Summary
التعرض للسموم البيئية يمكن أن تؤثر بشدة التنمية مع تأثيرات طويلة الأجل. يتم توفير بروتوكولات مفصلة لتوضيح استراتيجية استخدام نموذج مختبر فعالة لدراسة تأثير التعرض الجنينية المبكرة إلى bisphenol ألف نحن نقدم الخصوبة وفحوصات السلوكية لرصد فعالية لدينا بيو-فحوصات التعرض للسمية.
Abstract
بيسفينولس، مثل bisphenol A (BPA) و bisphenol S (BPS) هي مبلمرة وكلاء المستخدمة على نطاق واسع في إنتاج البلاستيك، والعديد من المنتجات اليومية الاستخدام. استناداً إلى التركيب الكيميائي والخصائص البيولوجية مثل استراديول، قد صنفت الصماء المركبات (EDC). التعرض الطويل الأمد ليشكل، حتى في الجرعات المنخفضة، ارتبط بالعيوب الصحية المختلفة بما في ذلك السرطان، والاضطرابات السلوكية والعقم، مع مزيد من الضعف المشار إليه أثناء فترات النمو المبكر. أظهرت الدراسات الخلوية والجزيئية النموذجي السلكية وراثيا أصعب ايليجانس كاينورهابديتيس أن يسبب التعرض إلى منهاج عمل بيجين المبرمج، والفتك الجنينية واضطراب في الحمض النووي إصلاح الآليات. أننا قد سبق أن أبلغت أن التعرض للأجنة C. ايليجانس الجرعات المنخفضة من بيسفينولس مختلفة انخفاض الخصوبة. وباﻹضافة إلى ذلك، وقد أظهرنا أن آثار التعرض خلال المراحل المبكرة جداً من التنمية ما زالت قائمة في مرحلة البلوغ كما جزيئي بالتحديد الكمي لسلوك التعود، نموذج للتعلم غير النقابي. هنا، نحن نقدم بروتوكولات مفصلة جنينية من التعرض لجرعة منخفضة يشكل فضلا عن خصوبة المرتبطة بها والامامي لمس فحوصات التعود، جنبا إلى جنب مع نتائج تمثيلية.
Introduction
ويضاعف التعرض للسموم البيئية، لا سيما تلك التي تميل إلى التدخل في التنمية، وقد تم قيد التمحيص العلمي الدقيق في السنوات الأخيرة. تصنف المواد الكيميائية أكثر من ألف في الاستخدام اليومي الصماء المركبات (EDC)1. وقد لوحظت فترات من النمو السريع والتنمية، التي تشمل الأجنة والرضع ومراحل الطفولة، وأن تكون عرضه للآثار الضارة لتنمية الصادرات حتى الجرعات المنخفضة. قد ثبت تأثيرها التسبب في الاضطرابات النمائية والإنجابية2. كل المبادئ التوجيهية للفريق وكالة حماية البيئة الأمريكية وبرنامج علم السموم الوطني الأمريكي، يمكن تعريف جرعة منخفضة كأي جرعة أدناه مستوى واحد تم الإبلاغ عنها يؤدي تغيير بيولوجية يمكن ملاحظتها أو أضرار3. بالإضافة إلى آثار الجرعات المنخفضة ليشكل الفردية، قد مخاليط مختلفة يشكل وجدت تركيزات منخفضة في البيئة يمكن أن تسبب الآثار التراكمية الموضوعية4.
