Summary
マイコバクテリウムの結核(結核) レポーター酵素蛍光 (REF) 感染マウスの光イメージングについて述べる。このプロトコルは、病因、治療薬やワクチンの研究前臨床動物モデルで結核の特異的かつ高感度検出を容易します。
Abstract
レポーター酵素蛍光 (REF) は、酵素、イメージングや蛍光または発光による検出興味のターゲット有機体の存在のために特定、基板を採用しています。BlaC, すべての結核菌によって恒常発現酵素を利用します。REF では、感染マウスの肺での細菌の迅速な定量をことができます。マウスの同じグループのイメージを作成、大幅コスト削減より迅速に細菌を列挙する、宿主-病原体相互作用の新しい観察をできるように、グループごとのより多くの動物が容易に維持されますので、統計的検出力を増やす多くの時点で.REF は、非常にカスタム蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET) または使用される蛍光基板による特異的かつ高感度 BlaC 酵素記者の触媒の性質のためです。REF には、組換え系統を必要はありません通常宿主-病原体相互作用を確保します。800 で最大放出でフレット基板を用いた結核感染症のイメージングについて述べる nm。基板の波長は、哺乳類の敏感な深部組織イメージングをことができます。我々 は、結核マウスの麻酔、REF 基板と光イメージングの投与マウスのエアロゾル感染を概説します。このメソッドは、正常にホスト病原体の相互作用および結核を対象と抗生物質の有効性の評価に適用されています。
Introduction
結核の低成長率は、結核1,2,3の迅速診断の主要な障害です。文化に基づいて結果を生成する診断は数週間、抗酸菌の塗抹標本は子供5およびひと免疫不全ウイルス6、7の同時感染患者の診断限界4 。光学イメージング技術は、最近結核8,9の伝統的な診断法に代わるものとして認識されています。蛍光と発光リアルタイム10、11,12,13,14、生きている動物の結核の光学イメージを使用できます。 15,16,17,18,19。光イメージング結核20,21,22による感染症の迅速かつ特定評価の利点があります。
結核のライブ REF を使用してマウスに光イメージングの詳細をまとめました。このメソッドは非常に特定および敏感な23,24他光学的な方法と同様、小さい結核 (TB) イメージング25、コンピューター断層撮影 (CT)26、磁気を含む他の方法よりも高価な共鳴イメージング (MRI)27日、F f-フルオロデオキシグル コース ポジトロン断層法/CT (F-FDG PET/CT)28。REF は、細菌の酵素によって胸の谷間に蛍光製品8,29を生成するカスタムの蛍光または発光基板を採用しています。したがって、遺伝子組換え抗酸菌記者ひずみ30,31を必要としないという利点があります。記載されているフレット基板は、螢光色素と BlaC (β-ラクタマーゼ)、自然発現を複雑で結核菌8,によって示した、加水分解は β ラクタム リングによって接続クェンチャー成る32. 細菌が直接多くの桁違いと結核の高感度検出による増幅を可能にする REF の触媒活性により信号を生成します。
本研究で使用される REF 基板は、優れた組織は、生きている動物と波長が長いためバック グラウンドを低減します。この長い波長の基板とそれはほぼ 100 の結核の検出のしきい値を達成するために可能なコロニー形成単位 (CFU)の in vitroと < マウス生体内で(全体の動物) の8、肺で 1000 CFU 33。REF は、喀痰、臨床材料とも直接マイクロ内視鏡システム16,32,33,34高い感度と特異性のための患者、診断ツールとして使用できます。REF は、すべて株の存在検知の自然生成細菌の酵素、BlaC を使用しているために、任意の結核の臨床株に適用できます。これらの特性治療を容易にする前臨床結核研究に貴重なツールを一般的なイメージング REF ワクチン評価と病因の解析も最終的に結核の診断に適用することがありますが患者。
Protocol
ガイドラインと機関動物ケアおよび使用委員会のテキサス A & M 大学の定める規則に従って動物実験を行った。レビューとバイオハザード セーフティ ・ オフィサーまたは組織委員会からの承認は要求されるかもしれない。
注意: すべての手順には、BSL3 封じ込めが必要があります。担当者がすべての回で保護具を着用する必要です。すべての操作がバイオ セーフティ キャビネット (BSC) の中を実行し、すべてシャープ ディスポ針で破棄されます。仕事面と BSC はバッファー内のフェノールと 70% エタノールで洗浄する作業を開始する前に、仕事の後。手順は結核、バイオ セーフティ レベル 3 で通常行わだろうが、イラストや撮影目的は、明らかにより少なく劇毒性の細菌とバイオ セーフティ レベル 2 でこれらの手順。
