Summary
We beschrijven een originele transfer-RNA analyse platform genaamd SPOt (gestroomlijnde Platform voor de waarneming van tRNA). Ter plaatse gelijktijdig maatregelen cellulaire niveaus van alle tRNAs in biologische monsters, in slechts drie stappen en in minder dan 24 uur.
Abstract
Overdracht RNAs (tRNA) zijn overvloedige korte niet-coderende RNA soorten die meestal 76 tot 90 nucleotiden in lengte zijn. tRNAs zijn direct verantwoordelijk voor eiwitsynthese door het vertalen van codonen in mRNA in aminozuur sequenties. tRNAs werden lang beschouwd als huis-keeping moleculen die ontbrak regelgevende taken. Een groeiend lichaam van bewijsmateriaal blijkt evenwel dat cellulaire tRNA niveaus in correspondentie aan wisselende omstandigheden zoals celtype, milieu, en stress schommelen. De schommeling van tRNA meningsuiting beïnvloedt direct gene vertaling, ten gunste van of het onderdrukken van de expressie van bepaalde eiwitten. Uiteindelijk begrijpen de dynamiek van de eiwitsynthese, vereist de ontwikkeling van methoden kunnen leveren kwalitatief hoogwaardige tRNA profielen. De methode die wij hier presenteren heet de plek, die voor gestroomlijnde Platform for Observing tRNA staat. Plek bestaat uit drie stappen beginnen met metabole labeling van celculturen met radioactieve ORTHOFOSFAAT, gevolgd door guanidinium kaliumthiocyanaat-fenol-chloroform extractie van radioactieve totale RNAs en ten slotte hybridisatie op in-house afgedrukt macroarrays. tRNA niveaus worden geschat door het kwantificeren van de intensiteiten van de radioactiviteit op elke plek van de sonde. In het protocol hier gepresenteerde profileren we tRNAs in Mycobacterium smegmatis mc2155, een nonpathogenic bacterie vaak gebruikt als een modelorganisme bij het bestuderen van tuberculose.
Introduction
Cellulaire tRNA niveaus schommelen volgens voorwaarden zoals celtype, milieu en stress1,2,3. Plek, gestroomlijnde Platform voor de waarneming van tRNA, is een origineel, betrouwbaar, en eenvoudige techniek waarmee snelle en precieze kwantificering van transfer-RNA niveaus in laboratorium gekweekte organismen.
tRNAs zijn opmerkelijk stabiel secundaire en tertiaire structuren4. Talrijke post-transcriptional wijzigingen5worden deze ook weergegeven. Deze eigenschappen vertegenwoordigen aanzienlijke structurele en volgorde wegblokkades vertekenende of soms voorkomen van directe en reproduceerbare tRNA profielen met behulp van standaard benchmark RNA kwantificering technieken6. Onderzoeksgroepen over de hele wereld werden gedwongen om creatief, maar vaak ingewikkelde technieken om te evalueren van de cellulaire tRNA niveaus te ontwikkelen. Enkele van deze methoden omvatten: (1) twee-dimensionale elektroforetische scheiding van metabolisch gelabelde tRNAs gecombineerd met methodische plek toewijzing door noordelijke vlek1; (2) individuele kwantificering door Noord vlek met behulp van zorgvuldig gestandaardiseerde radioactieve DNA sondes7; (3) na extractie labelen met cyanine fluorochromes gevolgd door microarray analyse3, en (4) in vitro strippen van tRNA wijzigingen met behulp van recombinant demodification enzymen gecombineerd met omgekeerde transcriptie en de daaropvolgende High-throughput sequencing8.
Plek is een eenvoudige en originele combinatie van twee standaard en ongecompliceerd methoden: (1) RNA lichaam etikettering, die in de synthese bestaat, in het kweken van organismen, van radioactieve totale RNAs en tRNA (2) macroarrays, een systematische en verkleinde genomic tool geoptimaliseerd voor tRNA segregatie.
Monsters worden naar het platform van de kwantificering van levende organismen gestroomlijnd. Ze direct na extractie worden geanalyseerd en niet verwerkt geen verdere waardoor vooroordelen ten opzichte van technieken waarvoor na extractie versterking of enzymatische behandelingen aanzienlijk wordt beperkt. SPOt is veelzijdig en gemakkelijk kan worden gecombineerd tot Polysoom fractionering te identificeren en kwantificeren van tRNA subpopulaties die fysiek verbonden met het vertalen van ribosomen zijn.