Bisphenol A (BPA أو 4,4'-(propane-2,2-diyl)) عامل مبلمرة وجدت في الأصناف الشائعة الاستخدام مثل زجاجات المياه وإيصالات تخزين ولاصق الأسنان والبطانات للمشروبات وعلب الأغذية5. سبب تشابهها الهيكلية إلى 17 بيتا استراديول (ه2) وعن تقارب مستقبلات الإستروجين ERα و ERβ، تم تصنيف الصماء5،(EDC) الكيميائية6منهاج عمل بيجين. على الرغم من ضعف، ثبت النسب لمنهاج عمل بيجين إلى مستقبلات الإستروجين تؤثر على نظام الاستنساخ من كلا الجنسين، وتعطيل الوظائف العصبية عند الجرعات التي تعتبر آمنة7،8. قد لوحظت تغيرات في الحمض النووي مثلايشن عبر آليات التنظيم ابيجينيتيكالي يسبب تشوهات الخلايا العصبية الطويلة الأجل في الفئران المعرضة إلى منهاج عمل بيجين9. على وجه التحديد، كما قد تورط BPA كالمذنب ممكنة لزيادة معدلات فرط النشاط ونقص الانتباه وزيادة الحساسية للمخدرات نظراً لزيادة النظر في مستقبلات الدوبامين D1 في forebrain الحوفي الماوس بعد التعرض المزمن 9 , 10-أدلة هامة على الآثار الضارة ليشكل في صحة الإنسان يستند إلى دراسات الترابط مع التركيز أساسا على التعرض المزمن للسكان إلى سميات البيئية حتى في الجرعات المنخفضة5؛ ومع ذلك، قد قبلت قيود في الوصول إلى الاستنتاجات من الدراسات الإنسانية وفي التعامل مع عناصر تحكم تجريبية أثناء التصدي للانتقادات الموجهة للضجيج لا سند لها11،12.
الواجب للحفاظ على الجينات كاينورهابديتيس ايليجانس بالنسبة للثدييات، بما في ذلك الجينات مستقبلات هرمون الستيرويد، والباحثين قد استخدمت هذا نموذج lab أصعب وراثيا لكشف الآثار الفنية والميكانيكية ليشكل 13-وأظهرت التجارب مع C. ايليجانس أن هذه المركبات مثل منهاج عمل بيجين، وبت في الثانية يمكن أن يسبب المبرمج، فتك جنينية، واضطراب في الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل كسر إصلاح آليات والوظيفة العصبية14،15 ،16.
وقد أظهرت لدينا مختبر سابقا أن التعرض لجرعة منخفضة حتى يقتصر على امبريوجينيسيس المبكر يؤدي إلى انخفاض الخصوبة مع العجز السلوكية في البالغين15الباقين على قيد الحياة. التعود على حافز متكررة نموذج للتعلم غير النقابي في نظم نموذجية، بما في ذلك C. ايليجانس، ولدينا منهجية يستخدم هذا النموذج من التعلم غير النقابي كإخراج سلوكية للآثار الطويلة الأجل للجنين من التعرض للاعتداء سميات17 على وجه التحديد، نحن نقدم بروتوكولات مفصلة لدراسة التعرض BPA في C. ايليجانس، بما في ذلك آثارها المباشرة على الفتك الجنينية وآثار طويلة الأجل على سلوك الكبار، مع تخطيطي العام صورت في الشكل 1. وترد نتائج تمثيلية من الخصوبة وفحوصات التعلم غير النقابي تسليط الضوء على فعالية أعمالنا المنهجية.
Protocol
بروتوكولات الواردة أدناه قد تم توحيد لاختبار تأثيرات التعرض BPA أثناء embryogenesis المبكر، ويمكن تعديلها للاستخدام مع BPS BPF أو الأخرى يشكل وسميات على الأجنة C. ايليجانس .
1-مواد الإعداد
- إعداد 500 مل من وسائط النمو ديدان أسطوانية (NGM)18 وسائط الإعلام بإذابة 1.5 غم من كلوريد الصوديوم وز 1.25 من ببتون ز 8.5 لاجار في المياه إلى 500 مل. بعد التعقيم (121 درجة مئوية، وهذه المبادرة 15، 20 دقيقة)، إضافة 0.5 مل من نسبة الكولسترول في الدم (5 ملغ/مل في الإيثانول)، 0.5 مل من 1 م MgSO4، 0.5 مل من م 1 كاكل2 و 12.5 مل من م 1 البوتاسيوم الفوسفات المخزن المؤقت، ودرجة الحموضة 7.4 (108.3 ز خ2ص4 ، ز 35.6 ك2هبو4المياه إلى 1 لتر).
- تحضير حل هيبوكلوريت بخلط 25 مل كوه ن 1، 4 مل من التبييض، ومل 71 من المياه. جعل هذا الحل الطازجة.
