Summary
يصف لنا التصوير البصري للفئران المصابة بكتريا السل (السل م) استخدام fluorescence الإنزيم المراسل (المرجع). هذا البروتوكول يسهل اكتشاف السل م حساسة ومحددة في نماذج حيوانية قبل الإكلينيكية للبحوث المرضية والعلاجات واللقاحات.
Abstract
مراسل إنزيم الفلورية (REF) يستخدم ركائز محددة للإنزيمات الموجودة في الكائنات المستهدفة من الفائدة للتصوير أو الكشف عن طريق الأسفار أو الإضاءة الحيوية. فنحن نستخدم BlaC، إنزيم أعرب مؤثرا بجميع سلالات السل م . يسمح المرجع السريع الكمي للبكتيريا في رئات الفئران المصابة. يمكن تصويرها نفس المجموعة من الفئران في العديد من النقاط الزمنية، إلى حد كبير خفض التكاليف، تعداد البكتيريا بسرعة أكبر، ويسمح الملاحظات الرواية في التفاعلات المضيف الممرض، وزيادة القوة الإحصائية، حيث يتم الاحتفاظ بسهولة أكثر الحيوانات كل مجموعة . المرجع حساسة نظراً إلى الطابع الحفاز للمراسل الانزيمية BlaC للغاية ومحددة بسبب نقل الطاقة الرنين flourescence مخصصة (الحنق) أو ركائز فلوروجينيك المستخدمة. لا تتطلب REF سلالات المؤتلف، كفالة التفاعلات الممرض المضيف العادي. يصف لنا تصوير عدوى السل م استخدام ركيزة الحنق مع الانبعاثات القصوى 800 نانومتر. الطول الموجي للركيزة يسمح تصوير الأنسجة العميقة الحساسة في الثدييات. ونحن سوف مخطط العدوى الهباء الجوي من الفئران السل م، تخدير فئران، والإدارة الركيزة المرجع، والتصوير الضوئي. وقد طبقت هذه الطريقة بنجاح لتقييم التفاعلات المضيف الممرض وفعالية المضادات الحيوية التي تستهدف السل م..
Introduction
معدل النمو البطيء السل م. عقبة كبرى في التشخيص السريع لمرض السل1،،من23. بينما الثقافة القائمة على التشخيص يأخذ أسابيع إلى نتائج، قد تشويه acid-fast القيود التشخيص4 في5 من الأطفال والمرضى المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية6،7. تقنيات التصوير الضوئي اعترف مؤخرا كبديل لطرق التشخيص التقليدية للسل8،9. الأسفار والإضاءة الحيوية يمكن استخدامها للصور بصريا السل م في الحيوانات الحية في الوقت الحقيقي10،11،،من1213،14، 15،،من1617،،من1819. التصوير الضوئي بالاستفادة من إجراء تقييم سريع ومحدد للعدوى السل م20،،من2122.
أننا مخطط التفاصيل للتصوير الضوئية السل م في حية الفئران باستخدام REF. هذا الأسلوب هو محددة جداً وحساسة23،24 ، وهو مماثل لوسائل بصرية أخرى، أقل تكلفة من الطرق الأخرى للدرن (السل) التصوير25، بما في ذلك التصوير المقطعي (CT)26، المغناطيسية صدى التصوير (التصوير بالرنين المغناطيسي)27، و التصوير المقطعي بالبوزيترون/التصوير المقطعي (فدج و PET/CT) فلوروديوكسيجلوكوسي و28. يستخدم المرجع ركائز الفلورسنت أو طرحه مخصصة التي تنتج من8،منتج نيون29عند الانقسام قبل إنزيم البكتيري،. ومن ثم فإنها ميزة لا تتطلب من سلالة مراسل المتفطرات المؤتلف30،31. تتألف الركيزة الحنق ووصف فلوروتشرومي وتقضي متصلة بواسطة عصابة بيتا-لاكتام هو تحلل من BlaC (β-lactamase)، وبطبيعة الحال أعرب مؤثرا ب بكترياالسل-مجمع8، 32-البكتيريا مباشرة توليد إشارة نتيجة لنشاط الحفاز REF يسمح التضخيم العديد من أوامر من حجم وحساسية الكشف عن السل م.
REF الركازة المستخدمة في هذه الدراسة باختراق أنسجة ممتازة في الحيوانات الحية وخفضت الخلفية نظراً لأن الطول الموجي الطويل. مع هذه الركيزة الطول الموجي الطويل فمن الممكن لتحقيق الحد الأدنى للكشف عن السل م لما يقرب من 100 مستعمرة تشكيل وحدات (زيمبابوي) في المختبر و < 1000 زيمبابوي في رئات الفئران في فيفو (الحيوان كله)8، 33. المرجع يمكن استخدامها كأداة تشخيصية للبلغم، المواد السريرية ومباشرة حتى في المرضى الذين يعانون من نظم المنظار الصغير16،32،33،34 الواجبة لها حساسية عالية وخصوصية. المرجع يمكن تطبيقها على أي سلالة السريرية السل، لأنه يستخدم إنزيم جرثومي منتجة بطبيعة الحال، BlaC، للكشف عن هذا في جميع سلالات. هذه الخصائص تجعل REF التصوير أداة قيمة في البحوث السريرية قبل السل بشكل عام لتسهيل العلاج وتقييم اللقاحات، فضلا عن تحليل للآلية المرضية، ولكن يمكن تطبيقها أيضا في نهاية المطاف على تشخيص السل المرضى.