Het protocol hier gepresenteerd is geoptimaliseerd voor Mycobacterium smegmatis, en het werd ook met succes gebruikt om profiel tRNAs in Escherichia coli9, Saccharomyces cerevisiae10muis en menselijke celculturen11 .
Protocol
1. cultuur en metabole labelen
- Zak eens het centrum van het GLB van een steriele 1,5 mL micro-centrifuge buizen met een 18-gauge naald om goede beluchting. Inoculeer 500 µL van aangevuld steriele 7H 9 bouillon met 5 µL van M. smegmatis van een starter cultuur geteeld overnachting12.
Opmerking: Het recept voor een liter van 7H 9 Bouillon is: 4,7 g commerciële 7H 9 poeder, 2 mL Glycerol, 1 mL Tween 80, 0,85 g NaCl, 5 g albumine, 2 g Dextrose, H2O (om totale volume aan 1 L).- (Let op) Spike volgens standaard stralingsbescherming praktijken, de voedingsbodems met 20 µCi/mL [32P] Na2HPO4. Groeien bacteriën bij 37 ° C en 1200 rpm agitatie, in een shaker incubator geplaatst achter een 9-mm dik acryl schild.
- Midlog fase (O.D.600 nm ~ 0,5), de hele cultuur overbrengen in een buis 2 mL schroef-cap- and -pellet radioactieve bacteriën bij kamertemperatuur door centrifugeren voor 2 min op 10.000 x g. verzamelen supernatant met designated radioactieve ORTHOFOSFAAT in geschikte afvalcontainer.
2. voorbereiding van de totale RNAs
Opmerking: Totale RNAs worden geëxtraheerd uit bacteriële pellets waarbij een commerciële RNA extractie reagens gebruikt wordt (met guanidinium thiocyanaat, fenol en chloroform) volgens protocol van de fabrikant.
- Voeg 1 mL commerciële RNA extractie reagens en ongeveer 200 µL van glaskralen op de pellet. Dop van de tube veilig en verstoren de bacteriële in een homogenizer voor 2 min onder maximale agitatie, (nummer vijf op de gekozen instrument instellen (Zie de Tabel van materialen)).
- Centrifuge monster bij 12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Het supernatant overbrengen in een nieuwe 2-mL-buis en gooi de kralen op de juiste manier. Voeg 0,2 mL chloroform en schud krachtig buis met de hand voor 15 s. Centrifuge op 12.000 x g gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C.
- De waterige fase van het monster in een nieuwe buis verzamelen door de buis 45 ° hengelen. Vermijd de interfase of organische laag tekenen. Voeg 2 µL van gekleurde neerslaande en 0,5 mL voor 100% isopropanol. Schud de buis krachtig met de hand voor 5 s. Centrifuge op 12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4° C.
- De bovendrijvende vloeistof verwijderen uit de buis en gooi het naar behoren als de vloeibare fractie sporen van radioactiviteit bevatten kan. Lucht droog pellet voor 5 min dan resuspendeer in 200 µL van 2 X saline-Natriumcitraat (SSC), 0,1% (g/v) natrium dodecyl sulfaat (SDS) definitieve.
Opmerking: De samenstelling van voorraad 20 X SSC is 3,0 M NaCl, 0,3 M Natriumcitraat, pH 7.0.
3. bereiding van 96 goed printer platen
Opmerking: tRNA microarrays worden handmatig afgedrukt met veertig twee 70-mer DNA oligonucleotides complementair aan de 3' einde van elke M. smegmatis tRNA (terminal CCA uitgesloten) met behulp van een 8-pins arrayer. De sequenties van de DNA oligonucleotide sondes, alsmede de sonde lay-out in de put-plaat en de array worden geleverd (aanvullende bestand 1 - blad 1 tot en met 3 respectievelijk).
- Design DNA-sondes door eerste ophalen tRNA sequenties of tRNA coderen genen uit tRNA databases zoals de Genomic tRNA Database13. Trim geconserveerde 3' eind CCA als gecodeerd. Omgekeerde aanvulling de resulterende reeks. Volgorde sonde op basis van de eerste 70 nucleotiden.
