Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Микобактерии изображений в мышах с флуоресценцией фермента репортер

Published: February 26, 2018 doi: 10.3791/56801
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center, 2Tuberculosis Research Section, Laboratory of Clinical Infectious Diseases, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health
* These authors contributed equally

Summary

Мы описываем оптических изображений мышей, инфицированных микобактериями туберкулеза (микобактерий туберкулеза) с помощью репортер фермента флуоресцирования (REF). Этот протокол облегчает чувствительных и конкретных обнаружение микобактерий туберкулеза в доклинических животных моделей для исследования патогенеза, клинической медицины и вакцины.

Abstract

Репортер фермента флуоресцирования (REF) использует подложках, которые являются специфическими для ферменты, присутствующие в целевой организмов, представляющих интерес для изображений или обнаружения флуоресценции или биолюминесценции. Мы используем BlaC, фермент, конститутивно выраженные всех штаммов микобактерий туберкулеза . REF позволяет быстро квантификации бактерий в легких зараженных мышей. Той же группе мышей может отражаться во многих точках времени, значительно сократить расходы, перечисление бактерий более быстро, позволяя Роман наблюдений в хост патогенный взаимодействиях и повышение статистической мощности, так как легко поддерживаются более животных для каждой группы . ССЫЛКА является чрезвычайно чувствительных благодаря каталитического характера BlaC ферментативные репортер и конкретных пользовательских flourescence резонанс передачи энергии (ЛАДА) или fluorogenic субстратов используется. REF не требуют рекомбинантных штаммов, обеспечивая нормальный хост возбудитель взаимодействий. Мы описываем изображений микобактерий инфекции с помощью подложке ладу с максимальной выбросов на 800 Нм. Длина волны субстрата позволяет изображение чувствительные глубоких тканей млекопитающих. Мы очертим аэрозоля заражение мышей с микобактерий туберкулеза, анестезия мышей, администрация REF субстрат и оптических изображений. Этот метод успешно применяется для оценки взаимодействия хост возбудителя и эффективность антибиотиков, ориентация микобактерий туберкулеза.

Introduction

Медленный темп роста микобактерий туберкулеза является основным камнем преткновения в быстрой диагностики туберкулеза1,2,3. В то время как культуре на основе диагностики занимает недели для получения результатов, Фита мазок имеет диагностических ограничения4 в5 детей и пациентов, совместно инфицированных вирусом иммунодефицита человека6,7. Оптические технологии визуализации недавно были признаны альтернативой традиционных методов диагностики туберкулеза8,9. Флуоресценции и биолюминесценции может использоваться для оптически изображение микобактерий туберкулеза в живых животных в реальном времени10,11,12,13,14, 15,16,,1718,19. Оптическая томография имеет преимущество быстрого и конкретные оценки инфекции с микобактерий туберкулезав20,21,22.

Мы приводим детали для оптических изображений в живых мышей, использование REF микобактерий туберкулеза. Этот метод является весьма конкретные и чувствительных в23,24 и, похож на другие оптические методы, менее дорогостоящим, чем другие методы туберкулеза (ТБ) imaging25, включая компьютерная томография (КТ)26, магнитные резонанс, изображений (MRI)27и позитронно эмиссионная томография/CT (F-ФДГ-ПЭТ/КТ) F-fluorodeoxyglucose28. REF использует пользовательские флуоресцентные или биолюминесцентных подложках, которые после расщепления от бактериальный фермент, производят флуоресцентный продукта8,29. Таким образом он имеет преимущество, не требующих рекомбинантных микобактериальной репортер штамм30,31. Субстрат ладу описал состоит из флюрохром и утоления соединены β-лактамные кольцо, которое является гидролизованный BlaC (β-лактамаз), естественно, конститутивно выраженные микобактериитуберкулеза комплекс в8, 32. бактерии непосредственно генерации сигнала благодаря REF каталитической активности, который позволяет усиления на много порядков и чувствительных обнаружение микобактерийтуберкулеза.