Protocol
وأجريت الدراسات الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية والقواعد المنصوص عليها برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة لتكساس A & M جامعة. قد يلزم استعراضها والموافقة عليها من موظف سلامة واقية أو اللجنة في المؤسسة الخاصة بك.
تنبيه: جميع الإجراءات التي تتطلب الاحتواء BSL3. الموظفين مطالبون بارتداء معدات الوقاية الشخصية في جميع الأوقات. جميع المعالجات تتم داخل "مجلس الوزراء" السلامة الأحيائية (BSC) ويتم التخلص منها جميع الأدوات الحادة في حاويات الأدوات الحادة. يتم تنظيف أسطح العمل وبكالوريوس مع الإيثانول مخزنة الفينول و 70% قبل بدء العمل وبعد العمل. الإجراءات سوف يتم عادة على مستوى السلامة الحيوية 3 مع بكتريا السل، ولكن لأغراض التصوير والرسم التوضيحي، الكتاب إثبات هذه الإجراءات على مستوى السلامة الأحيائية 2 مع البكتيريا أقل ضراوة.
1-سلالات والثقافة الشروط
ملاحظة: يستخدم سلالة السل م. CDC1551 في هذه الدراسة، ولكن يمكن استخدام أي سلالة السل م بنفس الطريقة.
- تنمو البكتيريا في M-أوادك-TW (7 ح 9 مرق تكملها والغليسيرول 0.5% وحمض الأولييك 10% سكر العنب المعقدة دون كاتالاز 0.05 توين 80%) مكانة متوسطة في 37 درجة مئوية ل التطوير التنظيمي600 من 0.5 (~ 0.2 × 107 زيمبابوي).
- تمييع الثقافة في M-أوادك-TW (سلسلة من 01:10 تخفيف البكتيريا). لوحة تخفيف البكتيريا (105، 106، 107، 108) في ثلاث نسخ على انتقائية لوحات 11 ح 7 للسماح للبت في زيمبابوي.
- احتضان اللوحات لمدة أربعة أسابيع في 37 درجة مئوية أو حتى يمكن أن تحسب بدقة في المستعمرات.
- الطرد المركزي العدوى البكتيرية في 8,534 س ز لمدة 5 دقائق للحصول على بيليه. أغسل بيليه مرة واحدة مع 10 مل من المحلول الملحي (0.9% كلوريد الصوديوم) وإعادة تعليق بيليه في 15 مل من المحلول الملحي (0.9% كلوريد الصوديوم).
2-الأيروسول العدوى من الفئران باستخدام الدائرة ماديسون
- السماح للفئران إلى تأقلم إلى محيط جديد لمدة أسبوع.
- وزن الفئران قبل تحميلها إلى الدائرة.
- قم بتوصيل الأسلاك الثلاثة قطاع الطاقة: طاقة الدائرة الرئيسية ومضخة فراغ ضاغط هواء، بهذا الترتيب.
- فك الجرة الزجاجية بعناية. جرة زجاج للسلامة الأحيائية مجلس الوزراء وإضافة العدوى التحدي الذي أوقف في 15 مل من المحلول الملحي (0.9% كلوريد الصوديوم) لتحقيق ~ 104 -106 زيمبابوي بكتيريا في الرئتين.
- أغلق غطاء الجرة الزجاجية في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء. إرفاق الجرة إلى وحدة البخاخات وضبط أنابيب الفولاذ المقاوم للصدأ الرأسي حيث يكون النهاية (كمية) أقل بحوالي ربع بوصة تحت مستوى السائل في الجرة.
- تحميل جميع الحيوانات اللازمة للتجربة (قاعة تتسع الفئران تصل إلى 90) إلى الدائرة، وإغلاق جميع المزالج الباب.
- الاختيار الرئيسي (الغرفة) مقياس تدفق الهواء. تأكد من تشغيل المركز للتعويم (الكرة) حوالي 50 لتر في الدقيقة كما تقاس بمقياس على اليسار.
- اضغط الزر ابدأ على لوحة التحكم للغرفة. تعيين معدل تدفق الهواء من خلال مقياس تدفق الهواء الضاغط (متر أصغر في اليسار) ك 4 لتر في الدقيقة بالمقياس. التحقق بصريا لضمان أن العدوى التحدي هو يجري المرذوذ.
