Method Article

تصوير الكالسيوم اثنين-فوتون في Dendrites العصبية في الدماغ شرائح

DOI:

10.3791/56776

⸱

March 15th, 2018

 , 
1CHU de Québec-Université Laval Research Center, Université Laval, 2Department of Biochemistry, Microbiology and Bioinformatics, Université Laval

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن نقدم طريقة الجمع بين تسجيلات المشبك تصحيح كامل الخلية واثنين-فوتون التصوير لتسجيل Ca2 + العابرين في dendrites العصبية في الدماغ الحادة شرائح.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصوير الكالسيوم (Ca2 +) أداة قوية للتحقيق في ديناميات الزمانية المكانية Ca2 + الإشارات داخل الخلايا في الخلايا العصبية dendrites. يمكن أن يحدث من خلال مجموعة متنوعة من آليات داخل الخلية والغشاء Ca2 + تقلبات وتلعب دوراً حاسما في تحريض اللدونة متشابك والتنظيم لاستثارة الجذعية. ومن ثم فالقدرة على تسجيل أنواع مختلفة من Ca2 + إشارات في فروع الجذعية قيماً لمجموعات دراسة كيفية دمج dendrites المعلومات. ظهور مجهرية اثنين-فوتون جعلت هذه الدراسات أسهل بكثير عن طريق حل المشاكل الملازمة للتصوير في الأنسجة الحية، مثل نثر الخفيفة ود. وعلاوة على ذلك، من خلال مجموعة من التقنيات الكهربية التقليدية مع اثنين-فوتون Ca2 + التصوير، فمن الممكن للتحقيق المحلي Ca2 + التقلبات في الخلايا العصبية dendrites جنبا إلى جنب مع تسجيلات النشاط متشابك في سوما. هنا، نحن تصف كيفية استخدام هذا الأسلوب لدراسة ديناميات محلية Ca2 + العابرين (القطط) في dendrites جابايرجيك إينتيرنيورونس المثبطة. الأسلوب يمكن تطبيقها أيضا على دراسة الجذعية Ca2 + إشارات في مختلف أنواع الخلايا العصبية في الدماغ الحادة شرائح.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المساهمة من خلية إلى نشاط الشبكة يتحدد إلى حد كبير بالطابع الدينامي للمدخلات متشابك التي يتلقاها. تقليديا، يعتمد الأسلوب السائد لوصف النشاط متشابك في الخلايا العصبية على تسجيلات المشبك التصحيح كل خلية جسدية من تيارات بوستسينابتيك أثارت قبل التحفيز الكهربائي لمحاور عصبية مرور. ومع ذلك، يقال صدق النشاط الوحيد لنهايات بروكسيمالي يقع في هذه الحالة1. وبالإضافة إلى ذلك، قد استخدمت لتقييم الآليات الخاصة بالمشبك، تسجيلات من أزواج من الخلايا العصبية ومن dendrites في موقع معين لاستهداف نقاط الاشتباك العصبي للفائدة وآليات التكامل الجذعية، على التوالي. وقد تحقق إنجازا كبيرا في مجال الفسيولوجيا متشابك عن طريق أج تقنيات الضوئية والكهربية. اثنين-فوتون الإثارة....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جميع التجارب التي أجريت وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة حماية الحيوان من جامعة لافال، والمجلس الكندي للعناية بالحيوان الرفق بالحيوان.

1-أولى إعداد (اختياري: إعداد يوم 1 مقدما)

  1. إعداد ثلاثة أنواع من السائل الدماغي النخاعي الاصطناعية (قام) الحل (كل من عادي، السكروز وحلول الاسترداد، 1 L؛ انظر الجدول 1). ضبط أوسمولاليتي الحلول ل موسم ± 10 30025 وبارد قام-السكروز وصولاً إلى نقطة بالقرب من تجميد (0-4 درجة مئوية).
    ملاحظة: استخدام حل قطع منخفضة الصوديوم (قام-السكروز) يساعد في الحفاظ على بقاء الخلايا العصبية في الطبقات السطحية لشرائح الحادة26.
  2. إعداد 0.75 مل من التصحي....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام بروتوكول المعروضة هنا، حصلنا على القطط أثارت طريق الحقن الحالية جسدية والتحفيز الكهربائي في dendrites oriens/ألفيس إينتيرنيورونس في منطقة CA1 الحصين. بعد الترقيع خلية، حدد استناداً إلى الشكل والموقف، اكتسبنا لينيسكانس عبر تغصن الدانية في نقاط متعددة في ضوء المسافات من سوما (الشكل 1A). لاحظنا انخفاضا في السعة للقطط التي تحدثها باكبروباجاتينج وكالة الأنباء الجزائرية كالمسافة من سوما زاد (تشير إلى انخفاض AP السعة أو انخفاض المسافة تعتمد على التوزيع قناة.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأسلوب هو موضح أدناه يوضح كيف يمكن استخدام المزيج من اثنين-فوتون Ca2 + تصوير والتصحيح-المشبك الكهربية لدراسة الجذعية Ca2 + إشارات في dendrites العصبية في الدماغ الحادة شرائح. يسمح هذا الأسلوب للرصد لكلا المحلية Ca2 + المرتفعات أثارت قبل AP التحفيز أو باكبروباجاتينج الكهربائية في قطاعات الجذعية، واستجابة للخلية الجسدية. وهذا يجعل من أداة ممتازة دراسة كيفية مختلف أجزاء الشجرة الجذعية إدماج المدخلات والتواصل مع سوما. ولكن نظراً لطول التجربة، يحتاج اهتماما خاصا إيلاء صحة الخلية عن طريق الحد .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب قد لا يوجد تضارب المصالح المالية أو غيرها تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا العمل كان يدعمها مجلس المعاهد الكندية للبحوث الصحية والعلوم الطبيعية والبحوث الهندسية (منحة اكتشاف الأموال) و "مؤسسة سافوي". وأيد قائد زمالة دكتوراه من الأموال.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials


List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
سلالة: الفأر CD1نهر تشارلز022
IsofluraneAbbVie Corporation0B506-099
CGP 55845 هيدروكلوريدAbcamab120337
كلوريد الكالسيوم   ؛سيجما ألدريتشC4901
D- (+) - الجلوكوز   ؛سيجما ألدريتشG8270
هيبسسيجما ألدريتشH3375
كلوريد المغنيسيوم  Sigma-AldrichM8266
كبريتات المغنيسيوم سباعي هيدراتسيجما ألدريتش230391
مسحوق بارافورمالدهايد ، 95٪سيجما ألدريتش158127
كلوريد البوتاسيوم   ؛Sigma-AldrichP3911
غلوكونات البوتاسيوم سيجما ألدريتشP1847
أزيد الصوديوم Sigma-AldrichS2002
بيكربونات الصوديوم  سيجما ألدريتشS8875
كلوريد الصوديوم  Sigma-AldrichS5886
السكروز سيجما ألدريتشS9378
تريتون X-100  Sigma-AldrichT9284
قاعدة Trizma سيجما ألدريتشT1503
تريزما هيدروكلوريد Sigma-AldrichT3253
ثنائي هيدرات فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة  Sigma-Aldrich71643

فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة
monohydrate  		سيجما ألدريتشS9638
بيوسيتينسيجما-ألدريتشB4261
أليكسا فلور 594 هيدرازيدثيرموفيشر ساینتفيكA10438
SR95531 (جابازين)  Abcamab120042

أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) - تريس		سيجما - ألدريتشA9062

جوانوزين (GTP) - Na + < / sup>		سيجما ألدريتشG8877

أوريغون جرين BAPTA-1		ThermoFisher ScientificO6812

ملح فوسفوكرياتين دي (تريس)		سيجما ألدريتشP1937

Alexa-546		ThermoFisher ScientificS11225

Patch Glass البورسليكات الشعيرات الدموية		العالمية للأدواتالدقيقة 1B100F-4

ثيتا البورسليكات الزجاجية الشعيرات الدموية		أداةSutter BT-150-10

P-97 مشتعل / براون مجتذب ماصة		Sutter

TCS SP5 مجهر متعدد الفوتون متحد البؤر		Leica Microsystems

Chameleon Ultra II Ti: ليزر متعدد الفوتون الياقوتي  		متماسك
LAS AF Imaging Acquisition SoftwareLeica Microsystems

Temperature Controller TC-324B		Warner Instruments

MultiClamp 700B مكبر		للصوت الأجهزة

Digidata 1440A أجهزة جزيئية

متحد البؤر المترجم		Siskiyou

Micromanipulator		Siskiyou<
br / > pClamp برامج الحصول على البياناتالأجهزة الجزيئية

A365 عازل التحفيز الحالي		المستمر العالمية أدوات
حركيةالجدول البصري الاهتزازي
دقيقة أداة الجزيئية محول الأرقام الدقة أنظمة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Williams, S. R., Mitchell, S. J. Direct measurement of somatic voltage clamp errors in central neurons. Nat Neurosci. 7, 790-798 (2008).
  2. Denk, W., Svoboda, K. Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick. Neuron. 18, 351-357 (1997).
    3. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Two photon Calcium ImagingNeuronal DendritesBrain SlicesWhole cell Patch clampCalcium TransientsDendritic SignalingSynaptic PlasticityElectrophysiology RecordingLaser Scanning MicroscopyFluorescence Imaging

Related Articles