Субстрат REF, используемые в данном исследовании имеет отличные ткани проникновения в живых животных и снижение фона из-за своей длиной волны. С этот субстрат длинноволновых это можно достичь порога обнаружения для микобактерий туберкулеза почти 100 колонии, образуя единиц (CFU) в пробирке и < 1000 кое в легких мышей в vivo (все животное)8, 33. REF может использоваться как средство диагностики для мокроты, клинического материала и даже непосредственно у больных с микро эндоскопических систем16,32,,3334 из-за его высокой чувствительностью и специфичностью. REF может применяться к любой клинической штамм туберкулеза, потому что он использует естественно произведенные бактериальный фермент, BlaC, для обнаружения в всех штаммов. Эти характеристики делают REF imaging ценным инструментом исследования доклинические туберкулеза в целом для облегчения терапевтических и оценки вакцин, а также анализ патогенеза, но также в конечном итоге могут быть применены к диагностике туберкулеза пациентов.

Protocol

Исследования на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и положениями, установленными институциональный уход животных и использования Комитета Техас A & M University. Обзор и утверждение от биологической безопасности сотрудник или на вашем учреждении Комитета могут потребоваться.

Предупреждение: Все процедуры требуют BSL3 сдерживания. Сотрудники обязаны носить средства индивидуальной защиты на все времена. Все манипуляции выполняются внутри кабинета по биобезопасности (BSC) и все Шарпс удаляются в контейнерах колюще-режущих отходов. Работа поверхностей и BSC убираются с буферизацией фенола и 70% этанол до начала работы и после работы. Процедуры обычно будет осуществляться на уровне 3 биобезопасности с микобактерии, но для съемки целей и иллюстрации, авторы демонстрируют эти процедуры на уровне 2 биобезопасности с менее вирулентные бактерии.

1. штаммов и культура условия

Примечание: В этом исследовании используется штамм микобактерий CDC1551, но любой штамм микобактерий туберкулеза могут быть использованы таким же образом.

  1. Рост бактерий в M-OADC-TW (7 Ч 9 бульон с 0,5% глицерина, олеиновая кислота 10% декстрозы комплекса без каталазы и 0,05% анимации-80) средних стоя при 37 ° C к ОД600 0.5 (~ 0,2 х 107 кое).
  2. Разбавить культуры в M-OADC-TW (серии 1:10 разведения бактерий). Пластина разведения бактерий (105, 106, 107, 108) в трех экземплярах на выборочной 7 H 11 пластин позволяет определение кое.
  3. Инкубируйте пластины для четырех недель при 37 ° C или до тех пор, пока колоний можно точно посчитать.
  4. Центрифуга бактериальных посевным материалом на 8534 g x 5 минут для получения гранул. Помыть лепешка однажды с 10 мл физиологического раствора (0,9% NaCl) и вновь приостановить гранулы в 15 мл физиологического раствора (0,9% NaCl).

2. Аэрозольные заражение мышей, используя камеру Мэдисон

  1. Разрешить мышей, чтобы акклиматизироваться к новой обстановке в неделю.
  2. Взвешивание мышей до их загрузки в камеру.
  3. Подключите три шнуры к удлинителю: мощности основной камеры, вакуумный насос и воздушный компрессор, в этом порядке.
  4. Осторожно Отвинтите стеклянную банку. Довести колбу до кабинета биобезопасности и добавьте вызов посевным материалом, приостановлено в 15 мл физиологического раствора (0,9% NaCl) для достижения ~ 104 - 106 CFU бактерий в легких.
  5. Закройте крышку стеклянную банку в кабинете биобезопасности. Прикрепите банку к блоку ингалятор и отрегулировать вертикальное нержавеющая сталь трубы так, что нижний конец (всасывание) около четверти дюйма ниже уровня жидкости в банку.
  6. Загрузить все животные, необходимые для эксперимента (палата может вместить до 90 мышей) в камеру и закрыть все защелки на дверь.
  7. Проверить основные (комната) расходомер воздуха. Убедитесь, что центр поплавок (шар) работает около 50 Л/мин как на шкале слева.
  8. Нажмите кнопку Пуск на панели управления камеры. Установите скорость воздушного потока через расходомера воздуха компрессор (меньше метра в слева) 4 Л/мин на шкале. Проверьте визуально это время распылению вызов посевным материалом.
  9. После 15 минут когда появляется красный свет на передней панели управления и звуковой сигнал указывает на конец выполнения, нажмите кнопку Reset на нижнем правом углу панели управления для сброса таймеров.
  10. Удерживая кнопку маленький красный на двери камеры выпустить вакуума.
  11. Откройте дверь камеры и удалить животных. Место мышей обратно в их клетках.
  12. Извлеките ингалятор чашу и место в запечатанном, герметичность транспортировочный контейнер. Поместите контейнер внутри шкафа био безопасности и отменить приостановление вызов в указанный контейнер для отходов.
  13. Поместите jar используется распылитель биологической мешок и уплотнения сумка для транспортировки в автоклаве.
  14. В конце процедуры инфекции спрей внутри камеры с буферизацией фенола и 70% этанола и позволить камере сидеть в течение 10 мин.
  15. Затем протрите все доступные внутренние поверхности очень тщательно. Утилизация всех загрязненных бумажные полотенца, и т.д. в биологической мусор. Автоклав мусор, отходы контейнер и использовать небулайзер баночки.
  16. Место животных обратно в комнате, сдерживания до точки время визуализации.
  17. В день изображений Передача животных в вторичного контейнера изображений комнату.