- بعد 15 دقيقة، عندما يظهر الضوء الأحمر على الجزء الأمامي لوحة التحكم وإشارة مسموعة يشير إلى نهاية الشوط، اضغط زر إعادة الضبط في الزاوية اليمنى السفلي من لوحة التحكم لإعادة تعيين عدادات الوقت.
- اضغط باستمرار على الزر الأحمر الصغير على باب الدائرة للإفراج عن الفراغ.
- فتح باب الغرفة وإزالة الحيوانات. وضع الفئران في اقفاصها.
- إزالة جرة البخاخات الزجاج ووضعه في حاوية نقل مختومة، مانعة للتسرب. وضع الحاويات داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية وتجاهل تعليق التحدي في حاوية نفايات معينة.
- ضع الجرة البخاخات المستخدمة داخل حقيبة واقية وختم الحقيبة للنقل اﻷوتوكﻻف.
- في نهاية الإجراء العدوى، الرش داخل الدائرة مع الإيثانول الفينول و 70% مخزنة والسماح غرفة الجلوس لمدة 10 دقائق.
- ثم مسح أسفل جميع الأسطح الداخلية موجوداً دقيق جداً. التخلص من جميع من المناشف الورقية الملوثة، إلخ. في سلة المهملات واقية. حاوية النفايات اﻷوتوكﻻف سلة المهملات، وتستخدم عبوات البخاخات.
- ضع الحيوانات مرة أخرى في غرفة الاحتواء حتى الوقت التصوير-النقطة.
- في يوم التصوير، نقل الحيوانات في حاوية ثانوية إلى غرفة التصوير.
3-الحيوان التخدير
- تخدير الفئران مع إيسوفلوراني باستخدام نظام غاز مخصص لتخدير.
- تزن كل منهما من اسطوانة تصفية الفحم اثنين تقع على رأس وحدة التخدير.
- استبدال مع اسطوانة جديدة إذا كان الوزن 50 جرام أعلاه الوزن الأولى.
- تحقق من وحدة المبخر لضمان isoflurane كافية لهذا الإجراء.
- وضع حامل مخروط الآنف داخل قاعة التصوير. وضع عدد المخروطات مطلوب لهذا الإجراء وإغلاق الفتحات المتبقية مع محصرات مخروط الآنف.
- بدوره على إمدادات الأوكسجين من اسطوانات الضغط العالي ووضعه في 55 رطل/بوصة مربعة.
- قم بتشغيل المضخة الإجلاء يقع أمام وحدة التخدير وتعيينها إلى 8 لتر في الدقيقة.
- تشغيل تبديل الأكسجين الموجود أمام وحدة التخدير.
- بدوره على تدفق الغاز إلى دائرة التخدير التعريفي لضبط تدفق الغاز في 1.5 لتر/دقيقة بدوره تدفق الغاز.
- بدوره على تدفق الغاز إلى دائرة التصوير لضبط تدفق الغاز في 0.25 لتر/دقيقة بدوره تدفق الغاز.
- قم بتشغيل المرذاذ isoflurane ووضعه في 2 2.5 في المائة. قم بضبط مستوى isoflurane وفقا لعدد ووزن الحيوانات المستخدمة للتجربة عن طريق تناوب الاتصال الهاتفي في المبخر isoflurane (2-2.5 في المائة لماوس وزنها ز ~ 20؛ 4% خنزير غينيا وزنها 300 غرام).
- وضع الفئران في غرفة التخدير وأغلق الغطاء. بدوره على تدفق الغاز إلى الدائرة تحريض التخدير.
- ترك الفئران في قاعة تحريض التخدير لمدة 5-10 دقائق حتى تخديره كلياً.
- حالما يتم تخديره من الفئران، تطبيق مرهم ضوئية إلى العيون لحمايتهم أثناء التصوير.
- أن يتم وضع أنوفهم في مخروط الآنف لتسهيل تخدير الفئران أثناء إجراء التصوير بوضع الفئران في ريكومبينسي البطني أو القصية.
4-مراسل إنزيم الفلورية (REF) تصوير
- حقن الركيزة (20 ميكرومتر، 2.5 ميليلتر/غرام من الوزن) بالحقن داخل إلى المصابين، فضلا عن مكافحة الفئران. الفئران تحت التخدير داخل غرفة التصوير أقل من 1 دقيقة.
- بدء تشغيل نظام التصوير.
- تهيئة النظام بالنقر فوق تهيئة. انتظر حتى شريط درجة الحرارة يتحول إلى اللون الأخضر.
ملاحظة: تتكون غرفة التصوير من منصة ساخنة للحفاظ على درجة حرارة جسم الحيوان أثناء التصوير. - للتصوير اقتناء الإعداد، حدد الفلورسنت | ترانس-الإضاءة للحيوان كله أو برنامج التحصين الموسع-الإضاءة لانسجة الرئة، هيكل وتراكب في "اقتناء لوحة التحكم".