- Resuspendeer droge DNA-sondes in water. Aanpassen sondes concentratie aan 100 µM. In een 96 goed-plaat, bereiden 120 µL van 50 µM oligos in 3 X SSC, 0,01% (g/v) SDS finale (verdund 60 µL van voorraad sondes in individuele goed met 60 µL van 6 X SSC, 0,01% (g/v) SDS.
- Afdekplaat met aluminiumfolie te voorkomen van verdamping of besmetting, onmiddellijk bevriezen en houden bij-20 ° C totdat het nodig is.
4. array afdrukken
- Ontdooi de 96-wells-plaat bij kamertemperatuur (ongeveer 20 min duurt).
- Amine-gecoat glas dia's van een label met een diamant-pen. Plaatsen van dia's in de indexing-eenheid. Volg de grid posities en Ga als volgt te werk.
- Voorzichtig Dompel de replicator pinnen in de putjes.
- Zachtjes drukken de matrix op de dia van glas, met minimale druk (u zal een kleine weerstand voelt). Doorgaan met afdrukken zonder op te schonen van de arrayer tot afgewerkt met blok A.
- Als u klaar bent om verder te gaan naar het volgende blok, volg de hieronder beschreven procedure voor het wassen.
- Dompel replicator in de 5% bleekwater en voorzichtig schudden.
- Pers replicator in absorberend papier.
- Dompel replicator in het gedestilleerd water, voorzichtig schudden en druk in papier. Herhaal deze stap eenmaal.
- Dompel replicator in isopropanol, zachtjes schudden en druk in het papier.
- Droog de replicator op de ventilator voor ongeveer 20 s voordat u naar het volgende blok van de 96-wells-plaat. Gewenste aantal afdrukken blijven.
- Laat de dia's te drogen dan dwarslijn de oligos naar de dia met behulp van een 254-nm UV-crosslinker.
- Stel het energieniveau op 999,990 µJ/cm2.
- Het gezicht van de dia's opgemaakt op een schoon oppervlak in de crosslinker. Druk op "start".
- Het blokkeren van de arrays overnachting in 450 mL oplossing op een magneetroerder, bij kamertemperatuur en onder traag agitatie blokkeren. Verzamelen en hergebruiken van blokkerende oplossing tot vier keer.
Opmerking: Het recept voor de blokkerende oplossing is: 125 mM fosfaatbuffer (NaH2PO4na2HPO4-) pH 7,2, 2,25% SDS (w/v), 0,5 mM EDTA 0.5 X SSC, 1% BSA (w/v). - Het wassen van de dia's 2 keer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur in 500 mL gedestilleerd water. Droog de dia's door centrifugeren voor 10 s bij kamertemperatuur in een microarray centrifuge. Winkel arrays op een droge en donkere plaats voor maximaal 6 maanden.
5. array hybridisatie
- Voorafgaand aan de hybridisatie dia's in kokend water spoelen en drogen door middel van centrifugeren (zoals in 4.6).
- Matrix plaatsen in een kruising cassette en laden radiolabeled RNA monster.
- Het geautomatiseerde hybridisatie-wassen-station voor maximale reproduceerbaarheid worden uitgevoerd.
- Programmastappen als volgt. Voorwaarde pakkingen voor 2 min op 75 ° C. Introduceren van sonde bij 60 ° C.
Denatureren sondes en monsters 5 min op 90 ° C. Kruisen van de monsters gedurende 3 uur bij 60 ° C.- Wassen van de dia's bij 50 ° C tweemaal met 2 X SSC, 0,1% (g/v) SDS, flow 10 s en houd 20 s. Wash dia's bij 42 ° C tweemaal met 0,1 X SSC, 0,1% SDS, flow 10 s en houd 20 s. Wash dia's bij 42 ° C tweemaal met 0,1 X SSC , flow 10 s en ruim 20 s.
- Programmastappen als volgt. Voorwaarde pakkingen voor 2 min op 75 ° C. Introduceren van sonde bij 60 ° C.
- Droge dia's door middel van centrifugeren (zoals in 4.6).
6. array kwantificering
- Wikkel dia's met behulp van een dunne plastic folie. Dia's voor radioactieve signaal met een geigerteller op de meest gevoelige instelling controleren. Dia's op een scherm fosfor opslag in een cassette blootstelling bij kamertemperatuur gedurende 10 tot 90 uur afhankelijk van signaalsterkte bloot.