- إعداد المخزن المؤقت M9 بخلط ز 3 خ2ص4، ز 6 غ2هبو4، 5 غ من كلوريد الصوديوم، ومل 5 1 م MgSO4، والمياه للأم 1
- إعداد المخزن المؤقت S18 بخلط مل 129 0.02 م ك2مكتب البراءات الهنغاري4ومل 871 من خ2بو4ز 5.85 من كلوريد الصوديوم.
- تعقيم المخازن المؤقتة M9 و S بالتعقيم.
- تنمو ثقافة بين عشية وضحاها من الإشريكيّة القولونية (الفقرتان 50 سلالة) في 20 مل من مرق لوريا (رطل).
- حل منهاج عمل بيجين في الإيثانول 10% لجعل حل أسهم 1 مم. جعل تخفيف اللاحقة من 0.1 ميكرومتر، 0.5 ميكرومتر، 1 ميكرومتر، 5 ميكرومتر و 10 ميكرون في المخزن المؤقت S.
ملاحظة: التخفيف في المخزن المؤقت S مائي يقلل إلى حد كبير تركيز الإيثانول؛ على سبيل المثال، يتم تركيز الإيثانول في أعلى تركيز BPA الموصوفة في هذا البروتوكول (10 ميكرومتر)، 0.1% v/v.
2-كولتورينج C. ايليجانس والمزامنة
- صب وسائط الإعلام NGM في لوحات 100 مم (حوالي 25 مل في اللوحة) وتسمح بترسيخ. متى وطدت، البذور اللوحات بنشر 150 ميليلتر من OP50 كولاي من ثقافة السائل نمت بين عشية وضحاها. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- في اليوم التالي، نقل الديدان N2 على لوحات جديدة chunking بلاطة تقريبي لساحة 1 سم. تسمح الديدان تنمو لمدة 3 أيام في 20 درجة مئوية حتى يتم نشر اللوحة مع البالغين ناضجة جيدا تغذية تحتوي على أجنة مرئية.
- لمزامنة، يغسل كل لوحة من بيبيتينج يصل إلى 5 مل من المخزن المؤقت M9 عبر اللوحة. نقل السائل إلى أنبوب الطرد مركزي مخروطية عقيمة 15 مل.
ملاحظة: يتم التزامن لقتل الديدان الكبار وجمع الأجنة التي هي نسبيا من المرحلة ذاتها. - الطرد المركزي في 3,000 ز س لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة من أجل الحصول بيليه فضفاض من الديدان الكبار.
- استخدام ماصة 10 مل، بعناية إزالة المادة طافية بغية ترك بيليه سليمة. إضافة 5 مل الحل تحت كلوريت وتخلط بلطف.
- الطرد المركزي في 3,000 س ز في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 دقائق.
- إزالة المادة طافية مع ماصة 10 مل وتغسل مع 7 مل من المخزن المؤقت M9. كرر هذه الخطوة مرتين.
3-تعريض الديدان لمنهاج عمل بيجين
- بعد الغسيل الأخير من الخطوة 2.7 أعلاه، وقف حوالي 100 ميليلتر من البيض مع المخزن المؤقت M9. نقل حوالي 50 ميليلتر من البيض إلى 2 مل [ميكروفوج] أنابيب الفعل الذي يتضمن التركيز المناسب المخفف منهاج عمل بيجين في المخزن المؤقت S. ضبط مقدار S-المخزن المؤقت لضمان تركيز النهائية الصحيحة لمنهاج عمل بيجين (0.0 ميكرومتر، 0.1 ميكرومتر، 0.5 ميكرومتر، 1.0 ميكرومتر، 5.0 ميكرومتر و 10 ميكرون) كل أنبوب. ويوضح الجدول 1 طريقة واحدة لجعل هذه تخفيف.
