הסרט.
- תקופת דגירה את הצלחת היטב 96 ב 37 מעלות צלזיוס בחושך של 20 שעות.
- Centrifuge את הצלחת היטב 96 ב g 4,000 x ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ומניחים אותו על קרח.
- להוסיף 250 μL של 0.2 מ'-נה-2CO-3 כל טוב של צלחת טוב שחור 96.
- להוסיף 6.25 μL של כל תערובת assay גאס centrifuged המתאימה טוב (המכיל 0.2 מ' נה2CO3) של השחור 96 טוב צלחת. מערבבים עם הטיפ לאחר הוספה. לכלול וולס עם μL 6.25 μM 10, 40 μM ו 100 μM 4-methylumbelliferone כמו סטנדרטים.
- למקם את הלוח השחור fluorometer צלחת ולקרוא את זריחה של methylumbelliferone. קח את הקריאות-גל עירור של 360 ננומטר, אורך גל של פליטה של 460 ננומטר. להגדיר את הרווח של המכשיר כך על μL טוב המכיל 6.25 של 4 μM 40-methylumbelliferone 250 μL של 0.2 מ'-נה-2CO-3 מאפשר קריאה של 1000 יחידות קרינה פלואורסצנטית.
8. ניתוח נתונים
- הזן את הערכים עבור לוציפראז ו גאס מבחני לתוך גיליון אלקטרוני. אל תכלול התייחסות דוגמה עם קריאת לוציפראז נמוך יותר מאשר הפריה חוץ גופית יחסית 20,000 יחידות s-1, כי זה מצביע על כי המבנה ג'ין לא בהצלחה נשלחו אל תאי aleurone.
- עבור כל גרגיר בהצלחה bombarded לחלץ (ייצוג קבוצה של ארבעה גרגרים embryoless), לחשב את הביטוי גאס מנורמל מתוך הנתונים הגולמיים גאס ואני לוציפראז כדלקמן: מנורמל גאס = [(ביטוי גאס - גאס ריק) x (2,000,000)] / (לוציפראז ביטוי – לוציפראז ריק).
הערה: זה מווסת את כמות הפעילות גאס מה נצפו בהפגזות שנתן קריאה לוציפראז של 2,000,000. - דווח על הרמה היחסית של ביטוי של מבנה כתב מסוים בנוכחות אפקטור בונה או טיפולים בהורמון נבדק על ידי השוואת לרמה של הביטוי בהיעדרו של effectors או הורמונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ניתן להשתמש בטכניקה המתוארת כאן להציג לבנות גן בכל מבחן לתוך התאים aleurone של גרגרי שעורה. רמת הביטוי של הגן הבדיקה ואז הוא יהיה נוח נמדד (איור 2). פרוטוקול תפוקה גבוהה יותר המתוארים כאן מאוד מגדיל את היעילות של זרע שחיקה, אנזים assay צעדים. בשיטה זו נעשה שימוש כדי להעריך את היכולת של5,6 TaABF1 פקטור שעתוק כדי להפעיל את ביטוי הגן ABA-induced HVA17. בתוצאות נציג המובאת כאן, בניית כתב HVA1::GUS הוצג לתאים aleurone יחד עם UBI::TaABF1 אפקטור בונה (איור 3 א). בזמן של TaABF1/HVA1 יחס של 0.01 פשוט היה מספיק כדי לגרום את אינדוקציה 3-fold של הגן כתב HVA1 , בהעדר ABA אקסוגני, רמות גבוהות של הבונה TaABF1 , גרמו למחמיר יותר HVA1 ביטוי, באופן תלוי מינון (איור 3Bג).