3. животных анестезии

  1. Анестезировать мышей с изофлюрановая с помощью заказной газовой системы анестезии.
  2. Вес каждой из двух угольный фильтр канистра, расположенных на верхней части блока анестезии.
  3. Замените новую канистру, если вес 50 г выше начальный вес.
  4. Проверьте блок испарителя для обеспечения достаточного изофлюрановая для процедуры.
  5. Установите держатель носовой конус внутри изображений камеры. Число конусов нос, необходимые для процедуры и печатью оставшиеся отверстия с носовой конус блокаторы.
  6. Включите подачу кислорода из цилиндра высокого давления и установить его на 55 psi.
  7. Включите насос эвакуации, расположенный перед блоком анестезии и установить его на 8 Л/мин.
  8. Включите рычаг кислорода, расположенный перед блоком анестезии.
  9. Включите потока газа в камеру индукции анестезии для отключения потока газа на 1,5 Л/мин очередь потока газа.
  10. Включите газового потока для изображений камеры для отключения потока газа на 0,25 Л/мин очередь потока газа.
  11. Включите изофлюрановая испарителем и установите его на 2-2,5%. Отрегулируйте уровень изофлюрановая согласно количества и веса животных, используемого для эксперимента, повернув ручку на изофлюрановая испарителем (2-2,5% для мыши весом ~ 20 g; 4% для морской свинки, весом 300 г).
  12. Место мыши в камере анестезии и закройте крышку. Включите потока газа в камеру индукции анестезии.
  13. Оставьте мышей в зале индукции анестезии для 5-10 мин до тех пор, пока полностью под наркозом.
  14. После наркоза мышей, применять оптических мазь для глаз для их защиты во время визуализации.
  15. Место мыши в брюшной и грудной recumbency, таким образом, что их носы размещаются в носовой конус для облегчения анестезии мышей в процедуре обработки изображений.

4. репортер фермента флуоресцирования (REF) изображений

  1. Придать субстрата (20 мкм, 2.5 мкл/г веса) внутрибрюшинной инъекции в инфицированных, а также управления мышей. Мышей находятся под наркозом внутри тепловизионные камеры для менее 1 мин.
  2. Начало создания образов системы.
  3. Инициализация системы, нажав на Initialize. Подождите, пока температура бар превращается в зеленый.
    Примечание: Тепловизионная камера состоит из подогретую платформу для поддержания температуры тела животного во время визуализации.
  4. Выберите для визуализации параметр приобретение, люминесцентные | Транс освещение для всего животного или Epi освещение для легких тканей, структура и оверлея на приобретение панели управления.
  5. Задать поле зрения B для одной мыши и лампа уровня до высокого.
  6. Задать время экспозиции для авто, средний биннинга, 2-3 f/stop и возбуждения фильтр на 745 фильтры Нм и выбросов от 780 нм до 840 Нм.
  7. Для последовательности установки нажмите на последовательности установки, выберите 9-12 транс освещение точек в области легких.
  8. Нажмите на приобретение для захвата изображений.
  9. Поместите курсор мыши обратно в клетку после обработки изображений.
  10. Монитор мыши до тех пор, пока полностью восстановился или пожертвовать для количественной оценки CFU если изображений на этапе эксперимента. Выполните изменение Карновского Оценка для мониторинга благосостояния мышей пост изображений.