- تعيين مجال الرؤية إلى ب ماوس واحدة ومستوى مصباح إلى عالية.
- تعيين وقت التعرض للسيارات، binning المتوسط، 2-3 و/إيقاف، وتصفية الإثارة في 745 مرشحات شمال البحر الأبيض المتوسط، والانبعاثات من 780 نانومتر إلى 840 شمال البحر الأبيض المتوسط.
- لتسلسل الإعداد، انقر فوق "تسلسل الإعداد"، حدد نقاط الإضاءة العابرة 9-12 في منطقة الرئة.
- انقر فوق الحصول على للحصول على الصور.
- ضع الماوس مرة أخرى إلى القفص بعد انتهاء التصوير.
- مراقبة الفئران حتى تعافي تماما أو التضحية من أجل التحديد الكمي لزيمبابوى إذا كان التصوير في وقت نقطة من التجربة. تنفيذ نقاط كارنوفسكي معدلة لرصد رفاه الفئران بعد انتهاء التصوير.
5-تحليل REF التصوير
- فتح برامج التصوير.
- تحميل ملفات الصور عن طريق النقر فوق الرمز استعراض.
- اتقانا الطيفية، انقر فوق "الطيفية اتقانا" في لوحة أداة ثم انقر فوق أطياف المطلوب إلى أونميكس. انقر فوق ابدأ اتقانا.
- لإعادة الإعمار السطح البصري، انقر فوق "تضاريس السطح".
- حدد التوجه إلى الظهرية، رهنا بالفراء الماوس، ثم انقر فوق إنشاء سطح.
- رسم صورة المحاصيل وتعيين الصورة عتبة لمنطقة الاهتمام. انقر فوق تم.
- جهاز التسجيل، انتقل إلى علامة التبويب تسجيل في القائمة المنسدلة "أدوات بصرية" ثلاثية الأبعاد.
- تسجيل الأجهزة للفائدة في أطلس جهاز.
- قم بضبط حجم الجهاز أو الموقع للتضاريس السطحية التي تم إنشاؤها باستخدام أداة التحويل تشغيل/إيقاف تشغيل الموقع على أدوات لوحة التسجيل.
- انتقل إلى التصوير المقطعي الفلورسنت التعمير 3D (فليت)، وحدد تحليل التبويب تحديد الصور إدراجها للتحليل، ونوع لكفاءة Fluorescence انتقال تطبيع (نتف) الصورة، انقر فوق ابدأ.
- تحقق من تحديد كافة وإعادة إعمار في علامة التبويب "معاينة البيانات".
- للتحديد الكمي الأسفار، انتقل إلى أدوات المنطقة من الفائدة (العائد على الاستثمار)، وتضاف مكعبات عائد الاستثمار إلى الجهاز للفائدة وضبط حجم المكعب لتغطية الجهاز للفائدة. انقر فوق قياس رويس 3D.
- في إطار قياس العائد على الاستثمار، انتقل إلى قياسات دوروا ثلاثية الأبعاد، حدد نوع البيانات لوحدة المصدر فوكسيلس والقياسات إلى بمولم-1سم-1.
- حفظ و/أو التصدير نتيجة لتحليل التعمير 3D فليت في ملف الشكل أو البيانات.
6-التحديد الكمي للبكتيريا بزيمبابوى
- Euthanize الفئران بالحقن داخل 0.1 مل بينتوباربيتال الصوديوم (390 ملغ/مل).
- تحقق منعكس دواسة بالضغط على منصات القدمين الفئران للتأكد من وجود أي رد فعل منعكس.
- اكسبلانت أنسجة الرئة من الفئران باستخدام الملقط العقيمة والمقص. مجانسة أنسجة الرئة في 1 مل 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS).
- جعل الوقت تخفيف المسلسل من هوموجيناتي الرئة في برنامج تلفزيوني x 1 العقيمة.
- للطلاء، بقعة مختبرين ثلاثة من 20 ميليلتر من كل من تخفيف تركيز كل منها على لوحة أجار.
- احتضان اللوحات في حاضنة في 37 درجة مئوية، ورصد النمو الجرثومي.
- عدد المستعمرات في كل بقعة بعد فترة الحضانة، وأعرب كزيمبابوي/مل بتصحيح لوحدة التخزين والتخفيف باستخدام المعادلة التالية:
زيمبابوي/مل = (C/V) س م
حيث ج = مستعمرة تهم كل بقعة، V = حجم العينة تلقيح في كل لوحة (mL) و M = عامل الضرب (المعاملة بالمثل لتمييع المستخدمة).