1. 系統文化条件と
注: 本研究では, 結核ひずみ CDC1551 を使用が、結核緊張を同じ方法で使用できます。
- M OADC TW のバクテリア (7 H 9 0.5% グリセロール、10% オレイン酸ブドウ糖カタラーゼ活性のない複雑な 0.05 と補われるスープ % Tween 80) 0.5 の OD600 37 ° C で中堅 (〜 0.2 x 107 CFU)。
- M OADC TW で文化を希薄化 (シリーズ 1:10 の希釈液の細菌)。菌の希釈液をプレート (105106, 107108) CFU の決定を許可する選択式 7 H 11 ナンバー プレートに 3 通。
- 4 週間で 37 ° C または植民地を正確に数えることができるまでプレートを孵化させなさい。
- ペレットを取得する 5 分間 8,534 x g で菌を遠心します。生理食塩水 10 mL で一度餌を洗浄 (0.9 %nacl) 生理食塩水 15 mL にペレットを再停止し、(0.9 %nacl)。
2. マディソン商工会議所を用いたマウスのエアロゾル感染
- 1 週間の新しい環境に順応するまでマウスを許可します。
- 商工会議所にそれらをロードする前にマウスの重量を量る。
- 3 つのコードを電源タップに差し込みます: 主室電源、真空ポンプ、空気圧縮機、その順序で。
- ガラスの瓶を慎重に外します。バイオ セーフティ キャビネットにガラスの瓶を持参し、15 mL の生理食塩水の中に浮遊チャレンジ接種を追加 (0.9 %nacl) 達成するために 〜 104 - 106 CFU 肺の細菌。
- バイオ セーフティ キャビネットのガラスの瓶のふたを閉じます。ネブライザー ユニットに jar ファイルを添付し、瓶の中の液体のレベル以下のインチの四分の一について (摂取) 下端が垂直ステンレス チューブを調整します。
- 負荷に商工会議所 (商工会議所は 90 までマウスを保持できる) 実験に必要なすべての動物とドアをすべてのラッチを閉じます。
- メイン (ルーム) を確認してください空気流量計。フロート (球) の中心が約 50 L/分、左上のスケールを測定を実行されることを確認します。
- 商工会議所のコントロール パネルのスタート ボタンを押します。スケールの 4l/分として圧縮空気の流量計 (左の小さいメートル) によって風量を設定します。チャレンジ接種が噴霧されていることを視覚的に確認します。
- 15 分後コントロール パネルの前面に赤い光が表示され、可聴信号を示します実行の最後は、タイマーをリセットするのにはコントロール パネルの右下隅のリセット ボタンを押します。
- 真空を解放するための部屋のドアに小さな赤いボタンを押した。
- 部屋の扉を開き、動物を削除します。檻にマウスを配置します。
- ガラス ネブライザー jar を削除し、シール、防漏輸送コンテナーに配置します。生物学的安全キャビネット内のコンテナーを配置し、指定廃棄物コンテナーに挑戦の懸濁液を破棄します。
- バイオハザード袋の中に使用される噴霧器 jar を置き、オートクレーブへの輸送のための袋をシールします。
- 感染症プロシージャの終わりには、バッファー内のフェノールと 70% のエタノールで商工会議所の内部をスプレーし、おり、チャンバー内で 10 分間座っています。
- その後、非常に徹底的にすべてのアクセス可能な内部の表面を拭いてください。汚染したペーパー タオルなどは、すべて処分します。バイオハザードのゴミ。オートクレーブ、ゴミ箱コンテナーを無駄にしネブライザー瓶を使用します。
- イメージングの時点まで封じ込めの部屋に戻って動物を配置します。
- イメージングの日、イメージングの部屋にセカンダリ コンテナーで動物を転送します。
3. 動物の麻酔
- カスタマイズされたガス麻酔システムを用いたイソフルランとマウスを麻酔します。
- 麻酔ユニットの上部にある 2 つの活性炭フィルター キャニスターのそれぞれの重量を量る。
- 重量が 50 g の初期重量上の場合新しい容器と交換してください。
- ように手順について十分なイソフルラン気化器ユニットを確認します。
- イメージングのチャンバ内鼻の円錐形のホルダーを配置します。ノーズコーンの手順に必要な数を置き、鼻の円錐形のブロッカーと残りの開口部をシールします。
- 高圧シリンダーから酸素の供給をオンにし、55 psi でそれを設定します。
- 麻酔装置の前にある避難ポンプをオンにし、8 L/分に設定。
- 麻酔装置の前にある酸素トグルをオンに。
- ガスの流れに、1.5 L/分のターンでガスの流れを相殺する麻酔誘導室にガスの流れを入れます。