5. анализ REF изображений

  1. Откройте изображений программное обеспечение.
  2. Загрузите файлы изображений, нажав значок Обзор.
  3. Для спектральных расслоение, нажмите на спектральные Unmixing в палитре и нажмите спектры, необходимые для unmix. Нажмите на Пуск расслоение.
  4. Оптические поверхности реконструкции нажмите на топографии поверхности.
  5. Выберите ориентацию на спинной, при условии меха мыши и нажмите кнопку Создать поверхность.
  6. Нарисуйте обрезать изображение и задать порог изображение для региона интерес. Нажмите кнопку Готово.
  7. Для органа регистрации перейдите на вкладку регистрации в 3D оптических инструментов в раскрывающемся меню.
  8. Реестр органов интереса в атласе органа.
  9. Отрегулируйте размер органа или расположение для созданного топографии поверхности с помощью инструмента Трансформация, вкл/выкл, расположенный на панели Регистрация инструменты.
  10. Перейти на флуоресцентные томография 3D реконструкции (ФЛИТ), и выберите анализировать tab. Выберите изображения, чтобы быть включены для анализа, тип нормированный передачи флуоресцирования (НФПК) эффективности изображения, нажмите кнопку Пуск.
  11. Проверить на выделить все и реконструировать в вкладку Предварительный просмотр данных.
  12. Для количественной оценки флуоресценции идти средства региона интерес (ROI), добавить ROI куб органа интерес и отрегулировать размер куба для покрытия орган интерес. Нажмите на измерения 3D ROIs.
  13. В окне измерения ROI перейдите к 3D ROI измерения, выберите тип данных для исходного вокселей и измерения единица-pmolM-1см-1.
  14. Сохранить или экспортировать результат анализа 3D реконструкции ПОРХАЮТ в файл фигуры или данных.

6. Количественная оценка бактерий CFU

  1. Усыпить мышей внутрибрюшинной инъекцией Пентобарбитал натрия 0,1 мл (390 мг/мл).
  2. Проверить педаль рефлекс, сжимая колодки ноги мышей, чтобы убедиться, что нет никаких рефлекторной реакции.
  3. Explant легочной ткани от мышей с использованием стерильных щипцами и ножницы. Однородный легочной ткани в 1 мл раствора 1 x фосфат амортизированное saline (PBS).
  4. Сделайте десятикратного серийных разведений легких огневки в стерильных ПБС.
  5. Для обшивки, Найди три аликвоты 20 мкл соответствующих разбавления на табличке агар.
  6. Инкубируйте пластины в инкубаторе при 37 ° C и монитор для роста бактерий.
  7. Количество колоний в каждом месте после время инкубации и выразить кое / мл, исправляя для тома и разрежения с помощью следующего уравнения:
    КОЕ / мл = (C/V) x М
    Где C = колонии разрядов на месте, V = объем образца, привитых на каждой пластине (мл) и M = коэффициент умножения (обратную величину размывание используется).
    Примечание: Если 11 колоний, учитываются в одном месте для объем образца 0,002 мл на образце разбавления 10-4, с помощью уравнения, граф колонии будет рассчитываться как
    (11/0.02) x 104 = 5.5 x 106 кое / мл