ملاحظة: إذا كان يتم عد المستعمرات 11 في بقعة واحدة لحجم عينة مل 0.002 في إضعاف عينة من 10-4، باستخدام المعادلة، العد مستعمرة الاحتساب
(11/0.02) x 104 = 5.5 × 106 زيمبابوي/مل
Representative Results
REF تصوير فئران المصابين السل م جنبا إلى جنب مع الماوس التحكم مصابة تظهر في الشكل 1ألف. تنتجها الفئران المصابة كثير (ف = 0.0057) إشارة fluorescence أعلى من الرئتين في 6 أسابيع بعد الإصابة مقارنة بالسيطرة على إدارة الركازة. يمكن أن يكون التصوير بالطبع وقت نموذجي لدراسة فعالية العلاج ضد السل م استخدام REF في الأسبوع 1، 2، 4، 6، 15، 24 بعد الإصابة. كثافة الأسفار هو كمياً باستخدام برنامج التحصين الموسع-الإضاءة لانسجة الرئة (الشكل 1ب). إشارة استمرار تزايد من الأسبوع الثاني إلى الأسبوع السادس في رئات الفئران المصابة يوحي بأن المرجع بنجاح قادراً على الكشف عن السل م في الحية. قطره في إشارة أساسية لمكافحة الفئران في وقت لاحق نقطة (الشكل 1ب) يمكن أن يعزى إلى الزيادة في هيئة كتلة وحجم الفئران على مدى فترة 6 أسابيع مما يقلل من اختراق الطول الموجي الإثارة. 3D التعمير فليت مصادر الأسفار في الفئران المصابة السل م ممثلة في الشكل 2أ. يتم الحصول على تسلسل الصور في عدة نقاط الإضاءة العابرة في الماوس باستخدام نفس الإثارة وسلسلة من عوامل الانبعاثات. ثم يتم استخدام تسلسل الصور هذه للتعمير فليت 3D لمصدر الفلورسنت التوزيع داخل موضوع الحيوانات. الشكل 2 د يوضح اتجاهات مختلفة (coronal، السهمي وترانساكسيال) للتصوير المقطعي الماوس مع تسجيل الجهاز الرئة. الكفاءة نتف خرائط للتحقق من جودة التعمير تتمثل في الشكل 2ه. نتف يسمح طرح تسرب الضوء الخلفية من الصور عبر الإضاءة من خلال صورة إضافية التقاطها مع مرشح الكثافة محايدة. الصورة التي اتخذت مع عامل التصفية الإثارة محددة (الشكل 2قياس ه) هو تطبيع لنقل الصورة قياس الانبعاثات عامل التصفية نفسه وعامل تصفية إثارة مفتوحة (الشكل 2ه-محاكاة) لإعطاء الإشارات التي تنتجها الركيزة وحدها. تقاس مماثلة ومحاكاة نتف الكفاءة الشخصية في كلا الأفقية (الشكل 2و) والعمودي (الشكل 2ز) لمحات مع خطأ النسبة المئوية 0% تقريبا (الشكل 2خطأ ه-%) يقدم دليلاً التعمير 3D ذات نوعية جيدة مع انخفاض التحف والتعريب إشارة محسنة وحساسية.
الشكل 1 . التصوير من السل م مع الرقم (أ) في فيفو تصوير من الفئران وقاية والمصابين السل م في 2 و 4 و 6 أسابيع بعد الإصابة. شريط اللون يمثل كثافة إشارة مضيئة في الفوتونات في الثانية الواحدة سم2 من منخفضة (أصفر) عالية (أحمر). (ب) التحديد الكمي لشدة الأسفار من الفئران المصابين السل م. Fluorescence قيم لكل عنصر تحكم (أسود) وهي الممثلة المصابة (أحمر) جنبا إلى جنب مع الخطأ المعياري لكل نقطة في الوقت. أهمية نتائج مصممة من الطلاب تي-اختبار، قيم p < 0.05 اعتبرت هامة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 -3D التعمير فليت مصادر الأسفار في الفئران المصابة السل م. التصوير المقطعي بالماوس ممثلة في اتجاهات مختلفة؛ A) coronal، ب) السهمي، وجيم) ترانساكسيال مع تسجيل الجهاز د) الرئة. يتم تمثيل منطقة 3D للفائدة (ROI) كمكعب أحمر في الرئة للقياسات المصدر. (ﻫ (نتف كفاءة خرائط المقاسة ومحاكاة للتحقق من جودة التعمير. تمت مقارنة نتف الكفاءة الشخصية المقاسة والمحاكاة، توفير نوعية جيدة من التعمير 3D (مماثلة المقاسة ومحاكاة كفاءة نتف). إشارة عمودي أفقي و) وز) الملامح تمثل قياس (أزرق) ومحاكاة منحنى الكفاءة نتف (أحمر). أشرطة حمراء الأفقية والرأسية تشير إلى موضع المصدر. شريط اللون يمثل كثافة إشارة مضيئة في الفوتونات في الثانية الواحدة سم2 من منخفضة (أزرق) للسامية (أحمر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
عند استخدام تقنيات التصوير، مثل REF، هناك الاستراتيجيات الرئيسية التي تسمح لتوليد بيانات قوية ومتسقة. تصوير بصري تنتج ضوء متناثرة في الأنسجة والتي يمكن أن تؤثر بعمق الاختراق، نظراً لأنه من الصعب على التقاط الضوء المنبعث في جميع الاتجاهات. استخدام من فلوروفوري الأشعة تحت الحمراء القريب (الجرد) الركيزة للمرجع التصوير بعد الطول موجي الإثارة والانبعاثات في كورانجي من 700-900 نانومتر تسهل امتصاص الحد الأدنى من إشارة الفلورسنت من أنسجة الثدييات. شيد الركيزة تصميم مخصص بواسطة ربط نير فلوروفوري، 800Cw إيرديي تقضي، مراقبة الجودة إيرديي-1، بعصابة لاكتام السماح fluorescence الرنين الطاقة على أساس نقل تبريد. إيرديي اختراق الأنسجة ممتازة وخفيفة تناثر الخصائص وليس لديه أي تأثيرات ضارة واضحة على الثدييات36، يجري تطهيرها من الدم والأجهزة من 24 h. Fluorescence إشارة إلى حد كبير الزيادات ابتداء من 4 ح بعد الوصول إلى الأعلى مستويات الإدارة الركيزة، ح 6 بعد الإدارة.
