पर्यावरण विषालु के लिए जोखिम तीव्रता से दीर्घकालिक प्रभाव के साथ विकास को प्रभावित कर सकते हैं । विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए एक प्रभावी प्रयोगशाला मॉडल का उपयोग करने के लिए जल्दी भ्रूण जोखिम के प्रभाव का अध्ययन bisphenol एक रणनीति वर्णन प्रदान की जाती है हम fecundity और व्यवहार परख प्रदान करने के लिए हमारे विषाक्त जोखिम जैव की प्रभावशीलता की निगरानी परख ।
Bisphenols, जैसे bisphenol ए (BPA) और bisphenol एस (बीपीएस) polymerizing एजेंटों व्यापक रूप से प्लास्टिक और कई रोजमर्रा का उपयोग उत्पादों के उत्पादन में इस्तेमाल कर रहे हैं । उनकी रासायनिक संरचना और एस्ट्राडियोल की तरह जैविक गुणों के आधार पर, वे अंत में स्रावी बाधित यौगिकों (EDC) के रूप में वर्गीकृत किया गया है । EDCs के लिए दीर्घकालिक जोखिम, यहां तक कि कम मात्रा में, कैंसर, व्यवहार विकारों और बांझपन सहित विभिंन स्वास्थ्य दोषों से जोड़ा गया है, जल्दी विकास के समय के दौरान संकेत अधिक जोखिम के साथ । सेलुलर और आनुवंशिक रूप से परितंत्रीय निमेटोड मॉडल के साथ आणविक अध्ययन Caenorhabditis एलिगेंस प्रदर्शन किया है कि BPA के लिए जोखिम apoptosis का कारण बनता है, भ्रूण घातकता और डीएनए की मरंमत तंत्र में व्यवधान । हम पहले से बताया है कि सी. एलिगेंस भ्रूण के विभिंन bisphenols कम खुराक के लिए जोखिम fecundity कम हो जाती है । इसके अलावा, हमें पता चला है कि विकास के बहुत प्रारंभिक दौर के दौरान जोखिम के प्रभाव वयस्कता के रूप में आदी होना व्यवहार, गैर साहचर्य सीखने का एक रूप को बढ़ाता द्वारा परख में जारी रहती है । यहां, हम भ्रूण जोखिम के लिए कम खुराक EDCs के रूप में अच्छी तरह के रूप में संबद्ध fecundity और पूर्वकाल स्पर्श आदी होना परख, प्रतिनिधि परिणामों के साथ के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं ।
पर्यावरण विषालु के लिए जोखिम, विशेष रूप से उन है कि विकास के साथ हस्तक्षेप करते हैं, हाल के वर्षों में सावधान वैज्ञानिक जांच के तहत किया गया है यौगिकों । रोजमर्रा के उपयोग में एक हजार से अधिक रसायनों को अंत-स्रावी बाधित यौगिकों (EDC)1के रूप में वर्गीकृत किया गया है । तीव्र विकास और विकास, जो भ्रूण, शिशु और बचपन के चरणों में शामिल की अवधि के लिए विशेष रूप से भी कम खुराक EDC बचके प्रभाव के लिए संवेदनशील होना उल्लेख किया गया है । उनके प्रभाव प्रजनन और neurodevelopmental विकारों के कारण दिखाया गया है2. अमेरिकी पर्यावरण संरक्षण एजेंसी और अमेरिका के राष्ट्रीय विषविज्ञान कार्यक्रम पैनल के दिशा निर्देशों के अनुसार, एक कम खुराक एक के स्तर के नीचे किसी भी खुराक के रूप में परिभाषित किया जा सकता है कि एक चौकस जैविक परिवर्तन या क्षति के कारण सूचित किया गया है3. व्यक्तिगत EDCs के कम खुराक प्रभाव के अलावा, पर्यावरण में कम सांद्रता पर पाया विभिन्न EDCs के मिश्रण के लिए ठोस संचयी प्रभाव के कारण की क्षमता है4.