Representative Results

Ссылка изображений мышей, инфицированных M. tuberculosis наряду с неинфицированным управления мыши приведены в Рисунок 1A. Зараженных мышей производится значительно (P = 0.0057) выше флуоресценции сигнал от легких на 6 недель после заражения по сравнению с контролем администрации субстрата. Типичное время курс для изучения терапевтическую эффективность против микобактерий туберкулеза с помощью REF может изображений в неделю, 1, 2, 4, 6, 15, 24 послеоперационные инфекции. Интенсивность флуоресценции количественно с помощью epi освещение для легочной ткани (рис. 1Б). Постоянно растущая сигнал от 2 недели к неделе 6 в легких зараженных мышей свидетельствует о том, что предложение успешно удалось обнаружить микобактерий туберкулеза в естественных условиях. Капля в фонового сигнала управления мышей на более позднем этапе (рис. 1Б) может объясняться увеличением тела массы и объема мышей в течение 6 недель, сокращая тем самым проникновение волны возбуждения. 3D реконструкция ПОРХАЮТ флуоресценции источников в мышей, инфицированных туберкулезом м. представлена в Рисунок 2A. Последовательности изображений приобретаются в нескольких точках транс освещение мыши, используя те же возбуждения и серии выбросов фильтров. Затем эти изображения последовательности используются для 3D реконструкции ПОРХАЮТ флуоресцентный источник распределения в рамках животных. Рисунок 2 A-D демонстрирует различные направления (корональный, сагиттальной и transaxial) мыши томография легких орган регистрации. НТФ эффективность карты для проверки качества реконструкции представлены в рисунке 2E. НТФ позволяет вычитание фона света утечки из транс Подсветка изображений через дополнительные изображения захвачен с фильтр нейтральной плотности. Изображение, полученное с фильтром конкретных возбуждения (Рисунок 2,E-измеренные) нормируется для передачи изображения, измеряется с один и тот же фильтр выбросов и открытым возбуждения фильтр (рис. 2E - моделируется) дать сигнал, производимые только субстрата. Подобный измеряется и моделируется НТФ эффективности профиль по горизонтали (рис. 2F), так и вертикальных профилей (рис. 2G) с почти 0% процент ошибки (Рисунок 2Ошибка E-%) предоставляет свидетельство хорошего качества 3D-реконструкции с сокращением артефакты и улучшение сигнала локализации и чувствительность.

Figure 1
Рисунок 1 . Визуализационная диагностика микобактерий туберкулеза с реф (A) в естественных условиях изображений мышей неинфицированных и инфицированных микобактерий туберкулеза в 2, 4 и 6 недель после заражения. Панель цвета представляет интенсивность флуоресцентного сигнала в фотонов в секунду на2 см от низкого (желтый) до высокого (красный). (B) количественная оценка интенсивности флуоресценции от мышей, инфицированных микобактерий туберкулеза. Флуоресценции значения для обеих управления (черный) и инфицированных (красный) представлены наряду с стандартная ошибка для каждой точки времени. Значимость результатов определяется студентов t-теста, p значений < 0,05 были значительными. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 . 3D реконструкции ПОРХАЮТ флуоресценции источников в мышей, инфицированных M. tuberculosis. Томография мыши представлены в разных направлениях; A) корональный, B) Сагиттальный и C) transaxial с D) легких орган регистрации. Регионе 3D интерес (ROI) представлена как красный куб в легком для исходного измерения. (E) НТФ эффективности карты измеренных и смоделированных для проверки качества реконструкции. Измеренных и смоделированных НТФ эффективности профиль сравнивали, обеспечивая хорошее качество 3D реконструкции (аналогичные измеренных и смоделированных НТФ эффективность). F) горизонтальные и G) вертикальные сигнал профили представление измеренных (синий) и имитации (красный) кривой эффективности НТФ. Горизонтальные и вертикальные красные полоски указывают положение источника. Панель цвета представляет интенсивность флуоресцентного сигнала в фотонов в секунду на2 см от низкого (синий) до высокого (красный). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

При использовании методы обработки изображений, например REF, есть ключевые стратегии, которые позволяют создание надежных и последовательных данных. Оптическая томография производит рассеянного света в тканях, которые могут повлиять на глубину проникновения, поскольку трудно захватить света, излучаемого во всех направлениях. Использование вблизи инфра красный Флюорофор (NIR) субстрат для изображений, имеющих длину волны возбуждения и выбросов в Querange 700-900 нм REF способствует минимальным поглощением флуоресцентного сигнала тканей млекопитающих. Пользовательские разработан субстрат был построен путем увязывания NIR Флюорофор, IRDye 800Cw для утоления IRDye QC-1, лактамные кольцо, позволяя на основе передачи тушения флуоресценции резонанс энергии. IRDye имеет отличные ткани проникновение света рассеяния характеристик и не имеют каких-либо очевидной вредное воздействие на млекопитающих36, очищали от крови и органов 24 h. флуоресценции сигнала значительно увеличивается, начиная с 4 ч после Субстрат администрации, достигнув максимальной уровнях 6 ч после приема.