ينبغي أن تكون موحدة الجرعة المعدية البكتيرية، ووضع الإدارة للجرعة المعدية والركيزة، فضلا عن النقاط الزمنية للتصوير بعد الإصابة عن طريق إجراء دراسات تجريبية قبل الشروع في تجارب كبيرة ومعقدة،. الدراسات التجريبية يمكن أن يقلل كثيرا من الوقت والتكلفة عند تصوير عدد كبير من الحيوانات لأنه يمكن أن يكون الأمثل إجراء موحد قبل القيام بالتجربة الرئيسية. وينبغي تحديد الأحمال البكتيرية في الأجهزة/الأنسجة للفائدة بعد تصوير الجسم بأكمله باستخدام الإضاءة العابرة و السابقين فيفو تصوير الرئة باستخدام برنامج التحصين الموسع-الإضاءة للتحقق من صحة مصدر الإشارات وتحديد نوعية العلاقة مع أرقام البكتيرية الحالية8. الدراسات التجريبية سوف توفر نظرة ثاقبة على عتبة الكشف، والنطاق الديناميكي للتقنية وكذلك تحديد شروط تجريبية الأمثل للتصوير.
المزايا الأساسية لاستخدام REF التصوير كمقارنة بغيرها من الاستراتيجيات الفلورسنت وطرحه هي حساسية عالية وقدرة على الصورة الطبيعية السل م. السلالات. REF التصوير يستخدم إنزيم قوية حفازة BlaC التي يتم المحافظة عليها في جميع يعزل السريرية السل م وسلالات السل-مجمع. قدر كبير من الحساسية للمرجع التصوير بسبب المعدل السريع الحفاز ل BlaC في تركيبة مع الاحتفاظ بالمنتج الفلورسنت ملصوق بالخلية المضيفة. إشارة باستمرار الزيادات طالما يتوفر الركيزة أسفر عن تراكم تقريبا لا حدود لها من إشارة داخل الأنسجة والخلايا المصابة. هذا زيادة الحساسية للمرجع التصوير مقارنة بالنهج البديلة للتصوير يتيح الكشف عن محددة السل م على حد سواء في المختبر و في فيفو8،،من2324، 29.
يمكن استخدام REF التصوير للكشف عن البكتيريا دون التعديلات الوراثية التي يمكن تطبيقها مباشرة على أي نموذج العدوى، أما مختبر الحيوانات8،37 أو المواد السريرية البشرية29،38 . يمكن استخدام REF لكشف والصور بين مجموعة واسعة من العوامل الممرضة39،40، حيث يمكن وضع ركائز فلوروجينيك للعديد من أهداف الانزيمية خلاف BlaC مثل البروتياز، مؤنزم، أورياسيس، وبيتا-جالاكتوسيداسيس. ومع ذلك، دقيق ينبغي التفكير بالهدف من أجل ضمان يعرض الخصائص المثلى للتصوير. يمثل BlaC إنزيم نموذجا جيدا للخصائص التي سيتم التأكد من التطبيق الناجح لهذه الاستراتيجية. REF التصوير يوفر قراءة مباشرة على الحمولة البكتيرية الموجودة في الرئتين خلال العدوى، الذي إلى حد كبير بسرعة التقدم في دراسة أمراض السل، منذ تحديد أرقام الجرثومي يتطلب عادة ثلاثة إلى ستة أسابيع، ولكن حتى في أكثر الكائنات الحية النمو السريع هذا النهج سيوفر قدرا كبيرا من الوقت. يمكن أيضا استخدام REF تميز الأورام السرطانية من السل، مشكلة أساسية في تشخيص آفات عقيدية في المرضى41،42. المرجع بمثابة أداة جديدة للتعجيل بتصوير السل متعدية الجنسيات وحتى يمكن تطبيقها على البشر، ويحتمل أن تكون مما يتيح سرعة التنبؤ بالنتائج العلاجية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | VETONE | 501027 | |
| CNIR800 | Custom synthesized | ||
| Fatal Plus solution | Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd | ||
| 7H9 Middlebrook broth | BD | 271310 | |
| OADC Middlebrook enrichment | BD | 212351 | |
| Sporcidin | RE-1284F | ||
| 7H11 Middlebrook Agar | BD | 212203 | |
| Madison Chamber | |||
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | |
| XGI-8-gas Anesthesia System | Perkin Elmer | ||
| Living Imaging software | Perkin Elmer | ||
| Transparent nose cones | Perkin Elmer | ||
| M. tuberculosis strain CDC1551 | ATCC | ||
| Female BALB/C mice, 5-7 weeks | Jackson Laboratory |
References
- Lewinson, D. M., et al. Official American thoracic society/infectious diseases society of America/ centers for disease control and prevention clinical practice guidelines: diagnosis of tuberculosis in adults and children. Clin Infect Dis. 64 (2), 1-33 (2017).