- 0.25 L/分ターンでガスの流れにガスの流れを相殺するイメージング室にガスの流れを入れます。
- イソフルラン気化器をオンにし、2 2.5% に設定します。数とイソフルラン気化器 (2-2.5% 〜 20 グラムの重量を量るマウス; 300 g の重量を量るモルモットのための 4%) のダイヤルを回転させることにより、実験のために使用されている動物の重量によるとイソフルラン レベルを調整します。
- 麻酔室にマウスを置き、ふたを閉じる。麻酔誘導室にガスの流れを入れます。
- 5-10 分まで完全に麻酔の麻酔誘導室でマウスを残します。
- マウスを麻酔後、イメージング中にそれらを保護するために目に光軟膏を適用します。
- などを画像処理中にマウスの麻酔を容易にする鼻の円錐形の彼らの鼻に配置、腹側または胸骨の臥床にマウスを配置します。
4. レポーター酵素蛍光 (REF)
- コントロール マウスと同様、感染への腹腔内注入による基板 (20 μ M、重量の 2.5 μ L/g) を挿入します。マウスが 1 分未満のイメージングのチャンバ内麻酔下です。
- イメージング システムを起動します。
- 初期化をクリックしてシステムを初期化します。温度のバーが緑に変わるまで待ちます。
注: イメージングの商工会議所は、イメージングしながら動物の体温を維持するために加熱されたプラットフォームで構成されています。 - 取り込み設定をイメージング用蛍光を選択 |全体の動物の肺組織、構造および獲得のコントロール パネルの [オーバーレイの落射透過照明。
- B に単一のマウスとランプを高レベルのビューのフィールドを設定します。
- 780 から自動、中ビン、2-3 f/ストップと 745 nm、発光フィルター励起フィルターの露光時間を設定 840 nm nm。
- シーケンス セットアップの順序の設定をクリックして、肺野領域に 9-12 トランス照明のポイントを選択します。
- 画像取得の取得をクリックします。
- イメージ作成後ケージに戻るには、マウスを置きます。
- 完全に回復するまでマウスを監視またはイメージング実験の時点で場合、CFU の定量化のために犠牲します。イメージング後マウスの福利を監視する変更された Karnofsky スコアを実行します。
5. REF イメージング解析
- イメージング ソフトウェアを開きます。
- [参照] アイコンをクリックして画像ファイルを読み込みます。
- スペクトル分離ツール パレットのスペクトル分離をクリックし、unmix に必要なスペクトルをクリックします。開始の分離をクリックします。
- 光の表面再構成のための表面の地形をクリックします。
- 背, マウスの毛皮の対象とする方向を選択し、生成画面をクリックします。
- 画像をトリミングし関心の領域の画像をしきい値を設定します。完了をクリックします。
- 器官登録、3 D 光学ツール ドロップ ダウン メニューで [登録] タブに移動します。
- オルガン アトラスに興味の器官を登録します。
- 臓器サイズやパネル登録ツールにあるオン/オフ変換ツールを使用して生成された表面地形に位置を調整します。
- (フリット) 三次元蛍光断層撮影に移動し、分析に含まれる、イメージの正規化透過蛍光 (NTF) 効率の種類を [スタート] を選択、画像を分析する] を選択。
- すべてを選択を確認し、[データのプレビュー] タブを再構築します。
- 蛍光定量、関心領域 (ROI) ツールに関心の器官に ROI キューブを追加し、目的の臓器をカバーする立方体のサイズを調整を参照してください。クリックして 3 D の Roi を測定します。
- ROI 測定ウィンドウで 3 D の ROI 測定に行く、pmolM-1cm-1にソース ボクセルと測定単位にデータ型を選択します。
- 保存および/またはフリット三次元構造解析の結果を図またはデータ ファイルにエクスポートします。
6 CFU による細菌の定量化
- 0.1 mL ペントバルビ タール ナトリウム (390 mg/mL) の腹腔内投与によるマウスを安楽死させます。
- ペダル反射反射反応がないことを確認するためにマウスの足のパッドを絞ることによって確認します。
- 滅菌ピンセットとはさみを使用してマウスから肺組織を外植体します。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 1 の 1 mL に肺組織をホモジナイズしてください。
- 滅菌 1x PBS で肺の 10 倍のシリアル希薄を作る。
- めっき、寒天プレート上のそれぞれの希釈 20 μ の 3 つの因数を見つけます。
- 細菌の成長のため、モニターと 37 ° C、インキュベーターの版を孵化させなさい。
- それぞれの植民地の培養時間後スポットし、CFU としてエクスプレス カウント/mL の容積および希釈のため修正して次の式を使用して。
CFU/mL (C ・ V) を = M x
場所 C = V スポットあたりのコロニー数各巻接種各プレート (mL) と M サンプルの倍率 (使用希釈の逆数) を =。
注: 10-4サンプル希釈で 0.002 mL のサンプル ボリュームの 1 つの場所で、11 のコロニーがカウントされる。 場合、方程式を用いたコロニー カウントとして計算されます。
(11/0.02) x 104 = 5.5 x 106 CFU/mL
Representative Results
REF 感染結核感染していないコントロール マウスとマウスの画像は図 1に示すように。感染マウスの生産を大幅 (P = 0.0057) 基板管理時に制御と比較して 6 週間後感染症で肺からの高い蛍光信号。REF を使用して結核に対する治療効果を検討する代表的な時間コースは、1、2、4、6、15、週でイメージングできる 24 感染後。蛍光強度は、射の肺組織 (図 1B) を用いた定量化されます。感染マウスの肺に 6 週目に 2 週目から一貫して増加の信号では、REF が正常に生体内で結核を検出することができることを示唆しています。(図 1B) のより遅い時点でマウスのバック グラウンド信号の低下は体の増加に起因する可能性が質量と励起波長浸透を減らす 6 週間の期間にわたってマウスのボリューム。結核感染マウスにおける蛍光源のフリット三次元は図 2で表されます。イメージ シーケンスは、同じの励起と排ガス浄化装置のシリーズを使用してマウスで複数のトランス照明ポイントで取得されます。これらの像は、動物の対象内の蛍光分布の三次元のフリット再構成のため使用されます。図 2A D肺器官登録したマウス トモグラフィの別の方向 (冠状断、矢状面とトランスアキシャル) を示します。NTF 効率マップ チェック復興品質は図 2Eで表されます。NTF は、中立的な密度のフィルターで撮影した余分な画像を透過照明画像から背景の光漏れを引くことができます。(図 2E 測定) 特定の励起フィルターで撮影した画像は同じ発光フィルターと (図 2) をE - シミュレートを与えるオープン励起フィルターで測定した透過像に正規化します。単独での基板によって生成される信号。類似の測定し、両方水平方向 (図 2F) NTF 効率プロファイルとほぼ 0% 誤差の割合 (図 2E % エラー) と垂直 (図 2G) プロファイルをシミュレート不具合の軽減と改善された信号の推定感度と質の良い 3次元再構成の証拠を提供します。
図 1.参考文献と結核のイメージング(A)生体内イメージング感染し、2、4、および 6 週間後感染症で結核に感染したマウスの。カラー バーは、高 (赤) に低 (黄色) から 1 cm2当たりの光子の蛍光信号の強さを表します。(B)結核感染マウスからの蛍光強度の定量化。蛍光値を両方のコントロール (ブラック)、感染 (赤) は、各時点の標準エラーと共に表されます。結果の有意性を調べた学生t-テスト、 p値が < 0.05 が重要と考えられていた。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.結核感染マウスにおける蛍光源のフリット三次元。別の方向で表されるマウス トモグラフィーA) 歯冠、B) 矢状、および C) D) 肺器官登録トランスアキシャル。利益 (率 ROI) の 3次元領域は、ソース計測値の肺で赤キューブとして表されます。(E) NTF 効率を測定し模擬復元の品質をチェックするためのマップします。3 D 再構成 (類似した値と実測値 NTF 効率) の良質を提供する値と実測値の NTF 効率プロファイルを比較しました。F) および水 G) 垂直方向の信号はプロファイルを表す測定 (青)、(赤) NTF 効率曲線をシミュレートします。水平および垂直の赤いバーでは、ソースの位置を示します。カラー バーは、高 (赤) に低 (青) から 1 cm2当たりの光子の蛍光信号の強さを表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
REF などのイメージング技術を使用して堅牢で一貫性のあるデータの生成を許可する主な戦略があります。光イメージングには、すべての方向に放射された光をキャプチャすることは困難だために浸透の深さに影響を与えることができます組織内散乱光が生成されます。使用近赤外蛍光 (NIR) の REF 700 〜 900 nm の Querange の励起・発光波長を持つイメージング用基板の哺乳類ティッシュの蛍光信号の最小吸収が容易になります。カスタム設計された基板は、逆に近赤外蛍光体、IRDye 800Cw をリンクによって建てられた IRDye QC-1、蛍光共鳴エネルギー移動に基づく消光を許可するラクタム環によって。IRDye は優れた組織浸透と光散乱特性と哺乳類の36に明らかに有害な影響がない、血および器官から 24 時間蛍光によってクリアされる後 4 h が増加の信号大幅基板管理、投与後 6 h のレベル最大に達する。