Прежде чем приступать на больших, сложных, эксперименты должны быть стандартизированы бактериальных инфекционных дозы, режим администрации инфекционных дозы и субстрата, а также время точек изображений пост инфекции путем проведения экспериментальных исследований. Экспериментальные исследования может значительно сократить время и затраты при визуализации большое количество животных, потому что стандартная процедура может быть оптимизирована до делать ключевые эксперимент. Бактериальной нагрузки должны определяться в органы/тканях интерес после всего тела изображений с помощью транс освещение и ex vivo томографии легких с помощью epi освещение для проверки источника сигнала и определить качество корреляции с бактериальной числа нынешних8. Экспериментальные исследования даст понимание порог обнаружения, динамический диапазон техники, а также определение оптимальной экспериментальных условий для изображений.

Основными преимуществами использования изображений как REF по сравнению с другими флуоресцентные и биолюминесцентных стратегии являются его высокая чувствительность и способность изображения природных микобактерий туберкулеза штаммов. Ссылка изображений использует каталитически надежные фермента BlaC, которая сохраняется во всех клинических изолятов микобактерий туберкулеза и туберкулеза комплекс штаммов. Большая чувствительность REF изображений объясняется быстрое катализатора скорость BlaC в сочетании с сохранением рассеченного флуоресцентные продукта клетки-хозяина. Сигнал непрерывно увеличивается до тех пор, как субстрат доступен, что приводит к практически неограниченную накопления сигнала внутри инфицированных клеток и тканей. Это повышенная чувствительность REF изображений по сравнению с альтернативных подходов изображений позволяет конкретного выявления микобактерий туберкулеза оба в пробирке и в vivo8,23,24, 29.

Ссылка изображений может использоваться для обнаружения в бактериальные без генетических изменений, позволяя его непосредственное применение к любому инфекция модели, либо лабораторных животных8,37 или клинических материалов человека29,38 . REF может использоваться для обнаружения и изображения широкий спектр патогенов39,40, так как fluorogenic субстратов могут быть разработаны для многочисленных ферментативные целей помимо BlaC такие протеаз, киназы, ureases и β-galactosidases. Однако осторожны, следует подумать с целью обеспечения он выводит оптимальные характеристики для воображения. BlaC представляет собой хорошую модель фермент для характеристик, которые обеспечат успешное применение этой стратегии. Ссылка изображений обеспечивает немедленное считывание на бактериальной нагрузки в легких во время инфекции, которая значительно ускоряет прогресс в изучении патогенеза туберкулеза, поскольку определение бактериальной чисел обычно требует трех-шести недель, но даже в более быстро растущих организмов, такой подход позволит сэкономить немало времени. ССЫЛКА может также использоваться для дискриминации карциномы от туберкулеза, ключевой проблемой в диагноз узловой поражений в больных41,42. REF служит роман инструментом для ускорения трансляционная туберкулезом изображений и может применяться даже для людей, потенциально позволяя быстрое предсказание терапевтических результатов.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane VETONE 501027
CNIR800 Custom synthesized
Fatal Plus solution Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd
7H9 Middlebrook broth BD 271310
OADC Middlebrook enrichment BD 212351
Sporcidin RE-1284F
7H11 Middlebrook Agar BD 212203
Madison Chamber
IVIS Spectrum Perkin Elmer 124262
XGI-8-gas Anesthesia System Perkin Elmer
Living Imaging software Perkin Elmer
Transparent nose cones Perkin Elmer
M. tuberculosis strain CDC1551 ATCC
Female BALB/C mice, 5-7 weeks Jackson Laboratory