- Lee, J., et al. Sensititre MYCOTB MIC plate for testing Mycobacterium tuberculosis susceptibility to first- and second-line drugs. Antimicrob Agents Ch. 58 (1), 11-18 (2014).
- Dheda, K., et al. The epidemiology, pathogenesis, transmission, diagnosis, and management of multidrug-resistant, extensively drug-resistant, and incurable tuberculosis. Lancet Resp Med. 5 (4), 291-360 (2017).
- Behr, M. A., et al. Transmission of Mycobacterium tuberculosis from patients smear-negative for acid-fast bacilli. Lancet. 353 (9151), 444-449 (1999).
- Cruz, A. T., Revell, P. A., Starke, J. R. Gastric aspirate yield for children with suspected pulmonary tuberculosis. J Pediatric Infect Dis Soc. 2 (2), 171-174 (2013).
- Monkongdee, P., et al. Yield of acid-fast smear and mycobacterial culture for tuberculosis diagnosis in people with human immunodeficiency virus. Am J Resp Crit Care. 180, 903-908 (2009).
- Karstaedt, A. S., Jones, N., Crewe-Brown, H. H. The bacteriology of pulmonary tuberculosis in a population with high human immunodeficiency virus seroprevalence. Int J Tuberc Lung D. 2 (4), 312-316 (1998).
- Yang, H. J., et al. Real-time imaging of Mycobacterium tuberculosis, using a novel near-infrared fluorescent substrate. J Infect Dis. 215 (3), 405-414 (2017).
- Nooshabadi, F., et al. Intravital excitation increases detection sensivity for pulmonary tuberculosis by whole-body imaging with β-lactamase reporter enzyme fluorescence. J Biophotonics. , (2016).
- Chang, M. H., Cirillo, S. L. G., Cirillo, J. D. Using luciferase to image bacterial infections in mice. J Vis Exp. (48), (2011).
- Kong, Y., Subbian, S., Cirillo, S. L. G., Cirillo, J. D. Application of optical imaging to study of extrapulmonary spread by tuberculosis. Tuberculosis. 89 (1), 15-17 (2009).
- Andreu, N., et al. Rapid in vivo assessment of drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis using an improved firefly luciferase. J Antimicrob Chemoth. 68 (9), 2118-2127 (2013).
- Andreu, N., et al. Optimisation of bioluminescent reporters for use with Mycobacteria. PLoS ONE. 5 (5), 10777 (2010).
- Nooshabadi, F., Yang, H. Y., Bixler, J. N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Maitland, K. C. Intravital fluorescence excitation in whole-animal optical imaging. PLoS ONE. 11 (2), 0149932 (2016).
- Bixler, J. N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Matiland, K. C. Multi-scale fluorescence imaging of bacterial infections in animal models. Proc. SPIE 8565, Photonic Therapeut Diagnos IX. , 856537 (2013).
- Mufti, N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Maitland, K. C. Detection of bacterial infection with a fiber optic microendoscope. Proc. SPIE 8092, Med Laser Appl Laser-tissue Interac V. , 80920A (2011).
- Zelmer, A., et al. A new in vivo model to test anti-tuberculosis drugs using fluorescence imaging. J Antimicrob Chemoth. 67 (8), 1948-1960 (2012).
- Yang, D., Ding, F., Mitachi, K., Kurosu, M., Lee, R. E., Kong, Y. A fluorescent probe for detecting Mycobacterium tuberculosis and identifying genes critical for cell entry. Front. Microbiol. 7, (2016).
- Ordonez, A. A., et al. Mouse Model of pulmonary cavitary tuberculosis and expression of matrix metalloproteinase-9. Dis Model Mech. 9, 778-779 (2016).