Bisphenol a (BPA या 4, 4 ‘-(प्रोपेन-2, 2-diyl)) एक polymerizing एजेंट पानी की बोतलें, स्टोर रसीद, दंत sealants के रूप में आमतौर पर इस्तेमाल मदों में पाया जाता है, और पेय और भोजन के डिब्बे के अस्तर5. 17 करने के लिए अपनी संरचनात्मक समानता के कारण-β एस्ट्राडियोल (ई2) और ERα और ERβ एस्ट्रोजन रिसेप्टर्स करने के लिए अपनी आत्मीयता, BPA एक अंत में खलल न डालने वाला रसायन (EDC)5,6के रूप में वर्गीकृत किया गया है । हालांकि कमजोर, BPA है एस्ट्रोजन रिसेप्टर्स के संबध दोनों लिंगों के प्रजनन प्रणाली को प्रभावित करने के लिए और खुराक है कि सुरक्षित7,8माना जाता है पर तंत्रिका कार्य बाधित दिखाया गया है । epigenetically विनियमित तंत्र के माध्यम से डीएनए मिथाइल में परिवर्तन करने के लिए देखा गया है लंबी अवधि के लिए चूहों में ंयूरॉन दोष9BPA से अवगत कराया । विशेष रूप से, BPA भी सक्रियता की वृद्धि की दर के लिए एक संभावित अपराधी के रूप में फंसाया गया है, ध्यान की कमी और एक वृद्धि की वजह से दवाओं के प्रति संवेदनशीलता में वृद्धि के लिए पुरानी जोखिम के बाद माउस अंग forebrain में डोपामाइन रिसेप्टर्स में देखा 9 , 10. मानव स्वास्थ्य पर EDCs के बचके प्रभाव पर महत्वपूर्ण सबूत सहसंबंध अध्ययन पर आधारित है मुख्यतः आबादी के पुराने जोखिम पर पर्यावरण विषालु को भी कम खुराक5पर ध्यान केंद्रित; हालांकि, मानव अध्ययन से निष्कर्ष में सीमाएं और प्रयोगात्मक नियंत्रण जोड़ तोड़ में स्वीकार किया गया है, जबकि अप्रमाणित प्रचार11,12की आलोचनाओं को संबोधित ।
इसके स्टेरॉयड हार्मोन रिसेप्टर जीन सहित ‘ स्तनधारियों के लिए सम्मान के साथ Caenorhabditis एलिगेंस ‘ जीन के संरक्षण के कारण, शोधकर्ताओं ने इस आनुवंशिक रूप से परितंत्रीय प्रयोगशाला मॉडल का उपयोग किया है EDCs के कार्यात्मक और यंत्रवत प्रभाव सुलझाना 13. C. एलिगेंस के साथ प्रयोगों से पता चला है कि BPA और बीपीएस के रूप में इन यौगिकों apoptosis, भ्रूण की मृत्यु, डबल-कतरा डीएनए तोड़ मरंमत तंत्र और तंत्रिका समारोह में व्यवधान पैदा कर सकता है14,15 ,16.
हमारी प्रयोगशाला पहले दिखाया गया है कि भी कम खुराक जोखिम जल्दी embryogenesis तक सीमित करने के लिए जीवित वयस्कों में व्यवहार घाटे के साथ fecundity कम हो जाता है15. एक दोहराया उत्तेजना के लिए आदी होना गैर का एक रूप है, मॉडल सिस्टम में साहचर्य सीखने की सी.एलिगेंस सहित, और हमारी पद्धति का उपयोग करता है गैर के इस फार्म का एक व्यवहार उत्पादन के रूप में सीखने-साहचर्य भ्रूण जोखिम के दीर्घकालिक प्रभाव के लिए विषालु17 विशेष रूप से, हम सी. एलिगेंसपर BPA जोखिम का अध्ययन करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, भ्रूण मृत्यु दर और वयस्क व्यवहार पर दीर्घकालिक प्रभाव पर अपने तत्काल प्रभाव सहित, एक समग्र में चित्रित योजनाबद्ध के साथ चित्रा 1. fecundity और गैर साहचर्य अधिगम परख से प्रतिनिधि परिणाम हमारी कार्यप्रणाली की प्रभावशीलता को उजागर करने के लिए प्रदान की जाती हैं ।