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lewinson, D. M., et al. Official American thoracic society/infectious diseases society of America/ centers for disease control and prevention clinical practice guidelines: diagnosis of tuberculosis in adults and children. Clin Infect Dis. 64 (2), 1-33 (2017).
  2. Lee, J., et al. Sensititre MYCOTB MIC plate for testing Mycobacterium tuberculosis susceptibility to first- and second-line drugs. Antimicrob Agents Ch. 58 (1), 11-18 (2014).
  3. Dheda, K., et al. The epidemiology, pathogenesis, transmission, diagnosis, and management of multidrug-resistant, extensively drug-resistant, and incurable tuberculosis. Lancet Resp Med. 5 (4), 291-360 (2017).
  4. Behr, M. A., et al. Transmission of Mycobacterium tuberculosis from patients smear-negative for acid-fast bacilli. Lancet. 353 (9151), 444-449 (1999).
  5. Cruz, A. T., Revell, P. A., Starke, J. R. Gastric aspirate yield for children with suspected pulmonary tuberculosis. J Pediatric Infect Dis Soc. 2 (2), 171-174 (2013).
  6. Monkongdee, P., et al. Yield of acid-fast smear and mycobacterial culture for tuberculosis diagnosis in people with human immunodeficiency virus. Am J Resp Crit Care. 180, 903-908 (2009).
  7. Karstaedt, A. S., Jones, N., Crewe-Brown, H. H. The bacteriology of pulmonary tuberculosis in a population with high human immunodeficiency virus seroprevalence. Int J Tuberc Lung D. 2 (4), 312-316 (1998).
  8. Yang, H. J., et al. Real-time imaging of Mycobacterium tuberculosis, using a novel near-infrared fluorescent substrate. J Infect Dis. 215 (3), 405-414 (2017).
  9. Nooshabadi, F., et al. Intravital excitation increases detection sensivity for pulmonary tuberculosis by whole-body imaging with β-lactamase reporter enzyme fluorescence. J Biophotonics. , (2016).
  10. Chang, M. H., Cirillo, S. L. G., Cirillo, J. D. Using luciferase to image bacterial infections in mice. J Vis Exp. (48), (2011).
  11. Kong, Y., Subbian, S., Cirillo, S. L. G., Cirillo, J. D. Application of optical imaging to study of extrapulmonary spread by tuberculosis. Tuberculosis. 89 (1), 15-17 (2009).
  12. Andreu, N., et al. Rapid in vivo assessment of drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis using an improved firefly luciferase. J Antimicrob Chemoth. 68 (9), 2118-2127 (2013).
  13. Andreu, N., et al. Optimisation of bioluminescent reporters for use with Mycobacteria. PLoS ONE. 5 (5), 10777 (2010).
  14. Nooshabadi, F., Yang, H. Y., Bixler, J. N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Maitland, K. C. Intravital fluorescence excitation in whole-animal optical imaging. PLoS ONE. 11 (2), 0149932 (2016).
  15. Bixler, J. N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Matiland, K. C. Multi-scale fluorescence imaging of bacterial infections in animal models. Proc. SPIE 8565, Photonic Therapeut Diagnos IX. , 856537 (2013).
  16. Mufti, N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Maitland, K. C. Detection of bacterial infection with a fiber optic microendoscope. Proc. SPIE 8092, Med Laser Appl Laser-tissue Interac V. , 80920A (2011).
  17. Zelmer, A., et al. A new in vivo model to test anti-tuberculosis drugs using fluorescence imaging. J Antimicrob Chemoth. 67 (8), 1948-1960 (2012).
  18. Yang, D., Ding, F., Mitachi, K., Kurosu, M., Lee, R. E., Kong, Y. A fluorescent probe for detecting Mycobacterium tuberculosis and identifying genes critical for cell entry. Front. Microbiol. 7, (2016).
  19. Ordonez, A. A., et al. Mouse Model of pulmonary cavitary tuberculosis and expression of matrix metalloproteinase-9. Dis Model Mech. 9, 778-779 (2016).
  20. Mills, B., Bradley, M., Dhaliwal, K. Optical imaging of bacterial infections. Clin Transl Imaging. 4, 163-174 (2016).
  21. Calderon, V., Valbuena, G., Goez, Y., Endlsey, J. J. A humanized mouse model of tuberculosis. PLoS ONE. 8 (5), 63331 (2013).
  22. Vergne, I., Chua, J., Lee, H. H., Lucas, M., Belisle, J., Deretic, V. Mechanism of phagolysosome biogenesis block by viable Mycobacterium tuberculosis. P Natl Acad Sci Usa. 102 (11), 4033-4038 (2004).