Opmerking: Als gevoeligheid van Geigertellers variëren van één instrument naar het andere, belichtingstijden moeten worden geoptimaliseerd empirisch. - Scannen dia op 50 µm resolutie met behulp van een phosphorimager. Kwantificeren en achtergrond-aftrekken radioactiviteit intensiteiten op elke plek van de sonde met behulp van de gratis Image J software opgewaardeerd met een microarray profiler.
- Organiseren en verwerken van gegevens met behulp van een elektronische spreadsheet. Het genereren van warmte kaarten met behulp van het hulpprogramma voor voorwaardelijke opmaak. Vertegenwoordigt bijvoorbeeld elke sonde signaal als een breuk (uitgedrukt in ‰) van het totale sonde signaal.
Representative Results
Drie onafhankelijke biologische repliceert Toon die, onder de voorwaarden van de geteste groei, alle M. smegmatis tRNAs worden uitgedrukt boven achtergrondniveau (Figuur 1). In dit bijzondere experiment, de waargenomen standaarddeviatie voor elke sonde bestaat tussen 2% (Arg (TCT)) en 22% (Cys (GCA)) met een gemiddelde van 5% (Figuur 1). Valse veranderingen tussen de duplo's zijn aanzienlijk beïnvloed door factoren zoals matrix voorbereiding en kruising. Hoge reproduceerbaarheid wordt bereikt door middel van zorgvuldige en consequente array afdrukken evenals geautomatiseerde monster hybridisatie. Er is een 5-fold verschil tussen tRNA Ile (GAT) en tRNA (Val (TAC), de hoogste en laagste overvloedige soorten respectievelijk. Ter plaatse blijkt dat de expressie van tRNA isoacceptors niet uniform. Isoacceptors zijn soorten die houden van de dezelfde aminozuur maar weer verschillende anticodon sequenties en daarom verschillende codonen op mRNAs decoderen. Bijvoorbeeld, alle Alanine isoacceptors worden uitgedrukt op een vergelijkbaar niveau, terwijl de hoogste en laagste Arginine accepteren tRNAs door 3 katernen verschillen.
Figuur 1: vertegenwoordiger tRNA macroarray resultaten. (A) Scanned bacteriële, muis en menselijke macroarrays. M. smegmatis arrays gebruiken slechts 43 sondes in plaats van 48 voor muis en mens. Dientengevolge wordt de bacteriële matrix weergegeven 40 lege plekken (sondes worden gerepliceerd achtmaal op elk van de matrices) dat met de achtergrond mengen. De meeste van hen zijn geclusterd in de hogere linkerhoek. (B) Histogram en heatmap representaties van tRNA profielen in M. smegmatis onder optimale groei omstandigheden. Sonde signalen zijn het gemiddelde van drie onafhankelijke experimenten (met inbegrip van bacteriële groei, metabole labeling, extractie en matrix hybridisatie) en worden uitgedrukt per duizend waarden van de totale tRNAs. Standaarddeviaties liggen voor de drie replicatieonderzoeken worden respectievelijk aangeduid als foutbalken en tinten van Oranje op het histogram en de heatmap. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Beta deeltjesemissies zijn bacteriostatische en bactericide agenten14, bekend maar straling in het geteste bereik geen significant effect op de geschiktheid van de cel hebben. Scintillatie tellen toonde aan dat de radioactiviteit in 25% van de totaal-cel extracten en vervolgens 1% van gezuiverde totale RNAs wordt opgenomen.
De sondes identiek maten, vergelijkbare smelttemperatuur en GC inhoud, samen met een uniform protocol voor het spotten van de macroarray, hybridisatie en kwantificering voorziet onbevooroordeelde meting van tRNA niveaus rechtstreeks vanuit plek signalen.
Plek is reproduceerbaar zijn en specifieke. Zijn groot dynamisch bereik en makkelijk instelbaar drempel kunt profilering lage overvloedige soorten, zoals tRNAs gekoppeld aan polysomes, simpelweg door het verlengen van matrix blootstelling keer9. Na de initiële investering voor de benodigde apparatuur, het verloop kost per monster, met inbegrip van verbruiksgoederen, gemiddeld $15 per monsters.
