Espressione genica in strati di Aleurone orzo bombardati con aumento della velocità di misura

Sommario

Un protocollo migliore è presentato per la misura dell'espressione genica transitoria da costruzioni del reporter in cellule di aleurone di orzo dopo il bombardamento di particelle. La combinazione di grano automatizzato rettifica con analisi dell'enzima piastra a 96 pozzetti fornisce throughput elevato per la procedura.

Abstract

Lo strato aleuronico di chicchi d'orzo è un importante sistema modello per l'espressione di gene ormone-regolato nelle piante. In cellule di aleurone, geni richiesti per la germinazione o lo sviluppo iniziale del semenzale attivati da gibberelline (GA), mentre i geni associati con le risposte di sforzo sono attivati da acido abscissico (ABA). I meccanismi di segnalazione GA e ABA possono essere interrogati dall'introduzione di costruzioni di gene del reporter in cellule di aleurone via bombardamento di particelle, con l'espressione transitoria risultante misurata mediante analisi dell'enzima. Un protocollo migliorato è segnalato che parzialmente automatizza e semplifica il passaggio di omogeneizzazione di grano e l'analisi dell'enzima, che consente una velocità effettiva significativamente maggiore rispetto ai metodi esistenti. Omogeneizzazione dei campioni grano viene effettuata utilizzando un omogeneizzatore automatizzato del tessuto, e GUS (β-glucuronidasi) le analisi sono effettuate utilizzando un sistema di piastra a 96 pozzetti. Risultati rappresentativi utilizzando il protocollo suggeriscono che l'attività della fosfolipasi D può svolgere un ruolo importante nell'attivazione dell'espressione genica di HVA1 di ABA, attraverso il fattore di trascrizione TaABF1.

Introduzione

Lo strato aleuronico orzo è un sistema consolidato modello per lo studio dell'espressione di gene ormone-regolato in piante¹. In particolare, un numero di geni richiesti per la germinazione o lo sviluppo iniziale del semenzale è attivato da gibberelline (GA), mentre i geni associati con le risposte di sforzo sono attivati da acido abscissico (ABA). La GA e ABA vie di segnalazione sono intrecciate, come l'espressione di alcuni geni attivati dal GA è inibita da ABA e viceversa¹.

Una strategia importante per comprendere che il ruolo degli attori particolari nella segnalazione di GA/ABA è stata l'....

Protocollo

1. preparazione del Effector e Gene Reporter costruisce

1. Costruire costrutti effettrici che impiegano un promotore costitutivo (es. mais ubiquitina, UBI) all'espressione di unità da un telaio di lettura aperto desiderato. Ad esempio, costruire un plasmide contenente UBI::TaABF1 di forte espressione costitutiva unità di TaABF1⁵.
2. Costruire costruzioni del reporter che includono il promotore cui attività deve essere misurato, posto a Monte di un open reading frame, come GUS. Ad esempio, costruire un plasmide contenente HVA1::GUS per misurare l'espressione dal promotore HVA1

Risultati

La tecnica qui descritta può essere utilizzata per introdurre qualsiasi costruzione di prova gene nelle cellule di aleurone di chicchi d'orzo. Il livello di espressione dal gene test quindi può essere convenientemente misurato (Figura 2). Il protocollo di throughput superiore descritto qui notevolmente aumenta l'efficienza del seme macinazione e la procedura di analisi enzima. Questo metodo è stato utilizzato per valutare la capacità del fattore di trascrizio.......

Discussione

L'introduzione del gene dell'effettore costrutti tramite bombardamento di particelle, seguita dall'espressione transitoria di costruzioni del reporter è una strategia importante per il ruolo degli attori particolari nella segnalazione di GA/ABA e nel gene ormone-regolata risultante di dissezione espressione.
Tuttavia, i protocolli esistenti per lo svolgimento di tali esperimenti in orzo aleuronico cellule^2,3,4,