  23. Kong, Y., et al. Imaging tuberculosis with endogenous β- lactamase reporter enzyme fluorescent in live mice. P Natl Acad Sci Usa. 107 (27), 12239-12244 (2010).
  24. Kong, Y., Cirillo, J. D. Reporter enzyme fluorescence (REF) imaging and quantification of tuberculosis in live animals. Virulence. 1 (6), 558-622 (2010).
  25. Skoura, E., ZumLa, A., Bomanji, J. Imaging in tuberculosis. Int J Infect Dis. 32, 87-93 (2015).
  26. Lee, K. S., Im, J. G. CT in adults with tuberculosis of the chest: characteristic findings and role in management. Am J Roentgenol. 164, 1361-1367 (1995).
  27. Hoffman, E. B., Crosier, J. H., Cremin, B. J. Imaging in children with spinal tuberculosis. A comparison of radiography, computed tomography and magnetic resonance imaging. J Bone Joint Surg Br. 75 (2), 233-239 (1993).
  28. Soussan, M., et al. Patterns of pulmonary tuberculosis on FDG-PET/CT. Eur J Radiol. 81 (10), 2872-2876 (2012).
  29. Sule, P., et al. New directions using reporter enzyme fluorescence (REF) as a tuberculosis diagnostic platform. Tuberculosis. 101, 78-82 (2016).
  30. Heuts, F., Carow, B., Wigzell, H., Rottenberg, M. E. Use of non-invasive bioluminescent imaging to assess mycobacterial dissemination in mice, treatment with bactericidal drugs and protective immunity. Microbes Infect. 11 (14-15), 1114-1121 (2009).
  31. Kong, Y., et al. Application of fluorescent protein expressing strains to evaluation of anti-tuberculosis therapeutic efficacy in vitro and in vivo. PLoS ONE. 11 (3), 0149972 (2016).
  32. Xie, H., et al. Rapid point-of-care detection of the tuberculosis pathogen using a BlaC-specific fluorogenic probe. Nature Chem. 4, 802-809 (2012).
  33. Nooshabadi, F., et al. Whole-animal imaging of bacterial infection using endoscopic excitation of β-lactamase (BlaC)- specific fluorogenic probe. Proc SPIE. 9715, 97150 (2016).
  34. Ghiasi, M., Pande, T., Pai, M. Advances in tuberculosis diagnostics. Curr Trop Med Rep. 2 (2), 54-61 (2015).
  35. Rao, J., Andrasi, A. D., Yao, H. Fluorescence imaging in vivo: recent advances. Curr Opin Biotech. 18 (1), 17-25 (2007).
  36. Marshall, M. V., Draney, D., Sevick-Muraca, E. M., Olive, D. M. Single-dose intravenous toxicity study of IRDye 800CW in Sprague-Dawley rats. Mol Imaging Biol. 12 (6), 583-594 (2010).
  37. Zhan, L., Tang, J., Sun, M., Qin, C. Animal models for tuberculosis in translational and precision medicine. Front Microbiol. 8, 717 (2017).
  38. 2,7-disubstituted cephalosporin derivatives as beta-lactamase substrates and methods for their use for the diagnosis of tuberculosis. US patent. Rao, J., Xie, H., Cheng, Y., Cirillo, J. D. , 20150219653 A1 (2015).
  39. Shao, Q., Zheng, Y., Dong, X., Tang, K., Yan, X., Xing, B. A Covalent Reporter of β-Lactamase Activity for Fluorescent Imaging and Rapid Screening of Antibiotic-Resistant Bacteria. Chem Eur J. 19 (33), 10903-10910 (2013).
  40. Li, L., Li, Z., Shi, W., Li, X., Ma, H. Sensitive and Selective Near-Infrared Fluorescent Off-On Probe and Its Application to Imaging Different Levels of β-Lactamase in Staphylococcus aureus. Anal Chem. 86 (12), 6115-6120 (2014).
  41. Ashizawa, K., et al. Coexistence of lung cancer and tuberculoma in the same lesion: demonstration by high resolution and contrast-enhanced dynamic CT. BRIT J RADIOL. 77 (923), 959-962 (2004).
  42. Figueroa, C. J., Riedel, E., Glickman, M. S. Clinical and radiographic differentiation of lung nodules caused by mycobacteria and lung cancer: a case-control study. BMC Infect Dis. 15 (482), (2015).

Tags

Иммунология выпуск 132 легочной оптические лактамаза вакцин Животные модели терапии патогенез
<em>Микобактерии</em> изображений в мышах с флуоресценцией фермента репортер
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sharan, R., Yang, H. J., Sule, P.,… More

Sharan, R., Yang, H. J., Sule, P., Cirillo, J. D. Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence. J. Vis. Exp. (132), e56801, doi:10.3791/56801 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter