Summary
Protokolls beskriver förfarandet fisk spermier bedömning med hjälp av datorstödda spermier analys och kylanordningar. Programvaran ger en snabb, korrekt och kvantitativ analys av fisk spermiernas kvalitet baserat på spermier motilitet, vilket kan vara ett användbart verktyg i vattenbruk att förbättra reproduktionen framgång.
Abstract
För gamet kvalitetsbedömning finns det innovativa, snabb och kvantitativa tekniker som kan ge användbara data för vattenbruk. Datoriserade system för spermier analys utvecklades för att mäta flera parametrar och en av de vanligaste uppmätta är spermierörlighet.
Inledningsvis utformades denna datorteknik för däggdjursarter, men det kan även användas för fisk spermier analys. Fisk har särdrag som kan påverka spermier bedömning såsom en kort motilitet tid efter aktivering och, i vissa fall anpassning till lägre temperaturer. Det är således nödvändigt att ändra både mjukvara och hårdvara komponenter för att effektivisera motilitet analys för fisk spermier analys. Spermiereceptorn, används värmeplattan för att upprätthålla optimala temperaturer av spermier. Dock för vissa fiskarter är det fördelaktigt att använda en lägre temperatur för att förlänga varaktigheten av motilitet, eftersom spermierna förbli aktiva i mindre än 2 min. Det är därför nödvändigt att kyla prover vid konstant temperatur över tiden av analys, inklusive på det optiska mikroskopet kylning enheter. Det här protokollet beskriver analys av fisk spermierörlighet använder programvara för spermier analys och nya kylanordningar för att optimera resultaten.
Introduction
Effekten av reproduktion beror på kvaliteten på både könsceller (ägg och spermier)1,2. Detta är den viktigaste faktorn som bidrar till framgångsrik befruktning, möjliggör utveckling av livskraftiga avkommor3,4. Den praktiska utvärderingen av könsceller kvalitet är det bästa verktyget för att definiera fertilitet potentialen i ett exemplar.
Blanda sperma från flera hanar är vanligt i produktionen av många vattenlevande kommersiella arter4. Men spermier variabiliteten mellan hanar kan leda till spermier konkurrens och följaktligen inte alla män lika bidrar till genbank5. I denna mening är korrekt utvärdering av enskilda ejakulat/spermier funktioner, till exempel motilitet, grundläggande för erhålla diskriminerande information angående enskilda manlig fertilitet potentiella. Direkt observation av spermiernas rörlighet kan producera missvisande och subjektiva data eftersom det kräver tid och erfarenhet, vilket leder till bristande konsekvens och inkompatibilitet av resultat6,7. Men finns det många innovativa, snabb och kvantitativa tekniker som kan ge en tillförlitlig spermier kvalitet analys2,4.
Datorstödd spermier analys utvecklades för att erbjuda korrekta uppgifter om spermier kvalitet8. Denna teknik omfattar utveckling av programvara som är associerad med fas kontrast Mikroskop som gör bedömningen av spermiernas rörlighet. En begränsande faktor för motilitet parametern är dock bildhastigheten för videokameran. Enskilda spermier banor är baserade på spermier huvudet centroiden position i bildrutor av videoinspelningar, som är korrelerad med flagellar rörelse mönster3,9,10, 11. de kinetiska parametrar mäts är linjär hastighet (VSL), krökt velocity (VCL) och genomsnittliga sökvägen velocity (VAP). VSL är avståndet mellan start- och slutpunkten vidtagit de spermier som dividerat med tiden. VCL är den verkliga hastigheten längs den exakta bollbana vidtagit spermier. VAP är hastigheten längs en härledd jämnas bana för bana. Dessa parametrar kan ytterligare kinetiska information, inklusive linearitet (LIN), rakhet (STR), vingla (WOB) och misshandeln mätningar som amplitud av laterala huvudrörelser (ALH) och beat-cross frekvens (BCF)4,10.
Spermier analys systemet användes ursprungligen för däggdjursarter, och ett av kraven för systemet är att driva på kroppstemperaturen hos givaren (cirka 37 ° C). Denna programvara kan också användas för fiskarter; även om det är nödvändigt att göra vissa anpassningar för att minska felet av spermier analysresultat. I vissa fiskarter, såsom laxfiskar och ål8,12, sker befruktning vid låg temperatur (omkring 4 ° C)2,4. Således, kylning enheter bör utvecklas för att undvika obekväma arbetsförhållanden. Dessutom fisk spermier är orörliga i sädesvätska och kräver en osmotiska chock att aktivera motilitet. För sötvatten arter, bör aktivator mediet har hypoton osmolalitet, medan för marina arter medium bör hyperton. Men för vissa arter, kan som laxfiskar, ion koncentrationen också vara viktigt3,4,9. Efter aktivering kännetecknas fisk spermier av en snabb minskning av motilitet (mindre än 2 min)13,14 och hög hastighet, att vara avgörande för att bestämma den optimala hastigheten att erhålla tillförlitliga uppgifter15.
Syftet med denna studie är att utforma och tillämpa kylsystem för fisk spermier prover. Dessutom definierar detta protokoll hur att hitta de optimala bildrutehastigheter för etableringen av standardprotokoll beroende på Art. Användning av detta protokoll öppnar nya dörrar i samband med fisk seminal utvärdering, med den europeiska ålen som modell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Förfaranden som inbegriper djur ämnena har varit godkänd (2015/VSC/ärter/00064) av den allmänna riktningen av jordbruksproduktionen och boskap på Universitat Politècnica de València.
1. samla in spermier från mogen europeisk ål i fångenskap
Obs: Använd europeisk ål hanar underhålls i tankarna med havsvatten och ett recirkulerande system vid konstant temperatur (20 ° C). Behandla med hormoner genom veckovisa intraperitoneal injektion (humant koriongonadotropin (hCG); 1,5 IE per g fisk kroppsvikt). Acklimatisera sig fisk gradvis börjar med 3 dagar i sötvatten följt av utbyte med havsvatten (1/3 av det totala vattnet i tanken) varannan dag tills de når en salthalt på 37,0 g/mL.
- Söva ålen 24 h efter hormon-injektion för att erhålla prover med bättre spermiekvalitet.
- Förbereda anestesin i förväg: lägga till bensokain 300 mg i 100 mL 70% etanol. Blanda väl och förvara vid 4 ° C.
- Späd bensokain i en flexibel hink med 5 L system vatten för att få en slutlig koncentration på 60 mg/L och blanda ordentligt.
- Överföra fisken till hinken med system- och bensokain. Vänta några minuter tills fisken lugna ner.
- Rensa i underlivet med vatten och torka med hushållspapper att undvika kontaminering av spermier prover av feces, urin eller havsvatten.
- Applicera lätt tryck i buken och samla in de spermier proverna i 15 mL plaströr med hjälp av vakuum pumpen. Spermier volym upp till 6-7 mL, beroende på hanen.
- Håll spermier prover vid 4 ° C i minst 1 h tills motilitet analysen utförs.
2. kylskåp och späd spermier prover
- Bered den mätpump i förväg.
Obs: Spermier proverna spädas i Extender-lösning specifikt för varje art.- Förbered det icke-aktivator mediet för ål spermier prover (P1 medium). Lägg till 0,42 g natriumbikarbonat, 1.828 g natriumklorid, 0,127 g magnesiumklorid, 0,56 g kaliumklorid och 0,037 g kalciumklorid till 250 mL destillerat vatten. Blanda väl att upplösa. Förvaras vid 4 ° C.
- Ställ svalare blocket vid 4 ° C att upprätthålla prover vid en konstant temperatur. Vänta tills temperaturen stabiliserar.
- Späd de spermier prover med hjälp av det mätpump lösning specifikt för varje art.
Obs: Utspädningsfaktorn är artspecifika och måste definieras för att standardisera protokollet. Först uppskatta spermiekoncentration baserat på den koncentration som erhålls i före analysen av motilitet med programvara som beskrivs i steg 3 och 4. Med denna analys är det också möjligt att välja de bästa spermier prover utifrån andelen motilitet. Efter detta kan forskaren börja samla in data för experimentet med de bästa proverna med rätt koncentration.- Späd ål spermier prover i P1 medium med ett förhållande på 1:50. För att förbereda 500 µL av ål utspädd spermier, tillsätt 50 µL av färsk sperma provet och 450 µL av P1. Blanda väl.
3. utvärdera spermier motilitet parametrarna
-
Set-up motilitet modulen av programvaran
- Ställ svalare scenen vid 4 ° C och vänta tills det stabiliserar.
- Öppna programmet och välj Motilitet modul. Skapa användarnamn och lösenord om det behövs.
- Välj Egenskaper och välja önskade parametrar innan du börjar spermier analysen.
- Klicka på arter | Fisk.
- Välj Bildrutor Per sekund och Nummer av bilder, beroende på de bästa tekniska förutsättningarna för varje art. Ange båda alternativ med 120 bilder per sekund.
- Välj negativ kontrast. Det är obligatoriskt för exakt rekonstruktion av spermatozoa banor16.
- Välj motsvarande Räknar kammare och skala av videokameran. Kalibrera den video kameran för förstoring objektiv som används i experimentet. Ställ in SpermTrack10 som räknar kammare och 10 X skala.
Obs: I allmänhet ett djup av 10 µm i räknande kammaren och en förstoring lins 10 X är de rekommendera villkor eftersom de ger bättre fokusering av alla spermier och fånga det högsta antalet celler. Dock är det rekommenderat att göra en tidigare studie av de optimala förutsättningarna för motilitet analys av varje art. - Justera Partikel område och anslutning för varje art. Ange minsta partikel område på 2 µm2 och anslutning på 7 µm.
Obs: För fisk, det lägsta värdet av partiklar område varierar mellan 2-5 µm och anslutning beror på spermier hastigheten och bildfrekvensen. - Spara set-up.
- Välj Capture.
-
Analysera europeisk ål spermier med programvara
- Bered den aktivator (konstgjorda havsvatten) genom att lägga till 0.946 g kommersiella salt 25 mL destillerat vatten med 2% BSA.
- Ta 500 mL aktivator lösning (konstgjorda havsvatten) och placera i blocket svalare.
Obs: I allmänhet fisk spermier aktiveras genom en osmotiska chock händelse, även om jonkoncentration kan också vara viktigt för vissa arter. För sötvatten arter, bör aktivator mediet har hypoton osmolalitet, medan för marina arter medium bör hyperton. - Sätta den räknande kammaren under kyla scenen och vänta tills temperaturen stabiliserar till 4 ° C.
- Blanda aktivator och utspädda spermier att aktivera spermier och börja motilitet videoinspelning mellan 5-10 s efter aktiveringen.
- Ta 4 µL av aktivator lösning och plats i räknande kammaren.
- Försiktigt homogenisera utspädda sperman genom att skaka mikrocentrifug 3 gånger för att undvika skador i spermier celler.
- Ta 0,5 µL utspädda spermier, blanda med aktivator och sätt på locket i räknande kammaren snabbt.
Obs: Detta steg bör inte ta mer än 5 s att starta analysen så snart som möjligt. - Fokusera på spermier celler och hitta det bästa visuella området, som definieras av ett lågt antal spermier (150 till 200 celler) att undvika avlyssning mellan celler (kompletterande figur 1A). Välj Fånga Video hämta spermier spåren, som är separerade enligt hastighet.
- Välj Capture att få 3 till 7 fält, som är det optimala intervallet att erhålla en lägre variationer i resultaten, och fortsätta som förut. Spela in videoklipp tills 120 s efter aktiveringen för att undvika kondens på omslaget av räknande kammaren.
- Välj Exit för att ha en allmän uppfattning i alla fälten.
4. Skaffa motilitet Data
- Välj fält | Partiell | Spara och välja ett filnamn. Klicka på Spara.
Obs: Kalkylbladet ger medelvärdena för ofullständiga data, diagram och bilder av spermatozoa spår. - Välj allmänna Data | Filnamn | Spara.
Obs: Data ange kinetiska värden för enskilda spermier i alla fält.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Analys av tid effekten på spermiernas rörlighet
När det gäller den europeiska ålen, procentandelen av statiska spermatozoa ökade från 15 s till 120 s efter aktivering (från 24,4% 40,7%) och andelen mobila progressiva spermier minskat (från 36,9% till 20,9%) (Figur 1A och 1B). Baserat på hastighet, spermier celler visade en minskning av hastigheten över tiden (figur 1 c och 1 D) minskade. Procentandelen av spermier med snabb hastighet minskade cirka 23% (från 49,4% 26,6%) och andelen spermier med medellång hastighet ökat cirka 7%.
Effekten av bildhastighet och räknande kammare
Olika arter kräver olika bildrutehastigheter för optimalt resultat. Rysk stör kräver 150 bilder per sekund (fps; Figur 2A); karp kräver 100 fps (figur 2B). och för harren, 200 fps var inte tillräckligt för att få optimal kinetiska resultat (figur 2 c). Dessa resultat var inte beroende på djupet av räkna kammare testade (figur 2A-2 C).
Spermier subpopulations struktur
Identifiering av spermier subpopulation baseras på statistisk analys. Det första steget är bestämning av rektor komponenter (principalkomponentanalys; PCA) från komplett uppsättning av motilitet data. Sedan utförs de klustring procedurerna med spermier-derived indexen erhålls efter partnerskaps-och samarbetsavtalet.
I denna studie användes atlantlax spermier som visade fyra olika subpopulations, heter: långsam ickelinjära (låg LIN, STR och VCL), snabbt olinjär (lägre STR, hög VCL), snabbt linjär (hög LIN, STR och VCL) och snabbast linjära (högsta LIN, STR och VCL). Fördelningen av dessa subpopulations varierade längs generationer från vilda djur till odlad ettor (figur 3).
Figur 1 : Effekt av tid efter aktivering på progressivitet och motilitet av europeisk ål spermier. A och B) andelen progressivitet på 15 och 120 s, respektive; C och D) procentandelen av motilitet baserat på hastighet över tid (15 och 120 s efter aktiveringen, respektive). Progressiviteten delades in i tre grupper: progressivt motila celler (vit; VCL menar värde ± SD: 114,5 ± 18,2 och 101,4 ± 34,5 µm/s för 15 och 120 s, respektive), inga progressivt motila celler (grå; VCL menar värde ± SD: 84,8 ± 17,4 µm/s för 15 s och 84,6 ± 16,5 µm/s för 120 s), och statiska spermier (svart). Spermatozoa hastigheten delades in i 4 grupper: snabb (VCL menar värde ± SD: 119,3 ± 13,7 µm/s för 15 s och 118,9 ± 13,3 µm/s för 120 s; vit), medium (VCL menar värde ± SD: 79,7 ± 15,5 µm/s för 15 s och 79,6 ± 15,5 µm/s för 120 s, ljusgrå) , långsam (VCL menar värde ± SD: 32,9 ± 6,5 µm/s för 15 s och 32,6 ± 6,6 µm/s för 120 s; mörkgrå) och statiska (svart). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Effekten av bildfrekvens och räknande kammare i tre sötvattensfisk arter: (A) Rysk stör (B) gemensamma karp och (C) harr. Spermier analys gjordes på 50, 100, 150 och 200 fps, använda två kommersiella räknar kammare med olika djup (10-20 µm). Den svarta cirkeln representerar den bästa hastigheten för varje art. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Spermier subpopulations struktur av tre generationer av atlantlax: vilda män (F0), och de två första generationerna produceras i fångenskap (F1 och F2). Efter klusteranalys, fyra delpopulationer observerades: långsam ickelinjära spermier (låg LIN, STR och VCL; kluster 1; svart), snabbt olinjär spermier (lägre STR, hög VCL, kluster 2, mörkgrå), snabba linjära spermier (hög LIN, STR och VCL; kluster 3; mellanliggande grå) och snabbast linjär spermier (högsta LIN, STR och VCL; kluster 4, ljusgrå). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1. Olika visuella områden från motilitet analys av europeisk ål spermier definieras som (A) bästa och (B) värsta cellkoncentrationen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Spermier analys programvara som används i detta protokoll har använts av forskare som är i världen för olika arter, inklusive fisk. Fisk har dock vissa specifika funktioner som kan påverka bedömningen av spermier. Fisk spermier visade hög hastighet i ögonblicket av aktivering som minskar snabbt och leder till en kort tid av motilitet efter aktiveringen. Dessutom temperaturen av reproduktion artspecifikt och, i vissa fall kan vara runt 4 ° C2,4,8,12. Det är således nödvändigt att göra vissa anpassningar för att förbättra effektiviteten i ett datoriserat system för fisk spermier analys. Den grundläggande principen för parametern motilitet är förvärv och analys av bildföljden av motila spermier. De flesta system använder standard bildfrekvens (16, 25, 30, 50 eller 60 fps) på grund av begränsningar av maskinvaru- och17,18,19,20,21,22. Vissa studier visade dock att en högre bildhastighet ökar vissa hastighet parametrar, såsom VCL, STR, BCF15,23,24. Detta är särskilt viktigt när det är nödvändigt att utvärdera överaktivering av spermier och hitta den högsta hastigheten av spermatozoa11,17,18,19, 25. i förhållande till temperaturen av analys, en kylande tallrik för det optiska mikroskopet, och en ny teknik att kyla prover vid konstant temperatur skulle också kunna förbättra analysen över tid. Den nuvarande arbetet erbjuder ett tillvägagångssätt för att lösa två av de viktigaste problemen med fisk spermier motilitet analys och temperatur känslighet. Trots resultaten med fokus på vissa sötvatten arter, kan denna metod användas för marina arter, även om aktiveringen medium bör anpassas för varje art.
På marknaden finns det en rad produkter eller ens olika versioner av samma produkt. Även om systemen kan ha samma princip, har de olika detaljer resulterar i oförenlighet resultat26,27,28. Dessutom kunde utvärderingen av fisk spermiernas kvalitet har fortfarande metodiska och tekniska begränsningar. Spermier aktiveringen tekniken och tidpunkten för analys efter aktivering är två väsentliga faktorer som påverkar spermier kvalitet utvärdering29,30. Tiden mellan aktivering av spermier prover och stabiliseringen av bilden för videoinspelningar bör vara runt 5 s sedan de första sekunderna (tidsintervall på 5-20 s) ger den mest användbara data2,4. Tidpunkten för spermier analys kan vara begränsad på grund av kondens problem på en glasskiva. Men förblir fisk spermier aktiv med en kraftig rörelse för mindre än två minuter2. På teknisk nivå är det nödvändigt att veta ”optimal” bildfrekvensen att erhålla detaljerad information som ger en noggrann rekonstruktion av spermatozoa banor15. På lägre bildfrekvens är detaljerna av banan förlorad, särskilt för snabb och ickelinjära spermier, medan på högre bildhastigheter, informationen blir överflödiga15,31. För vissa fiskarter, Betygsätt ram (upp till 250 fps) inte kunde tillräckligt för att hitta den högsta hastigheten spermier för vissa fiskarter, såsom öring och lax. Denna variation är artspecifika och måste definieras för varje art att standardisera protokollet och få tillförlitliga resultat15,23,24. Djupet av räknande kammare kan begränsa förflyttning av den stora flagellen fisk och spermier inte kunde nå maximal hastighet11,32,33. Dessutom kan programvaran har vissa begränsningar för detektion av de riktiga spermier när det finns en korsning av celler.
Klassiskt bedömning av spermiernas kvalitet är en subjektiv analys baserat på bedömning av koncentration och andelen motilitet, som kan producera variabilitet på resultaten. Men ger ett datoriserat system snabb, korrekt och kvantitativa mätningar av motilitet parametrar. Detta objektiv analys ger en stor mängd data och minskar variationen i resultat34,35,36,37. Svaret av spermier motilitet beteende beror på temperaturen av analysen och varierar mellan arter38,39,40. Optimal temperatur av spermier analysen kunde ge sperm hastighet och motilitet perioden liknar de naturliga förutsättningarna för reproduktion38,40. Därför förbättrar spermier analys programvara med kylning enheter utvärderingen av fisk spermiekvalitet.
Resultaten av spermier kvalitetsanalys kunde förbättra kunskapen om fisk spermier egenskaper och kvalitet baserat på spermier subpopulations, som kan vara framtiden för spermier utvärdering i alla djurarter41,42. På en praktisk nivå, denna teknik kan vara en indikator på hög kvalitet uppfödare och hjälper till att få mer information om spermier urvalsprocessen, nyskapande doser beräkning för artificiell insemination, spermier konkurrensen baserat på hastighet och progressivitet och potentiella fertilitet. All denna kunskap kan tillämpas på olika forskningsområden inklusive vattenbruk och bevarande program, som stimulerade intresset för fisk spermier lagring och frysförvaring i sista årtionden2,13. Toxikologiska effekter får också särskilt intresse på grund av miljöproblem, samt studier utvecklingen av phylogenetical studier baserade på spermier motilitet egenskaper43,44.
Detta arbete har visat hur optimering av en automatisk programvara för fisk spermier motilitet analys förbättrar resultaten. Standardisering av protokollet måste ta hänsyn till temperaturen av analys och bildrutehastigheten, som kan vara olika beroende på Art. Analysen av fisk spermiernas rörlighet har dock två kritiska steg att forskaren bör uppmärksamma. Spermier collection är ett första viktigt steg som kan förstöra provet på grund av föroreningar av avföring, urin och vatten (havsvatten eller sötvatten). Den andra kritiska punkten är associerade med spermier aktiveringsögonblicket och början av videoinspelningar. Detta steg bör göras så snart som möjligt att samla in data när spermier har kraftig rörelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta projekt har beviljats medel från föreningen kostnaden (mat och jordbruk kostnad åtgärd FA1205: AQUAGAMETE och Europeiska unionens programmet Horisont 2020 forskning och innovation under Marie Sklodowska-Curie projektet IMPRESS (GA nr 642893). Vi vill tacka den vetenskapliga teamet av PROiSER, särskilt till studenten Alberto Vendrell Bernabéu, för hans aktiva deltagande i videoinspelningen av detta projekt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Chorionic Gonadotropin | Argent Chemical Laboratories | hCG | Hormone |
| Benzocaine | Merck | E1501 Sigma | Anesthesia |
| sodium bicarbonate | Merck | S5761 Sigma | P1 medium |
| sodium chloride | Merck | 1.06406 EMD Millipore | P1 medium |
| magnesium chloride | Merck | 1374248 USP | P1 medium |
| potassium chloride | Merck | P3911-500G | P1 medium |
| calcium chloride | Merck | C7902-500G | P1 medium |
| commercial salt | Aqua Medic | Meersalz | Activator solution |
| BSA | Merck | 05470 Sigma | Activator solution |
| Falcon tubes 15 ml | Merck | T1943-1000EA | |
| Falcon tubes support | Merck | R5651-5EA | |
| Eppendorfs | Merck | T9661-1000EA | |
| Micropipet 20 µl | Gilson | PIPETMAN® Classic | |
| Micropipet 10 µl | Merck | Z683787-1EA | |
| Tips for micropipets 20 µl | Merck | Z740030-1000EA | |
| Tips for micropipets 10 µl | Merck | Z740028-2000EA | |
| Spermtrack | PROiSER | Counting chamber | |
| TruMorph | PROiSER | TruMorph | |
| Microscope UB 200i Serie | PROiSER | Microscope | |
| Cooler plate | PROiSER | Prototype | |
| Cooler block | PROiSER | Prototype | |
| ISAS v1 | PROiSER | ISAS | Software |
References
- Kime, D. E., et al. Use of computer-assisted sperm analysis (CASA) for monitoring the effects of pollution on sperm quality of fish; application to the effects of heavy metals. Aquatic Toxicology. 36, 223-237 (1996).
- Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Toxicology & Pharmacology. 130, 425-433 (2001).
- Bobe, J., Labbé, C. Egg and sperm quality in fish. General and Comparative Endocrinology. 165, 535-548 (2010).
- Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish. Aquaculture. 234, 1-28 (2004).
- Bekkevold, D., Hansen, M. M., Loeschcke, V. Male reproductive competition in spawning aggregations of cod (Gadus morhua, L.). Molecular Ecology. 11, 91-102 (2002).
- Chong, A. P., Walters, C. A., Weinrieb, S. A. The neglected laboratory test: the semen analysis. Journal of Andrology. 4, 280-282 (1983).
- Overstreet, J. W., Katz, D. F., Hanson, F. W., Fonesca, J. R. Laboratory tests for human male reproductive risk assessment. Teratogenesis, Carcinogenesis, and Mutagenesis. 4, 67-82 (1984).
- Gallego, V., et al. Standardization of European eel (Anguilla anguilla) sperm motility evaluation by CASA software. Theriogenology. 79, 1034-1040 (2013).
- Fauvel, C., Suquet, M., Cosson, J. Evaluation of fish sperm quality. Journal of Applied Ichthyology. 26, 636-643 (2010).
- Mortimer, S. T., Schoëvaërt, D., Swan, M. A., Mortimer, D. Quantitative observations of flagellar motility of capacitating human spermatozoa. Human Reproduction. 12, 1006-1012 (1997).
- Bompart, D., et al. CASA-Mot technology: How results are affected by the frame rate and counting chamber. Reproduction, Fertility and Development. , (2018).
- Vladić, T., Järvi, T. Sperm motility and fertilization time span in Atlantic salmon and brown trout - the effect of water temperature. Journal of Fish Biology. 50, 1088-1093 (1997).
- Rurangwa, E., Volckaert, F. A. M., Huyskens, G., Kime, D. E., Ollevier, F. Quality control of refrigerated and cryopreserved semen using computer-assisted sperm analysis (CASA), viable staining and standardizes fertilisation in African catfish (Clarias gariepinus). Theriogenology. 55, 751-769 (2001).
- Cosson, J., et al. Marine fish spermatozoa: racing ephemeral swimmers. Reproduction. 136, 277-294 (2008).
- Castellini, C., Dal Bosco, A., Ruggeri, S., Collodel, G. What is the best frame rate for evaluation of sperm motility in different species by computer-assisted sperm analysis? Fertility and Sterility. 96, 24-27 (2011).
- Soler, C., et al. A holographic solution for sperm motility analysis in boar samples. Effect of counting chamber depth. Reproduction, Fertility and Development. , (2018).
- Elliot, F. I., Sherman, J. K., Elliot, E. J., Sullivan, J. J. A photo method of measuring sperm motility. Journal of Animal Science. 37, 310 (1973).
- Katz, D. F., Dott, H. M. Methods of measuring swimming speed of spermatozoa. Journal of Reproduction and Fertility. 45, 263-272 (1975).
- Liu, Y. T., Warme, P. K. Computerized evaluation of sperm cell motility. Computers and Biomedical Research. 10, 127-138 (1977).
- Jecht, E. W., Russo, J. J. A system for the quantitative analysis of human sperm motility. Andrologia. 5, 215-221 (1973).
- Holt, W. V., Palomo, M. J. Optimization of a continuous real-time computerized semen analysis system for ram sperm motility assessment, and evaluation of four methods of semen preparation. Reproduction, Fertility and Development. 8, 219-230 (1996).
- Stephens, D. T., Hickman, R., Hoskins, D. D. Description, validation, and performance characteristics of a new computer-automated sperm motility analysis system. Biology of Reproduction. 38, 577-586 (1988).
- Mortimer, D., Goel, N., Shu, M. A. Evaluation of the CellSoft automated semen analysis system in a routine laboratory setting. Fertility and Sterility. 50, 960-968 (1988).
- Mortimer, S. T., Swan, M. A. Kinematics of capacitating human spermatozoa analysed at 60 Hz. Human Reproduction. 10, 873-879 (1995).
- Holt, W. V., O'Brien, J., Abaigar, T. Applications and interpretation of computer-assisted sperm analyses and sperm sorting methods in assisted breeding and comparative research. Reproduction, Fertility and Development. 19, 709-718 (2007).
- Gill, H. Y., Van Arsdalen, K., Hypolote, J., Levin, R., Ruzich, J. Comparative study of two computerized semen motility analyzers. Andrologia. 20, 433-440 (1988).
- Jasko, D. J., Lein, D. H., Foote, R. H. A comparison of two computer-assisted semen analysis instruments for the evaluation of sperm motion characteristics in the stallion. Journal of Andrology. 11, 453-459 (1990).
- Vantman, D., Koukoulis, G., Dennison, L., Zinaman, M., Sherins, R. Computer-assisted semen analysis: Evaluation of method and assessment of the influence of sperm concentration on linear velocity determination. Fertility and Sterility. 49, 510-515 (1988).
- Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Toxicology & Pharmacology. 130, 425-433 (2001).
- Scherr, T., et al. Microfluidics and numerical simulation as methods for standardization of zebrafish sperm cell activation. Biomedical Microdevices. 17, 65-75 (2015).
- Mortimer, S. T., Swan, M. A. Effect of image sampling frequency on established and smoothing-independent kinematic values of capacitating human spermatozoa. Human Reproduction. 14, 997-1004 (1999).
- Hoogewijs, M. K., et al. Influence of counting chamber type on CASA outcomes of equine semen analysis. Equine Veterinary Journal. 44, 542-549 (2012).
- Soler, C., et al. Effect of counting chamber on seminal parameters, analyzing with the ISASv1®. Revista Internacional de Andrología. 10, 132-138 (2012).
- Didion, B. A. Computer-assisted semen analysis and its utility for profiling boar semen samples. Theriogenology. 70, 1374-1376 (2008).
- David, G., Serres, C., Jouannet, P. Kinematics of human spermatozoa. Gamete Research. 4, 83-95 (1981).
- Björndahl, L. What is normal semen quality? On the use and abuse of reference limits for the interpretation of semen results. Human Fertility (Cambridge). 14, 179-186 (2011).
- Verstegen, J., Iguer-ouada, M., Onclin, K. Computer-assisted semen analyzers in andrology research and veterinary practice. Theriogenology. 57, 149-179 (2002).
- Alavia, S. M. H., Cosson, J. Sperm motility in fishes. I. Effects of temperature and pH: a review. Cell Biology International. 29, 101-110 (2005).
- Islam, M. S., Akhter, T. Tale of Fish Sperm and Factors Affecting Sperm Motility: A Review. Advancements in Life Sciences. 1, 11-19 (2011).
- Dadras, H., et al. Analysis of common carp Cyprinus carpio sperm motility and lipid composition using different in vitro temperatures. Anim. Reprod. Sci. 180, 37-43 (2017).
- Soler, C., García, A., Contell, J., Segervall, J., Sancho, M. Kinematics and subpopulations' structure definition of blue fox (Alopex lagopus) sperm motility using the ISASV1 CASA system. Reproduction in Domestic Animals. 49, 560-567 (2014).
- Vásquez, F., Soler, C., Camps, P., Valverde, A., GarcíaMolina, A. Spermiogram and sperm head morphometry assessed by multivariate cluster analysis results during adolescence (12-18 years) and the effect of varicocele. Asian Journal of Andrology. 18, 824-830 (2016).
- Soler, C., et al. Dog sperm head morphometry: its diversity and evolution. Asian Journal of Andrology. 19, 149-153 (2017).
- Valverde, A., et al. Morphometry and subpopulation structure of Holstein bull spermatozoa: variations in ejaculates and cryopreservation straws. Asian Journal of Andrology. 18, 851-857 (2016).