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Kit Maxiprep per plasmidi GeneElute HP	Spettrofotometro UV-vis Sigma	NA0310-1KT
	Nanodrop	ND-1000
Chicchi d'orzo dell'Himalaya	/	/	Una varietà di orzo senza buccia (conservare al buio a 4 gradi; C)
succinato di sodio	Sigma	S2378	Reagente per l'imbibzione della soluzione
cloruro di calcio (diidrato)	Fisher	C79-500	Reagente per l'imbibzione della soluzione
dell'imbibzione Soluzione	fatta in casa	/	20 mM succinato di sodio, 20 mM di cloruro di calcio, pH 5.0. Sterilizzare in autoclave prima dell'uso.
cloramfenicolo	Sigma	C0378	Preparare una soluzione madre da 10 mg/mL in etanolo al 70%.
vermiculite	Fisher	NC0430369	Utilizzato per lastre di vermiculite.
di carta da filtro (90 mm)	Whatman	1001 090	Utilizzato per la vermiculite e per la preparazione dei cereali pre-bombardamento
Piastre di vermiculite	fatte in casa	/	Aggiungere 50 ml di vermiculite a una capsula di Petri di vetro. Posizionare un cerchio di carta di 90 mm sopra la vermiculite. Autoclave.
pinze (a punta fine)	Fisher	13-812-42	Utilizzato per rimuovere il rivestimento dei semi dai chicchi d'orzo.
pinza (punta ultra fine)	Fisher	12-000-122	Utilizzato per rimuovere il rivestimento dei semi dai chicchi d'orzo.
microcarrier d'oro (1,6 μ m)	BioRad	1652264
macrocarrier	BioRad	1652335
cloruro di calcio (diidrato)	Fisher	C79-500	Preparare una soluzione madre da 2,5 M e conservare 1 mL di aliquote a -20° C.
spermidina	Sigma	S0266	Preparare una soluzione madre da 100 mM e conservarne 500 μ Aliquote L a -20 gradi C (utilizzare entro 2 mesi).
di rottura (1550 psi)	1652331 BioRad	1652336
supporti per macrocarrier	BioRad
di rilascio di particelle biolistico	BioRad	PDS-1000/He
fosfato di sodio monobasico monoidrato	Sigma	S9638	Reagente per 1M fosfato di sodio pH 7,2
fosfato di sodio bibasico	Sigma	S9763	Reagente per 1M fosfato di sodio pH 7,2
1M fosfato di sodio pH 7,2	fatto in casa	/	Combinare 6,9 g di fosfato di sodio monobasico monoidrato con 7,1 g di fosfato di sodio bibasico. Aggiungere acqua a 100 ml. Aggiungi NaOH per ottenere un pH 7,2.
ditiotrietolo (DTT)	Sigma	43819	Sciogliere in acqua a 1 M. Conservare a -20 gradi in aliquote da 1 mL.
leupeptin	Sigma	L2884	Sciogliere in acqua a 10 mg/mL. Negozio a -20 gradi
C.glicerolo	Sigma	G5516	Preparare una soluzione al 50% in acqua.
Macinazione Tampone	fatto in casa	/	Combina 10 mL di 1 M di fosfato di sodio pH 7,2, 500 μ L di 1 m DTT, 100 μ L di 10 mg/mL di leupeptina e 40 mL di glicerolo al 50%. Aggiungere acqua a 100 ml.
perline in acciaio inossidabile (5 mm)	Qiagen	69989
provette da 2,0 mL	Eppendorf	22363352	Questo specifico modello di provetta è consigliato per l'uso con l'omogeneizzatore.
omogeneizzatore a sfere (TissueLyser)	Qiagen	85210
Provette in vetro da 12 mm x 75 mm	Fisher
luciferina	Goldbio	LUCK-100	Preparare una soluzione madre da 25 mM e conservare aliquote da 1 mL a -20 °C.
ATP	Sigma	A7699	Preparare una soluzione stock da 100 mM e conservare 250 μ Aliquote L a -20 gradi  C.
Tris base	Sigma	T1503	Reagente per 1M Tris solfato pH 7,7.
solforico	Sigma	258105	Reagente per 1M Tris solfato pH 7,7.
1M Tris solfato pH 7,7	fatto in casa	/	Sciogliere 12,1 g di base Tris in 100 ml di acqua. Regolare il pH a 7,7 con acido solforico.
cloruro di magnesio	Sigma	M9397	Sciogliere in acqua fino a 2 M.
Tampone per il saggio della luciferasi (LAB)	fatto in casa	/	Combina 3 ml di 1 M Tris solfato pH 7,7, 500 μ L di cloruro di magnesio 2 M, 1 mL di DTT 1 M e 200 μ L di 0,5 m EDTA. Aggiungere acqua a 50  Ml.
Miscela di saggi luciferasi	fatta in casa	/	Combina 15 ml di LAB, 800 μ L di 25 mM luciferina, 200 μ L di 100 mM di ATP e 4 mL di acqua. Questo rende sufficiente la miscela di analisi (20  mL) per 100 saggi di luciferasi.
luminometro (Sirius)	Berthold	/
4-metilumbelliferil-β-D-glucuronide (MUG)	Goldbio	MUG1	Sciogliere in DMSO a 100 mM.
sodio azide	Sigma	S8032	Preparare una soluzione madre al 2% in acqua e conservare 1 mL di aliquote a -20°C.
Piastre da 96 pozzetti (standard)	Tampone per saggio GUS Fisher	12565501
	fatto in casa	/	Combina 2,5 mL di MUG, 5 mL di fosfato di sodio 1 M pH 7,2, 400 μ L di 0,5 M EDTA, 1 mL di 1 M DTT, 100 μ L di 10 mg/ml di leupeptina, 20 mL di metanolo e 1 mL di azoturo di sodio al 2%. Aggiungere acqua a 100 ml.
TempPlate film sigillante	USA Scientific	2921-1000
piastre a 96 pozzetti (nero)	Costar	3916
carbonato di sodio	Sigma	S7795	Preparare una soluzione da 200 mM in acqua.
4-metilumbelliferone	Sigma	M1381	Preparare un 100 μ M in acqua. Congelare 1 mL di aliquote a -20 gradi  C.
lettore di fluouresence per micropiastre	Bio-Tek	FLX-800

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