- Mills, B., Bradley, M., Dhaliwal, K. Optical imaging of bacterial infections. Clin Transl Imaging. 4, 163-174 (2016).
- Calderon, V., Valbuena, G., Goez, Y., Endlsey, J. J. A humanized mouse model of tuberculosis. PLoS ONE. 8 (5), 63331 (2013).
- Vergne, I., Chua, J., Lee, H. H., Lucas, M., Belisle, J., Deretic, V. Mechanism of phagolysosome biogenesis block by viable Mycobacterium tuberculosis. P Natl Acad Sci Usa. 102 (11), 4033-4038 (2004).
- Kong, Y., et al. Imaging tuberculosis with endogenous β- lactamase reporter enzyme fluorescent in live mice. P Natl Acad Sci Usa. 107 (27), 12239-12244 (2010).
- Kong, Y., Cirillo, J. D. Reporter enzyme fluorescence (REF) imaging and quantification of tuberculosis in live animals. Virulence. 1 (6), 558-622 (2010).
- Skoura, E., ZumLa, A., Bomanji, J. Imaging in tuberculosis. Int J Infect Dis. 32, 87-93 (2015).
- Lee, K. S., Im, J. G. CT in adults with tuberculosis of the chest: characteristic findings and role in management. Am J Roentgenol. 164, 1361-1367 (1995).
- Hoffman, E. B., Crosier, J. H., Cremin, B. J. Imaging in children with spinal tuberculosis. A comparison of radiography, computed tomography and magnetic resonance imaging. J Bone Joint Surg Br. 75 (2), 233-239 (1993).
- Soussan, M., et al. Patterns of pulmonary tuberculosis on FDG-PET/CT. Eur J Radiol. 81 (10), 2872-2876 (2012).
- Sule, P., et al. New directions using reporter enzyme fluorescence (REF) as a tuberculosis diagnostic platform. Tuberculosis. 101, 78-82 (2016).
- Heuts, F., Carow, B., Wigzell, H., Rottenberg, M. E. Use of non-invasive bioluminescent imaging to assess mycobacterial dissemination in mice, treatment with bactericidal drugs and protective immunity. Microbes Infect. 11 (14-15), 1114-1121 (2009).
- Kong, Y., et al. Application of fluorescent protein expressing strains to evaluation of anti-tuberculosis therapeutic efficacy in vitro and in vivo. PLoS ONE. 11 (3), 0149972 (2016).
- Xie, H., et al. Rapid point-of-care detection of the tuberculosis pathogen using a BlaC-specific fluorogenic probe. Nature Chem. 4, 802-809 (2012).
- Nooshabadi, F., et al. Whole-animal imaging of bacterial infection using endoscopic excitation of β-lactamase (BlaC)- specific fluorogenic probe. Proc SPIE. 9715, 97150 (2016).
- Ghiasi, M., Pande, T., Pai, M. Advances in tuberculosis diagnostics. Curr Trop Med Rep. 2 (2), 54-61 (2015).
- Rao, J., Andrasi, A. D., Yao, H. Fluorescence imaging in vivo: recent advances. Curr Opin Biotech. 18 (1), 17-25 (2007).
- Marshall, M. V., Draney, D., Sevick-Muraca, E. M., Olive, D. M. Single-dose intravenous toxicity study of IRDye 800CW in Sprague-Dawley rats. Mol Imaging Biol. 12 (6), 583-594 (2010).
- Zhan, L., Tang, J., Sun, M., Qin, C. Animal models for tuberculosis in translational and precision medicine. Front Microbiol. 8, 717 (2017).
- 2,7-disubstituted cephalosporin derivatives as beta-lactamase substrates and methods for their use for the diagnosis of tuberculosis. US patent. Rao, J., Xie, H., Cheng, Y., Cirillo, J. D. , 20150219653 A1 (2015).
- Shao, Q., Zheng, Y., Dong, X., Tang, K., Yan, X., Xing, B. A Covalent Reporter of β-Lactamase Activity for Fluorescent Imaging and Rapid Screening of Antibiotic-Resistant Bacteria. Chem Eur J. 19 (33), 10903-10910 (2013).
- Li, L., Li, Z., Shi, W., Li, X., Ma, H. Sensitive and Selective Near-Infrared Fluorescent Off-On Probe and Its Application to Imaging Different Levels of β-Lactamase in Staphylococcus aureus. Anal Chem. 86 (12), 6115-6120 (2014).
- Ashizawa, K., et al. Coexistence of lung cancer and tuberculoma in the same lesion: demonstration by high resolution and contrast-enhanced dynamic CT. BRIT J RADIOL. 77 (923), 959-962 (2004).
- Figueroa, C. J., Riedel, E., Glickman, M. S. Clinical and radiographic differentiation of lung nodules caused by mycobacteria and lung cancer: a case-control study. BMC Infect Dis. 15 (482), (2015).