embryogenesis के रूप में तेजी से विकास और विकास के चरणों विशेष रूप से विभिन्न अंत – स्रावी-बाधित यौगिकों के हानिकारक प्रभावों के लिए संवेदनशील हैं, BPA सहित. हम सी. एलिगेंस invertebrate मॉडल में BPA या अंय विषालु के लिए जोखिम के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, जो सांद्रता की एक सीमा के सुविधाजनक अनुमापन भ्रूण व्यवहार्यता पर इसके प्रभाव का आकलन करने के लिए अनुमति देता है (चित्रा 2) . वयस्कों कि भ्रूण है कि BPA की कम खुराकों को उजागर कर रहे थे से विकसित करने पर व्यवहार प्रयोगों का पालन करें लंबी अवधि के प्रभाव को परख ंयूरॉन समारोह पर (चित्रा 3) । इस समाचार पत्र का केन्द्रीय विचार सी. एलिगेंस मॉडल में प्रारंभिक embryogenesis अवधि के दौरान विभिन्न विषालु को भ्रूण को उजागर करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करना है; इसके 11.5 घंटे भ्रूण विकास अवधि के पहले 4 एच खिड़की (20 डिग्री सेल्सियस से कम) प्रसार अवधि है, जो organogenesis द्वारा पीछा किया जाता है के लिए मेल खाती है । इस अंत की ओर, हम fecundity और गैर साहचर्य अधिगम परख के माध्यम से अंत अंक के सत्यापन प्रदान की है । जबकि bpa और अंय bisphenols की कार्रवाई के यंत्रवत आधार पवित्र कंघी बनानेवाले की रेती की ओर है, जो इस क्षेत्र में अनुसंधान के उद्देश्य से है, हम इस पद्धति में BPA की कार्रवाई के लिए एक यंत्रवत विवरण की पेशकश करने का प्रयास नहीं किया है लेख केंद्रित । हालांकि, हम बताते है कि सी. एलिगेंस मॉडल एक आदर्श प्रणाली को आगे कार्रवाई के तंत्र काटना प्रदान करता है चाहूंगा । उदाहरण के लिए, bpa कार्रवाई का गूढ़ तंत्र पर भविष्य के काम में, C. एलिगेंस म्यूटेंट उत्पन्न किया जा सकता है और bpa के प्रभाव के लिए एक प्रतिरोध के लिए जांच की और इस तरह मार्ग गूढ़ रहस्य के लिए रास्ता प्रशस्त. इसके अतिरिक्त, हमारे साथी रीढ़ में तंत्रिका नेटवर्क synchrony स्तर पर BPA के प्रभाव के साथ कागज सौदों, एक और अवसर प्रदान करने के लिए विषाक्त प्रभाव के लिए संभावित तंत्र की जांच के लिए आधार समझ19।
इस पत्र में विस्तृत कार्यप्रणाली में, कुछ महत्वपूर्ण कदम है कि निष्पादित किया जाना चाहिए के अतिरिक्त ध्यान से निंनलिखित शामिल हैं: अच्छी तरह से तंग आ गया के साथ एक थाली का चयन सी. एलिगेंस वयस्क के साथ परिपक्व अंडे विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे दिखाई महत्वपूर्ण है, और इस कदम का पालन करने में नाकाम रहने EDC जोखिम प्रयोग के लिए भ्रूण के एक अपर्याप्त नमूना आकार में परिणाम होगा । यह भी सुनिश्चित करें कि हाइपोक्लोराइट समाधान ताजा करने के लिए एक unसिंक्रनाइज़ जनसंख्या है कि जल्दी embryogenesis के दौरान BPA जोखिम प्रदर्शन करने की क्षमता के साथ हस्तक्षेप करेंगे प्राप्त करने से बचने के लिए महत्वपूर्ण है । M9 के साथ वाशिंग छर्रों (हाइपोक्लोराइट एक्सपोजर के बाद) भी एक बहुत ही महत्वपूर्ण कदम है । यदि ठीक से नहीं किया, ब्लीच के उच्च एकाग्रता मृत भ्रूण में परिणाम हो सकता है । इसके अतिरिक्त, भ्रूण 4 एच के बाद वरीयता प्राप्त NGM प्लेटों को हस्तांतरित किया जाना चाहिए । यदि समय की एक विस्तारित अवधि के लिए BPA समाधान में छोड़ दिया, भ्रूण लंबे समय से रहते थे dauer लार्वा में विकसित होने की संभावना है । यह काफी दोनों fecundity परख और व्यवहार परख के साथ हस्तक्षेप करेगा । यदि इन चरणों में से कोई भी याद किया जाता है, यह बहुत शुरुआत से प्रक्रिया शुरू करने के लिए सलाह दी जाती है । अगर किसी भी कारण से, कीड़े के साथ NGM प्लेट दूषित है या पर्याप्त भोजन नहीं है, यह कीड़ों पर तनाव बढ़ जाएगा जिससे एकत्र डेटा विषम । इस तरह के प्लेटों को छोड़ दिया जाना चाहिए और प्रयोग में नहीं किया जाना चाहिए ।