פרוטוקול נסיוני זה יכול גם לשלב את השימוש הורמונים או חומרים אחרים במהלך תקופת הדגירה לאחר הפגזה כדי להעריך את התפקיד של המולקולות האלו בוויסות של ביטוי גנים. העבודות הקודמות על ידי חוקרים אחרים הראו את החשיבות של phospholipase D בהיבטים מסוימים של ABA איתות. באופן ספציפי, התוצר של פעילות phospholipase D, חומצה phosphatidic, היה מעורב כמו ביניים בכמה תגובות ABA8,9. העובדה כי 1-butanol, מעכב של phospholipase D (לחמש נשקים), הוכח כדי למנוע ביטוי גנים ABA-induced בתאים aleurone מציע כי לחמש נשקים עשוי להיות חלק אינטגרלי של ABA איתות בתוך הרקמה הזו. פרוטוקול הפגזה שימש כדי לבדוק אם 1-butanol יכול לעכב את הביטוי HVA1 ABA-induced או TaABF1-induced. כצפוי, גם אקסוגני ABA או TaABF1 שיכולים חריפה לזרז ביטוי של הבונה כתב HVA1::GUS (איור 3C). בכל מקרה, הנוכחות של 1-butanol עכבות בחריפות את תנאי הגיוס HVA1 . הדבר מצביע על כך. לחמש נשקים יכול לשחק תפקיד חשוב הפעלת גנים HVA1 על ידי ABA, דרך TaABF1.
בנוסף לתפקידה במסגרת פיתוח של הנבטת גרגרי, ABA חיוני גם לוויסות צמצם stomatal העלים. בתאים המשמר של הפיוניות, הייצור של חומצה phosphatidic הוא מגורה על ידי תחמוצת החנקן (NO), אשר בתורו הנגרמת על ידי מימן על-חמצני (H2O2). כמה תגובות, לא2O H2 להחליפה ABA9. כדי לקבוע אם זה גם במקרה של תאים aleurone, פרוטוקול הפגזה שימש כדי לבדוק אם לא תורם חמצן (הסנ פ) או2O H2 יכול להחליף עבור ABA עיכוב הביטוי של GA-induced Amy32b ג'ין. בעוד ABA חריפה יכולה לעכב את הביטוי GA-induced עבור הכתב Amy32b::GUS לבנות, לא2O H2 ולא הסנ פ גרם כל הפחתה משמעותית (דמות תלת-ממד). תוצאות אלה, לכן, אינם תומכים תפקיד לא ו- H2O2 תגובות תא ABA aleurone.
איור 1 : גיליון אלקטרוני עבור ניסוי טיפוסי הפגזה. הכמות של כל הכנה פלסמיד להציב הצינור עבור כל הפגזה מסומן. בניסוי זה, ארבע יריות (8 גרגירים כל) שימשו עבור כל טיפול לתת סכום כולל של שמונה דגימות אפשרי (4 גרגרים כל) עבור כל טיפול. על מנת לשמור על ריכוז ה-DNA הכולל זהה ב כל הפגזה, פלסמיד אפקטור "דמה" שימש תחליף פלסמיד אפקטור UBI::TaBF1 במקרים מסוימים. הטיפול הוא בהפגזות "ריק" להקים רקע רמת הפעילות גאס ואני לוציפראז בתאים aleurone. התוצאות של הניסוי הפגזה שתואר בגיליון זה מוצגים באיור 3B. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : תרשים של הפרוטוקול. תיאור סכמטי של המכשיר הפגזה (א) . (B) חלקיקי זהב מצופה עם מבנה הכתב נושאת את המקדם להיבדק אפקטור (במידת הצורך), של בקרה פנימית (UBI::luciferase) הם הציגו לתוך התאים aleurone שעורה על ידי הפגזה של חלקיקים. לאחר דגירה (בדרך כלל עבור 24 שעות), הגרגרים הם הקרקע, לבדיקה עבור פעילות גאס והן לוציפראז פעילות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : רגולציה של היזמים HVA1 ו- Amy32b על ידי TaABF1, ABA, מתווכים פוטנציאלי של ABA איתות. (א) כתב, אפקטור המבנים המשמשים את הניסויים. (B) הבונה אפקטור UBI::TaABF1 היה שותף מופגז לתוך תאים aleurone עם הכתב HVA1::GUS , הבונה בקרה פנימית (UBI::luciferase). כמות UBI::TaABF1 אפקטור (ביחס הכתב HVA1::GUS ) מגוונות בין 0 ל 0.1, כמצוין להלן הסורגים. גאס ופעילויות לוציפראז נמדדו לאחר 24 שעות של דגירה. הנתונים המוצגים הם האמצעי (± SE) משכפל הביולוגי של 6-8. (ג) הכתב HVA1::GUS היה מופגז משותפת לתוך תאים aleurone עם הבונה בקרה פנימית (UBI::luciferase), נוכחות או היעדרות של הבונה אפקטור UBI::TaABF1. כמות TaABF1 אפקטור (ביחס הכתב) היה 1.0. גאס ופעילויות לוציפראז נמדדו לאחר 24 שעות של דגירה עם או בלי ABA מיקרומטר 20 ו- 0.4% 1-butanol. (ד) לכתב Amy32b::GUS היה שותף bombarded לתוך תאים aleurone עם הבונה בקרה פנימית (UBI::luciferase). גאס ופעילויות לוציפראז נמדדו לאחר 24 שעות של דגירה בנוכחות 1 מ"מ GA עם או בלי 20 מיקרומטר ABA, 1 מ מ H2O2או 100 מיקרומטר חמצן (הסנ פ). הערכים עבור פעילות גאס הם יחסיים הביטוי של הכתב Amy32b::GUS , בהעדר ' ורג ' יה אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המבוא של ג'ין אפקטור בונה באמצעות חלקיקים הפגזה, ואחריו הביטוי ארעית של הכתב בונה היא אסטרטגיה ערך ניקוד את התפקיד של שחקנים מסוים ב- GA/ABA איתות וב -הגן מוסדר הורמון וכתוצאה מכך ביטוי.
עם זאת, קיימים פרוטוקולים עבור ביצוע ניסויים אלה שעורה aleurone תאים2,3,4,5,6 הם עבודה מאוד אינטנסיבית. כל קבוצת מופגז בקושי גרגרים להיות יד הומוגני ב ומכתש, ועל תמציות וכתוצאה מכך הם לבדיקה באופן אינדיבידואלי לפעילות גאס ואני לוציפראז. הפרוטוקולים הנוכחי לכן להגביל את מספר טיפולים נפרדים וניתן לכלול אותם אותו ניסוי, ולא להגביל את מספר משכפל ביולוגי זה סביר ניתן לכלול עבור כל טיפול. הגבלות אלה מקשות לבצע השוואות סימולטני ומקיף בין טיפולים מרובים. השוואות יכולות להיות קשה במיוחד אם ההבדל בביטוי הגנים בין הטיפולים הוא צנוע, מספר גדול יחסית של משכפל ביולוגי יש צורך להקים מובהקות סטטיסטית.
פרוטוקול מפושטת מוצג כאן הממכן חלקית הכנת תמצית תבואה, גאס מבחני כדי לאפשר תפוקה גבוהה יותר באופן משמעותי. זו הגירסה החדשה של גורם פרוטוקול זה ריאלי לכלול מספר גדול יותר של הכולל דוגמאות של ניסוי, המאפשר לשני הכללת טיפולים שונים לכל ניסוי, ועוד מעתיק עבור כל טיפול. עבור הכנת תמציות תבואה לאחר הפגזה של אינקובציה, לנו יש להחליף פרוטוקול שחיקה אוטומטי במידה רבה אשר מנצל מהמגן חרוז שבאפשרותה לעבד דגימות 48 בו זמנית (בעוד 20 דקות בערך). לפיכך, חוקר יחיד ניתן להכין חלבונים מסיסים תמציות כמעט 200 דוגמאות בפחות זמן זה ייקח קבוצה של ארבעה חוקרים יד טוחנים רק 100 דגימות. וזמינותו גאס ששונה, מבוצע תוך 96 צלחות היטב, דורש גם הרבה פחות עבודה כי מבחני הפרוטוקול המקורי המועסקים צינור בודדים.
בהכנת תערובות של פלסמיד עבור הפגזה (שלב 3.1), זה אפשרי לשימוש של אפקטור כתב יחס של 1.0, במיוחד עבור בדיקות מקדימות לקבוע אם אפקטור מסוימת השפעה כלשהי בכלל. עם זאת, בגלל הכוח של האמרגן אוביקוויטין תירס (UBI), השפעה חזקה ניתן לעיתים לצפות עם יחס נמוך בהרבה, כפי שניתן לראות באיור 2B , דוחות שפורסמו בעבר4,5,6. צעדים קריטיים אחרים ב פרוטוקול זה לכלול פילינג של קליפת הזרע מן החיטים שעורה ושימוש של הגדרות מוגדרות היטב המנגנון הפגזה. אם המעילים זרע לא יוסרו באופן מלא, microcarriers זהב תימנע מלהיכנס התאים aleurone subtending. שילוח מוצלח של microcarriers זהב לתוך התאים aleurone הוא גם די תלוי בסוג הספציפי של התקליטור קרע בשימוש, את המיקום של מכסה כיסוי microcarrier, עצירה מסך, רקמות כדי להיות מופגז. התנאים לדווח כאן בדרך כלל כתוצאה מסירה מוצלחת של המבנה ג'ין (ראה צעד 8.1) אחוז גבוה (≥70%) דוגמאות חיטה שעורה מופגז. זה צריך להיות צפוי כי חומרים ביולוגיים אחרים ידרוש תנאים שונים המסירה הגן אופטימלית.
למרות שזה לא מתואר כאן, זה יהיה אפשרי לייעל עוד יותר את ההליך על-ידי ביצוע את מבחני לוציפראז פלאש ב 96 צלחות היטב. עם זאת, כמו הפקה אור לוציפראז עליך למדוד את luminometer מיד לאחר ערבוב את החלבון תמצית עם המצע (luciferin), זה דורש את השימוש צלחת פלאש luminometer עם מרססים, מכשיר זה הרבה יותר יקר יותר luminometer צינור יחיד.
התוצאות נציג המובאות כאן לאשר הפקטור שעתוק TaABF1 יכול להפעיל HVA1 ביטוי בהיעדרו של ABA אקסוגני5,6. הפעלה של HVA1 באמצעות TaABF1 או ABA אקסוגני סוכל על ידי. לחמש נשקים מעכב 1-butanol, רומז כי הייצור של חומצה phosphatidic על ידי לחמש נשקים ייתכן שתידרש עבור הפעלת HVA1 . אלה תוצאות תקנה HVA1 על ידי TaABF1 ו ABA דומים לאלה מתקבל על ידי Zou. et al. 10 שנים ההפעלה של HVA22 את גורם שעתוק LtWRKY21 ועל ידי ABA. שרק2O H2 או הסנ פ לא תחליף ABA אקסוגני של דיכוי הביטוי aleurone של Amy32b, מאשר כי היבטים מסוימים של ABA איתות ב גרגרי הדגנים נבדלים מה מתרחש בתאי המשמר stomatal... הממצא כי H2O2 עושה ולא downregulate Amy32b הביטוי עולה בקנה אחד עם התוצאות שנמדדו על ידי ישיבאסהי. et al. 11 עבור פעילות אנזים עמילאז.
פרוטוקול תפוקה מוגברת נמצא בשימוש כעת לבצע מחקר מקיף של השפעת זרחון TaABF1 על יכולתה לווסת ביטוי גנים במורד הזרם. כמו שאר חברי ABF המשפחה של גורמי שעתוק יכולים להיות phosphorylated במספר רב של אתרים שונים12,13,14,15,16, זרחון בשם מרובים אתרים על TaABF1 צריך להיבדק. התפוקה גבוהה מורשה על-ידי פרוטוקול זה יאפשר מספר רב של גירסאות מוטציה של TaABF1 (עם פוטנציאל phosphorylatable סרין, תראונין ומשקעים שונה) כדי להיחקר, כל אחד עם מספר גדול של ביולוגית משכפל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים תודה גריסון באטלר ולברט מרגרט לעזרה בביצוע ניסויים, ג'ודי אבן לקבלת ייעוץ על תבואה המגון, לין Hannum לקבלת ייעוץ על fluorometry. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע (קורע 0443676), על ידי המוסדיים פיתוח פרס (מושג) מ הלאומית המכון כללי רפואי למדעים של מכוני הבריאות הלאומיים תחת גרנט מספר P20GM0103423, ועל ידי מענקים החלוקה מכללת קולבי של מדעי הטבע.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GeneElute HP plasmid Maxiprep kit | Sigma | NA0310-1KT | |
| UV-vis spectrophotometer | Nanodrop | ND-1000 | |
| Himalaya barley grains | / | / | A variety of hulless barley (store in the dark at 4° C) |
| sodium succinate | Sigma | S2378 | Reagent for Imbibing Solution |
| calcium chloride (dihydrate) | Fisher | C79-500 | Reagent for Imbibing Solution |
| Imbibing Solution | home made | / | 20 mM sodium succinate, 20 mM calcium chloride, pH 5.0. Sterilize by autoclaving before use. |
| chloramphenicol | Sigma | C0378 | Prepare a 10 mg/mL stock solution in 70% ethanol. |
| vermiculite | Fisher | NC0430369 | Used for vermiculite plates. |
| filter paper circles (90 mm) | Whatman | 1001 090 | Used for vermiculite and for pre-bombardment grain preparation |
| Vermiculite Plates | home made | / | Add 50 mL of vermiculite to a glass petri dish. Place a 90 mm paper circle on top of the vermiculite. Autoclave. |
| forceps (fine pointed) | Fisher | 13-812-42 | Used for removing seed coat from barley grains. |
| forceps (ultra fine point) | Fisher | 12-000-122 | Used for removing seed coat from barley grains. |
| gold microcarriers (1.6 μm) | BioRad | 1652264 | |
| macrocarriers | BioRad | 1652335 | |
| calcium chloride (dihydrate) | Fisher | C79-500 | Prepare a 2.5 M stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| spermidine | Sigma | S0266 | Prepare a 100 mM stock solution and store 500 μL aliquots at -20° C (use within 2 months). |
| rupture discs (1550 psi) | BioRad | 1652331 | |
| stopping screens | BioRad | 1652336 | |
| macrocarrier holders | BioRad | 1652322 | |
| Biolistic particle delivery system | BioRad | PDS-1000/He | |
| sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2 |
| sodium phosphate dibasic | Sigma | S9763 | Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2 |
| 1M sodium phosphate pH 7.2 | home made | / | Combine 6.9 g of sodium phosphate monobasic monohydrate with 7.1 g of sodium phosphate dibasic. Add water to 100 mL. Add NaOH to get pH 7.2. |
| dithiothrietol (DTT) | Sigma | 43819 | Dissolve in water to 1 M. Store at -20° in 1 mL aliquots. |
| leupeptin | Sigma | L2884 | Dissolve in water to 10 mg/mL. Store at -20° C. |
| glycerol | Sigma | G5516 | Prepare a 50% solution in water. |
| Grinding Buffer | home made | / | Combine 10 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 500 μL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/mL leupeptin, and 40 mL of 50% glycerol. Add water to 100 mL. |
| stainlesss steel beads (5 mm) | Qiagen | 69989 | |
| 2.0 mL tubes | Eppendorf | 22363352 | This specific model of tube is recommended for use with the homogenizer. |
| bead homogenizer (TissueLyser) | Qiagen | 85210 | |
| 12mm x 75 mm glass test tubes | Fisher | ||
| luciferin | Goldbio | LUCK-100 | Prepare a 25 mM stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| ATP | Sigma | A7699 | Prepare a 100 mM stock solution and store 250 μL aliquots at -20° C. |
| Tris base | Sigma | T1503 | Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7. |
| sulfuric acid | Sigma | 258105 | Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7. |
| 1M Tris sulfate pH 7.7 | home made | / | Dissolve 12.1 g Tris base in 100 mL of water. Adjust pH to 7.7 with sulfuric acid. |
| magnesium chloride | Sigma | M9397 | Dissolve in water to 2 M. |
| Luciferase Assay Buffer (LAB) | home made | / | Combine 3 mL of 1 M Tris sulfate pH 7.7, 500 μL of 2 M magnesium chloride, 1 mL of 1 M DTT, and 200 μL of 0.5 M EDTA. Add water to 50 mL. |
| Luciferase Assay Mixture | home made | / | Combine 15 mL of LAB, 800 μL of 25 mM luciferin, 200 μL of 100 mM ATP, and 4 mL of water. This makes enough assay mixture (20 mL) for 100 luciferase assays. |
| luminometer (Sirius) | Berthold | / | |
| 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG) | Goldbio | MUG1 | Dissolve in DMSO to 100 mM. |
| sodium azide | Sigma | S8032 | Prepare a 2% stock solution in water and store 1 mL aliquots at -20° C. |
| 96 well plates (standard) | Fisher | 12565501 | |
| GUS assay buffer | home made | / | Combine 2.5 mL of MUG, 5 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 400 μL of 0.5 M EDTA, 1 mL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/ml leupeptin, 20 mL of methanol, and 1 mL of 2% sodium azide. Add water to 100 mL. |
| TempPlate sealing film | USA Scientific | 2921-1000 | |
| 96 well plates (black) | Costar | 3916 | |
| sodium carbonate | Sigma | S7795 | Prepare a 200 mM solution in water. |
| 4-methylumbelliferone | Sigma | M1381 | Prepare a 100 μM solution in water. Freeze 1 mL aliquots at -20° C. |
| microplate fluouresence reader | Bio-Tek | FLX-800 |
References
- Chen, K., An, Y. Q. C. Transcriptional responses to gibberellin and abscisic acid in barley aleurone. J. Integ. Plant Biol. 48, 591-612 (2006).
- Lanahan, M. B., Ho, T. H. D., Rogers, S. W., Rogers, J. C. A gibberellin response complex in cereal alpha-amylase gene promoters. Plant Cell. 4, 203-211 (1992).
- Shen, Q., Zhang, P., Ho, T. H. D. Modular nature of abscisic acid (ABA) response complexes; composite promoter units that are necessary and sufficient for ABA induction of gene expression. Plant Cell. 8, 1107-1119 (1996).
- Gómez-Cadenas, A., Zentella, R., Walker-Simmons, M. K., Ho, T. H. D. Gibberellin/abscisic acid antagonism in barley aleurone cells: site of action of the protein kinase PKABA1 in relation to gibberellin signaling molecules. Plant Cell. 13, 667-679 (2001).
- Johnson, R. R., Shin, M., Shen, J. Q. The wheat PKABA1-interacting factor TaABF1 mediates both abscisic acid-suppressed and abscisic acid-induced gene expression in bombarded aleurone cells. Plant Mol. Biol. 68, 93-103 (2008).
- Harris, L. J., Martinez, S. A., Keyser, B. R., Dyer, W. E., Johnson, R. R. Functional analysis of TaABF1 during abscisic acid and gibberellin signaling in aleurone cells of cereal grains. Seed Science Res. 23, 89-98 (2013).
- Shen, Q., Casaretto, J., Zhang, P., Ho, T. H. D. Functional definition of ABA-response complexes: the promoter units necessary and sufficient for ABA induction of gene expression in barley (Hordeum vulgare). Plant Mol. Biol. 54, 111-124 (2004).
- Ritchie, S., Gilroy, S. Abscisic acid signal transduction in the barley aleurone is mediated by phospholipase D activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 2697-2702 (1998).
- Takemiya, A., Shimazaki, K. Phosphatidic acid inhibits blue light-induced stomatal opening via inhibition of protein phosphatase 1. Plant Physiol. 153, 1555-1562 (2010).
- Zou, X., Seeman, J. R., Neuman, D., Shen, Q. J. A WRKY gene from creosote bush encodes an activator of the abscisic acid signaling pathway. J. Biol. Chem. 279, 55770-55779 (2004).
- Ishibashi, Y., et al. Reactive oxygen species are involved in gibberellin/abscisic acid signaling in barley aleurone cells. Plant Physiol. 158, 1705-1714 (2012).
- Piskurewicz, U., et al. The gibberellic acid signaling repressor RGL2 inhibits Arabidopsis seed germination by stimulating abscisic acid synthesis and ABI5 activity. Plant Cell. 20, 2729-2745 (2008).
- Hong, J. Y., et al. Phosphorylation-mediated regulation of a rice ABA responsive element binding factor. Phytochemistry. 72, 27-36 (2011).
- Lopez-Molina, L., Mongrand, S., McLachlin, D. T., Chait, B. T., Chua, N. H. ABI5 acts downstream of ABI3 to execute an ABA-dependent growth arrest during germination. Plant J. 32, 317-328 (2002).
- Zhou, X., et al. SOS2-LIKE PROTEIN KINASE5, an SNF1-RELATED PROTEIN KINASE3-Type protein kinase, is important for abscisic acid responses in Arabidopsis through phosphorylation of ABSCISIC ACID-INSESENSITIVE5. Plant Physiol. 168, 659-676 (2015).
- Zong, W., et al. Feedback regulation of ABA signaling and biosynthesis by a bZIP transcription factor targets drought-resistance-related genes. Plant Physiol. 171, 2810-2825 (2016).