| لتركيز النهائي منهاج عمل بيجين | الأسهم منهاج عمل بيجين (100 ميكرومتر) | المخزن المؤقت S | الديدان متزامنة |
| 0.1 ميكرو | 1 ميكروليتر | ميكروليتر 949 | 50 ميكروليتر |
| 0.5 ميكرومتر | 5 ميكروليتر | ميكروليتر 945 | 50 ميكروليتر |
| 1 ميكرومتر | 10 ميكروليتر | ميكروليتر 940 | 50 ميكروليتر |
| 5 ميكرومترات | 50 ميكروليتر | ميكروليتر 900 | 50 ميكروليتر |
| 10 ميكرومتر | 100 ميكروليتر | ميكروليتر 850 | 50 ميكروليتر |
الجدول 1: تقييم منهاج عمل بيجين، والمخزن المؤقت S والديدان متزامنة تستخدم لبلوغ التركيزات المطلوبة المستخدمة لدراستنا.
- وضع أنابيب على شاكر وهزه برفق ح 4 في 20 درجة مئوية، في الدقيقة 25 ل شاكر دوارة أو يميل بالدقيقة 25 ل شاكر هزاز.
- بعد ح 4، وضع الأنابيب في أنبوب أصحاب والسماح للديدان تسوية.
- تجاهل المادة طافية ونقل الديدان إلى لوحات المصنف (لوحات NGM مع OP50 كولاي). جعل ثقافة OP50 كولاي السائل كما ورد في 1.5 والبذور اللوحات كما ورد في 2.1.
- واسمحوا الديدان تنمو على ح 60 في 20 درجة مئوية. فحص الصفائح كل يوم للتلوث. لوحات NGM الملوثة عادة مشوه ومصحوبة بمستعمرات فردية. تحقق من الديدان تحت المجهر لاكتظاظ السجون. نقص في الحديقة OP50 كولاي والديدان تتركز في بقع صغيرة تعني الاكتظاظ.
4-الأمامي تعمل باللمس التعود الإنزيم
- نقل حوالي 10 شباب متزامنة بيك الديدان الكبار إلى لوحات NGM المصنف الجديد باستخدام سلك البلاتين 30 ز تعقيم النار. اترك الديدان دون عائق لمدة 5 دقائق للسماح لهم الوقت للتأقلم على لوحة جديدة.
- لاستجابة التعود، استخدام شعر الحاجب تعلق على نهاية سيخ خشبي أو مسواك، وتعقيم بالغمس في الإيثانول 70%. امسح منديل نظيفة خالية من الوبر والانتظار لمدة 1 دقيقة على الإيثانول تتبخر قبالة. اللمس بلطف الدودة على رأسه (الأمامي اللمبة البلعوم) باستخدام شعر الحواجب. كرر اللمسات، السماح 10 s بين اللمسات بغية السماح للفيروس المتنقل لاسترداد.
- ما زالت تعمل باللمس (السماح بفترات إينتيرستيمولوس s 10) حتى الدودة لم يعد يتحرك إلى الوراء. عند هذه النقطة، قد اعتادوا الدودة للحافز. سجل عدد اللمسات المطلوبة للدودة روض.
- تحليل الفرق بين معدلات التعود يعني ضوابط المعالجة واستخدام ANOVA اتجاه واحد متبوعاً باختبار توكي للمخصص بعد.
5-دودة خصوبتها الإنزيم
- نقل الفردية L3 الديدان إلى لوحة طازجة والمصنف باستخدام اختيار البلاتين. تأكد من أن يتم وضع هذا دودة واحدة فقط للوحة الواحدة.
ملاحظة: بعد مرحلة اليرقات L3، الديدان تتطور إلى مرحلة اليرقات L4 وسن الرشد. الانتقاء لهم في وقت مبكر مناسب في ذلك فكبيرة بما يكفي لنقل الحيوانات الفردية مع ضمان أنها لا وضعت فعلا أي البيض الذي خلاف ذلك سوف تضيع في العد. - عد أرقام البيض تضعه كل ح 12 – 24. وبعد فرز الأصوات، نقل الدودة الأم للوحة جديدة. كرر حتى الدودة يتوقف وضع البيض، عادة بعد 5 أيام عند المحتضنة في 20 درجة مئوية.