पहले, एक उल्लेखनीय अध्ययन सफलतापूर्वक सी. एलिगेंस मॉडल का इस्तेमाल किया है कि गुणसूत्र को BPA के कारण germline में डीएनए की मरंमत मशीनरी के टूटने की वजह से असामान्यताओं को प्रदर्शित करने के लिए14। तथापि, यह उल्लेखनीय है कि उपरोक्त अध्ययन डिजाइन सी. एलिगेंस के निरंतर bpa जोखिम का इस्तेमाल किया था अपनी उंर में bpa की उच्च खुराक के लिए । हमारी पद्धति जल्दी embryogenesis के दौरान BPA जोखिम की कम खुराक का अध्ययन करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, इसलिए के रूप में भ्रूण व्यवहार्यता पर अपने प्रभाव परख और बचे पर दीर्घकालिक प्रभाव subtler । हमारे ज्ञान के लिए, कोई पद्धति के लिए समय की एक निर्दिष्ट अवधि के लिए सीमित BPA के बहुत कम खुराक के लिए जल्दी चरण भ्रूण बेनकाब विकसित किया गया है; इस प्रकार, बनाने की विधि यहां प्रस्तुत उपंयास ।
इसके अलावा, यहां दिए गए प्रोटोकॉल को embryogenesis के प्रसार चरण के दौरान अंय EDCs के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है । हालांकि, देर से भ्रूण चरणों का अध्ययन करने के लिए, प्रोटोकॉल ध्यान के तहत विकास के महत्वपूर्ण समय खिड़की के लिए महत्वपूर्ण संशोधनों की आवश्यकता होगी । इसके अलावा, हमारे प्रोटोकॉल विषाक्त जोखिम की अब समय की आवश्यकता के प्रयोगों के लिए उपयुक्त नहीं होगा, क्योंकि यह ऊपर वैकल्पिक विकास के परिणामस्वरूप मार्ग की संभावना को खोलता है लंबे समय से दूसरे molting चक्र है, जो प्रतिरोधी है में dauer गिरफ्तारी रहते थे कठोर शर्तों को20। इसके अलावा संशोधनों और शोधन एक खाद्य स्रोत है कि क्षमता के लिए नहीं है के साथ पूरक के माध्यम से अब जोखिम समय के लिए आवश्यक हो जाएगा metabolize या EDC उदा autoclaved ई. कोलाई। अंत में, हमारी कार्यप्रणाली fecundity पर और invertebrate मॉडल प्रणाली सी. एलिगेंस में न्यूरॉन्स समारोह पर विभिन्न अंत में स्रावी बाधित रसायनों के प्रभाव का आकलन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है ।
The authors have nothing to disclose.
NSF द्वारा सहायता (EPSCoR EPS-०८१४२५१) और NIH (1P20GM103653-01A1) को मार्केट और एचएसडी, डेलावेयर राज्य विश्वविद्यालय के संस्थागत छात्र सहायता करने के लिए एमडीएम (शीर्षक III HBGI) और KRS (NIH-INBRE) आभार स्वीकार किया है । सी. एलिगेंस आनुवंशिक केंद्र के लिए धंयवाद (NIH कार्यालय द्वारा अनुसंधान अवसंरचना कार्यक्रम P40 OD010110) सी. एलिगेंस जंगली प्रकार N2 तनाव के लिए ।
NaCl | Fisher | 7647-14-5 | |
Peptone | Fisher | S25761B | |
Agar | Fisher | BP1423-500 | |
Cholesterol | Alfa Aesar | A11470 | |
MgSO4 | Fisher | 7487-88-9 | |
CaCl2 | Fisher | C79-500 | |
KH2PO4 | Fisher | P286-1 | |
K2HPO4 | Fisher | 7758-11–4 | |
KOH | Fisher | 1310-58-3 | |
Bleach | Clorox | n/a | |
Na2HPO4 | Fisher | BP332-500 | |
LB | Fisher | BP1426-500 | |
BPA | Sigma-Aldrich | 239658-250g | |
BPS | Sigma-Aldrich | 103039-100g | |
EtOH | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
E.coli OP50 | CGC | Repository at U of Minnesota | |
N2 (Wild-type C. elegans) worms | CGC | Repository at U of Minnesota | |
Platinum wire pick | Genesee Scientific | 59-AWP | |
Petri plates | Fisher | 07-202-011 | |
Dissection Microscope | AmScope | SM-2TYY |