細菌感染用量、感染用量及び基板の管理だけでなく、パイロット研究を実行することにより感染症の記事をイメージングの時間ポイントのモードでは、大規模で複雑な実験に着手する前に標準化しなければなりません。キーの実験を行う前に標準的な手順を最適化することができますので、大量の動物をイメージングするとき、パイロット研究には時間とコスト大幅削減できます。全身画像透過照明とex vivo肺イメージング射を使用して信号のソースを検証して、相関の品質を決定するを使用して、次の興味の臓器・組織に細菌負荷を確定すべき細菌数現在8。パイロット研究では、検出のしきい値、テクニックのダイナミック レンジだけでなく、イメージングに最適な実験条件の決定に洞察を提供します。
高感度測定と自然な結核をイメージする能力としてイメージング REF を使用する主な利点は、他の蛍光・発光の戦略と比較して系統。REF イメージングは、すべての結核臨床分離菌株および結核複雑な系統の保存されている BlaC の堅牢な触媒の酵素を利用しています。イメージング REF の偉大な感度は、触媒急速 BlaC の組み合わせで宿主細胞によって裂かれた蛍光製品の保持とによるものです。基板が感染した細胞や組織内の信号のほぼ無限の蓄積で利用できる限り、増加信号継続的に。イメージング REF のこの高められた感度イメージングの代替的なアプローチと比べてにより結核の特異的検出両方生体外および生体内の8,23,24、 29。
遺伝的変更の任意の感染モデル、いずれ研究室動物8,37または人間の臨床材料29,38の直接適用を有効にすることがなく細菌検出用イメージング REF を使用できます。.検出し、画像のさまざまな病原体39,40, プロテアーゼ、キナーゼ、ウレアーゼ、β ガラクトシダーゼなど BlaC 以外多数の酵素のターゲットの蛍光基板を開発することができますので、REF が使用されます。しかし、思想は、ことを確認するためにターゲットに与えられるべき注意が表示されますイメージングのための最適な特性。BlaC は、この戦略の成功のアプリケーションを確保する特性の良いモデル酵素を表します。イメージング REF 即時読み出し細菌負荷の肺に存在時に説明します感染症、結核の病因、細菌数の測定は通常 3 〜 6 週間を必要とするための研究が、均等に大きく進行状況を高速化このアプローチは大いに節約急速成長生物の時間。結核患者41,42で結節性病変の診断の重要な問題から癌を区別するために、REF を使用またできます。REF は並進結核イメージングを加速するための新しいツールとして機能し、潜在的治療成果の迅速な予測をできるように、人間にも応用できます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | VETONE | 501027 | |
| CNIR800 | Custom synthesized | ||
| Fatal Plus solution | Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd | ||
| 7H9 Middlebrook broth | BD | 271310 | |
| OADC Middlebrook enrichment | BD | 212351 | |
| Sporcidin | RE-1284F | ||
| 7H11 Middlebrook Agar | BD | 212203 | |
| Madison Chamber | |||
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | |
| XGI-8-gas Anesthesia System | Perkin Elmer | ||
| Living Imaging software | Perkin Elmer | ||
| Transparent nose cones | Perkin Elmer | ||
| M. tuberculosis strain CDC1551 | ATCC | ||
| Female BALB/C mice, 5-7 weeks | Jackson Laboratory |
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