ملاحظة: في المتوسط، يمكن وضع دودة نوع البرية البيض يصل إلى 300؛ ولذلك، يمنع نقل الأصل إلى لوحة جديدة يوميا الاكتظاظ. - تحليل الفرق بين متوسط عدد البيض زرعتها عناصر المعالجة واستخدام ANOVA اتجاه واحد متبوعاً باختبار توكي للمخصص بعد.
Representative Results
وأفادت الدراسات السابقة مع C. ايليجانس أن التعرض المستمر لتركيزات عالية من منهاج عمل بيجين (إيه وان ملم) في جميع أنحاء تطوير الجنين ومرحلة البلوغ يقلل الخصوبة14. وقد أظهرت الدراسات اللاحقة التي أفادت من لدينا مختبر أن الأجنة التي تعرضت لمنهاج عمل بيجين لفترة محدودة من ح 4 في المراحل الأولى من التنمية أظهر انخفاضا في عدد البيض مجدية أرسى كالبالغين15 (الشكل 2). اثنين من الميزات الرئيسية للمنهجية كانت أن تركيزات منهاج عمل بيجين (ط) المستخدمة كانت إلى حد كبير أقل (0.1 ميكرومتر إلى 10 ميكرون النطاق) والتعرض (ثانيا) يقتصر على الفترة الجنينية المبكرة. بالإضافة إلى انخفاض الخصوبة وحتى في الجرعات المنخفضة، كشفت فحوصات التعود لدينا أن الديدان معرضة لمنهاج عمل بيجين كما الأجنة المطلوب أكثر المحفزات تصبح اعتادوا عند مقارنة بالديدان معرضة للسيارة وحدها15 (الشكل 3). هذه الآثار الجديرة بالذكر في ذلك أنها تعتمد على جرعة منخفضة التعرض BPA، بعد الأساس المنطقي أن الآثار أكثر دهاء في وظيفة الخلايا العصبية التي قد لا تكون ظاهرة شكلياً من المحتمل أن يكون واضحا من خلال التغييرات السلوكية. باختصار، الممثل عرض النتائج هنا التأكيد على حقيقة أن الآثار الضارة للتعرض BPA لجنين يؤثر في التنمية، بما في ذلك وظيفة الخلايا العصبية التي يمكن تقييمها من خلال فحوصات السلوكية الكبار في C. ايليجانس. يمكن استخدام البروتوكولات المقدمة هنا لاختبار آثار الجرعات المنخفضة وكذلك الطويلة الأجل سميات المحتملة الأخرى بما في ذلك مركبات اضطراب الغدد الصماء.
رقم 1: التمثيل التخطيطي للتصميم التجريبي- وجمعت الديدان الناضجة وعرضه للحل تحت كلوريت بغية جمع الأجنة متزامنة. ثم تعرض الأجنة لتركيزات مختلفة من منهاج عمل بيجين ح 4. تم نقل الأجنة المعرضين على لوحات NGM المبذورة، حيث سمح لهم أن تنمو على ح 60 في 20 درجة مئوية. من أجل اختبار فعالية التعرض خلال المراحل الأولى من التنمية، الديدان L4 تم تحويلها إلى لوحات فردية واختبارها للخصوبة، وصغار البالغين تم اختباره مع عملية تعود اللمس الأمامي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: هو خفض الخصوبة بمنهاج عمل بيجين- التعرض إلى 1 ميكرومتر وتركيزات أعلى من منهاج عمل بيجين تناقص عدد البيض تضعه بالمقارنة مع عنصر التحكم (ممثلة بواسطة خط أفقي؛ n = 10، *p < 0.05). أشرطة الخطأ الدلالة sem. التحليل القيام به باستخدام ANOVA، الاختبار في توكي المخصص بعد. لقد تم تعديل هذا الرقم من ميرشا et al., 201515. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: الآثار طويلة الأمد للتعرض BPA الجنينية تنعكس في سلوك الكبار- الأجنة المعرضة لمنهاج عمل بيجين تركيزات منخفضة كما 0.1 ميكرومتر يؤثر على عملية تعود اللمس الأمامي غير قابل للاقتران في البالغين (n = 60، *p < 0.05). أشرطة الخطأ تدل على وزارة شؤون المرأة؛ ANOVA، توكي في آخر الاختبار المخصص. لقد تم تعديل هذا الرقم من ميرشا et al., 201515. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
مراحل النمو السريع والتنمية مثل embryogenesis معرضة بشكل خاص للآثار الضارة للمركبات الصماء المختلفة، بما في ذلك منهاج عمل بيجين. نحن توفير بروتوكولات مفصلة لدراسة آثار التعرض لمنهاج عمل بيجين أو سميات أخرى في نموذج اللافقارية C. ايليجانس ، الذي يسمح لمعايرة ملائمة لطائفة من تركيزات لتقييم أثره على سلامة الجنين (الشكل 2) . متابعة التجارب السلوكية الباقين على قيد الحياة الكبار التي وضع من الأجنة أن كانت تتعرض لانخفاض جرعات من منهاج عمل بيجين يسمح المعايرة آثار طويلة الأجل على وظيفة الخلايا العصبية (الشكل 3). والفكرة الأساسية لهذه الورقة توفير بروتوكولات مفصلة لتعريض الأجنة سميات المختلفة أثناء فترة embryogenesis المبكر في نموذج C. ايليجانس ؛ الإطار 4 ح أول فترة التطور الجنيني 11.5 ساعة (عند 20 درجة مئوية) يتوافق مع فترة الانتشار، التي تبعتها organogenesis. تحقيقا لهذه الغاية، وقد قدمنا التحقق نقطة النهاية عن طريق الخصوبة وفحوصات التعلم غير النقابي. بينما هو أساس ميكانيكية عمل منهاج عمل بيجين وغيرها بيسفينولس الكأس المقدسة التي تهدف البحوث في هذا المجال، علينا عدم محاولة تقدم تفسيراً آليا للعمل لمنهاج عمل بيجين في هذا المقال منهجية مركزة. ومع ذلك، نود أن نشير إلى أن النموذج ايليجانس جيم- يوفر نظام مثالي تشريح وكذلك إليه العمل. على سبيل المثال، العمل في المستقبل على فك رموز آليات العمل منهاج عمل بيجين، ويمكن أن تتولد طفرات C. ايليجانس وفرزهم لمقاومة الآثار لمنهاج عمل بيجين ومما يمهد الطريق لفك المسار. بالإضافة إلى ذلك، تتناول ورقتنا رفيق تأثير منهاج عمل بيجين على مستوى التزامن الشبكة العصبية في الفقاريات، توفر سبيلاً آخر لفهم الأساس للتحقيق في الآليات المحتملة للتأثيرات السمية19.
في المنهجية المفصلة في هذه الورقة، بعض الخطوات الحاسمة التي ينبغي أن تنفذ إضافية بعناية وتشمل ما يلي: اختيار صفيحة مع جيدا تغذية C. ايليجانس الكبار مع البيض الناضجة مرئية تحت المجهر تشريح أمر حاسم، و سيؤدي الفشل في اتباع هذه الخطوة على حجم عينة غير كافية من الأجنة لأغراض التجربة التعرض لتنمية الصادرات. من المهم أيضا التأكد من أن يجعل الحل تحت كلوريت الطازجة لتجنب الحصول على نسبة سكان غير متزامنة التي سوف يتداخل مع القدرة على تنفيذ منهاج عمل بيجين التعرض خلال embryogenesis المبكر. الغسيل الكريات مع M9 (بعد التعرض تحت كلوريت) أيضا خطوة هامة جداً. إذا لم تفعل بشكل صحيح، قد يؤدي التركيز العالي للتبييض أجنة ميتة. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن تنقل الأجنة إلى المصنف NGM لوحات بعد ح 4. إذا تركت في حل BPA لفترة ممتدة من الوقت، من المحتمل أن تتطور لتصبح اليرقات دوير المعمرة الأجنة. هذا سوف تتداخل إلى حد كبير مع تحليل الخصوبة وفحوصات السلوكية. إذا غاب عن أي من هذه الخطوات، من المستحسن لبدء الإجراءات من البداية. إذا كان لأي سبب من الأسباب، لوحة NGM مع الديدان ملوثة أو ليس لديه ما يكفي من الغذاء، فإنه سيضيف الإجهاد على الديدان وبالتالي انحراف البيانات المجمعة. يجب أن يتم تجاهل هذه اللوحات ولا يمكن استخدامها في التجربة.
سابقا، دراسة رائعة بنجاح باستخدام طراز C. ايليجانس لتثبت أن شذوذ صبغي الناجمة عن النتيجة منهاج عمل بيجين بسبب الانهيار آليات إصلاح الحمض النووي في germline14. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن تصميم الدراسة المذكورة أعلاه استخدمت التعرض BPA المستمر من C. ايليجانس لجرعات عالية من منهاج عمل بيجين في جميع أنحاء لها عمر. لدينا منهجية تهدف إلى دراسة جرعات منخفضة من التعرض BPA أثناء embryogenesis المبكر، بغية الاعتداء آثارها على صلاحية الجنينية وأكثر دهاء آثار طويلة الأجل على الباقين على قيد الحياة. قد وضعت على حد علمنا، لا منهجية للكشف عن الأجنة المرحلة المبكرة لجرعات منخفضة جداً من منهاج عمل بيجين محدودة لفترة محددة من الزمن؛ وهكذا، مما يجعل هذه الطريقة المعروضة هنا الرواية.
وبالإضافة إلى ذلك، توفر البروتوكولات هنا يمكن تكييفها بسهولة لدراسة آثار أخرى يشكل خلال مرحلة الانتشار embryogenesis. ومع ذلك، من أجل دراسة المراحل الجنينية المتأخرة، سيتطلب البروتوكول التعديلات الرئيسية إلى إطار الوقت الحاسم للتنمية في إطار التركيز. وعلاوة على ذلك، لدينا البروتوكول لن يكون مناسباً للتجارب التي تتطلب أوقات أطول من التعرض للسمية، كما أنه يفتح إمكانية مسار التنمية البديلة أسفر عن إلقاء القبض على دوير المعمرة في دورة التقشر الثانية، ومقاومة إلى20من ظروف قاسية. المزيد من التعديلات والتحسينات ستكون هناك حاجة للتعرض لأوقات أطول من خلال الملحق مع مصدر لغذاء التي ليس لديها القدرة على استقلاب أنها سامة أو تنمية الصادرات مثل يعقم كولاي. وفي الختام، يمكن أن تستخدم لدينا منهجية لتقييم آثار المواد الكيميائية على الخصوبة ووظيفة الخلايا العصبية الصماء المختلفة في النظام النموذجي اللافقاريات C. ايليجانس.
Disclosures
الكتاب يعلن أن لديهم أي شيء كشف.
Acknowledgments
دعم من جبهة الخلاص الوطني (EPS ابسكور-0814251)، والمعاهد الوطنية للصحة (1P20GM103653-01A1) MKT و HSD، جامعة ولاية ديلاوير في دعم الطلاب المؤسسية لأطباء العالم (العنوان الثالث هبجي) وكرس (المعاهد الوطنية للصحة-إينبري) هو العرفان. شكرا لمركز الوراثية C. ايليجانس (بدعم من مكتب OD010110 P40 برامج البنية التحتية البحثية المعاهد الوطنية للصحة) لسلالة N2 البرية من نوع C. ايليجانس .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher | 7647-14-5 | |
| Peptone | Fisher | S25761B | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| Cholesterol | Alfa Aesar | A11470 | |
| MgSO4 | Fisher | 7487-88-9 | |
| CaCl2 | Fisher | C79-500 | |
| KH2PO4 | Fisher | P286-1 | |
| K2HPO4 | Fisher | 7758-11--4 | |
| KOH | Fisher | 1310-58-3 | |
| Bleach | Clorox | n/a | |
| Na2HPO4 | Fisher | BP332-500 | |
| LB | Fisher | BP1426-500 | |
| BPA | Sigma-Aldrich | 239658-250g | |
| BPS | Sigma-Aldrich | 103039-100g | |
| EtOH | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| E.coli OP50 | CGC | Repository at U of Minnesota | |
| N2 (Wild-type C. elegans) worms | CGC | Repository at U of Minnesota | |
| Platinum wire pick | Genesee Scientific | 59-AWP | |
| Petri plates | Fisher | 07-202-011 | |
| Dissection Microscope | AmScope | SM-2TYY |
References
- Gore, A. C., et al. Executive Summary to EDC-2: The Endocrine Society's Second Scientific Statement on Endocrine-Disrupting Chemicals. Endocr. Rev. 36, 593-602 (2015).
- Braun, J. M. Early-life exposure to EDCs: role in childhood obesity and neurodevelopment. Nat. Rev. Endocrinol. 13, 161-173 (2017).
- Melnik, R., et al. Summary of the National Toxicology Program's Report of the Endocrine Disruptors Low-Dose Peer Review. Environ. Health Perspect. 110, 427-431 (2002).
- Kortenkamp, A. Ten years of mixing cocktails: a review of combination effects of endocrine-disrupting chemicals. Environ. Health Perspect. 115 Suppl 1, 98-105 (2007).
- Vandenberg, L. N., et al. Hormones and endocrine-disrupting chemicals: low-dose effects and nonmonotonic dose responses. Endocr. Rev. 33, 378-455 (2012).
- Eramo, S., Urbani, G., Sfasciotti, G. L., Brugnoletti, O., Bossu, M., Polimeni, A. Estrogenicity of bisphenol A released from sealants and composites: a review of the literature. Ann Stomatol. (Roma). 1, 14-21 (2010).
- Cantonwine, D. E., Ferguson, K. K., Mukherjee, B., McElrath, T. F., Meeker, J. D. Urinary Bisphenol A Levels during Pregnancy and Risk of Preterm Birth. Environ. Health Perspect. 123, 895-901 (2015).
- Vandenberg, L. N., Maffini, M. V., Sonnenschein, C., Rubin, B. S., Soto, A. M. Bisphenol-A and the great divide: a review of controversies in the field of endocrine disruption. Endocr. Rev. 30, 75-95 (2009).
- Suzuki, T., et al. Prenatal and neonatal exposure to bisphenol-a enhances the central dopamine d1 receptor-mediated action in mice: enhancement of the methamphetamine-induced abuse state. Neuroscience. 117, 639-644 (2003).
- Rosenfeld, C. S. Bisphenol A and phthalate endocrine disruption of parental and social behaviors. Front. Neurosci. 9, 1-15 (2015).
- Patisaul, H. B., Adewale, H. B. Long-term effects of environmental endocrine disruptors on reproductive physiology and behavior. Front. Behav. Neurosci. 3, 10 (2009).
- Lee, D., Jacobs, D. R. Jr Methodological issues in human studies of endocrine disrupting chemicals. Rev. Endocr. Metab. Disord. 16, 289-297 (2015).
- Mimoto, A., et al. Identification of an estrogenic hormone receptor in Caenorhabditis elegans. Biochem. Biophys. Res. Commun. 364, 883-888 (2007).
- Allard, P., Colaiacovo, M. Bisphenol A impairs the double-strand break repair machinery in the germline and causes chromosome abnormalities. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 20405-20410 (2010).
- Mersha, M. D., Patel, B. M., Patel, D., Richardson, B. N., Dhillon, H. S. Effects of BPA and BPS exposure limited to early embryogenesis persist to impair non-associative learning in adults. Behav. Brain. Funct. 11, 27 (2015).
- Chen, Y., et al. Exposure to the BPA-Substitute Bisphenol S Causes Unique Alterations of Germline Function. PLoS Genet. 12, e1006223 (2016).
- Rankin, C. H., et al. Habituation revisited: an updated and revised description of the behavioral characteristics of habituation. Neurobiol. Learn. Mem. 92, 135-138 (2009).
- Hope, I. C elegans: A Practical Approach. , Oxford University Press. (1999).
- Sanchez, K., Mersha, M., Dhillon, H. S., Temburni, M. Assessment of the Effects of Endocrine Disrupting Compounds on the Development of Vertebrate Neural Network Function Using Multi-electrode Arrays. J. Vis. Exp. , In Press (2017).
- Hu, P. J. WormBook The C. elegans Research Community. , (2007).