Plek is van toepassing op elk organisme waarvan genoom beschikbaar voor sonde ontwerp is. Modelorganismen die worden gekweekt in vitro zijn ideale kandidaten voor het labelen van metabole. Zoals zoogdieren genoom coderen vaak vele isodecoders (tRNAs die delen van identieke anticodons maar weer kleine verschillen in hun lichaam sequenties) moeten sondes gedeeltelijk gedegenereerd voor het behoud van homogene hybridisatie nauwe tRNA-soorten. Ten slotte opbrengst aanhangend zoogdiercellen doorgaans lagere bedragen van de totale RNA in vergelijking met organismen gegroeid in suspensie zoals M. smegmatis, dus culturen moeten aanzienlijk worden opgeschaald.
Disclosures
Geen belangenconflict verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door een subsidie van de SC INBRE van het nationale Institute of General Medical Science - NIH (P20GM103499 naar R.G.) en grants CA555536 en CA154664 van het National Cancer Institute te P.H.H. Dit programma was deels gesteund door een subsidie naar het College van Charleston van het Howard Hughes Medical Institute via de pre college & Undergraduate Science Education Program en door subsidies van het National Center voor onderzoeksmiddelen (5 P20 RR016461) en het National Institute of General Medical Sciences (8 P20 GM103499) van de National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass slide indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 470 | |
| Glass slide arrayer replicator | V&P Scientific, Inc. | VP 478 | |
| 96 well microplate indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 472 | |
| Wash and blot station | V&P Scientific, Inc. | VP 475 | |
| Replicator pin dryer | V&P Scientific, Inc. | VP 474 | |
| Amine coated slides | Molecular Devices | K2615 | |
| Hybridizer / Automated hybridization and washing station | Digilab | Hyb10022 | |
| Shaker incubator | Eppendorf Themomixer | 05-400-200 | |
| Screw cap 2 ml tubes | Thermo Scientific | 21-403-201 | |
| [32P] Na2HPO4 | Perkin Elmer | NEX011001MC | |
| Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (Trizol) | Invitrogen | 15596026 | |
| 0.5 mm glass beads | Research Products International Corp. | 9831 | |
| Mini bead mill | VWR | 25-020 | |
| Storage phosphore screen | Fujifilm | BAS-IP SR 0813 | |
| Phosphorimager | GE Healthcare | Typhoon FLA7000 | |
| DNA oligonucleotides | IDT | N/A | |
| UV crosslinker | Spectroline | Select series 254 nm | |
| Microarray centrifuge | Arrayit Corporation | MHC110V | |
| Mycobacterium smegmatis | ATCC | 700084 | |
| Single-use needles | BD (Becton Dickinson) | 305185 | |
| 2 ml centrifuge tube | Fisherbrand | 14-666-317 | |
| Precipitant (GlucoBlue) | Invitrogen | AM9516 | |
| 7H9 broth | Difco | 271310 | |
| Chloroform | Fisher Chemicals | C298-500 | |
| Isopropanol | Fisher Chemicals | A451-4 | |
| 20 X SSC | Lonza | 51205 | |
| SDS | Fisher Bioreagents | BP166-100 | |
| hybridisation cassette | GE Healthcare | 63-0035-44 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Tween 80 | Amresco | M126-100ML | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Albumin | Spectrum Chemicals | A3611 | |
| Dextrose | Fisher Chemicals | D16-1 | |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic Acid) | Fisher Bioreagents | BP2482-500 | |
| 0.5 M Phosphate buffer pH 7.2 | Alfa Aesar | AAJ63974AP |
References
- Emilsson, V., Kurland, C. G. Growth rate dependence of transfer RNA abundance in Escherichia coli. EMBO J. 9 (13), 4359-4366 (1990).
- Dittmar, K. A., Goodenbour, J. M., Pan, T. Tissue-specific differences in human transfer RNA expression. PLoS Genet. 2 (12), e221 (2006).
- Pavon-Eternod, M., Gomes, S., Geslain, R., Dai, Q., Rosner, M. R., Pan, T. tRNA over-expression in breast cancer and functional consequences. Nucleic Acids Res. 37 (21), 7268-7280 (2009).
- Giegé, R., Jühling, F., Pütz, J., Stadler, P., Sauter, C., Florentz, C. Structure of transfer RNAs: similarity and variability. Wiley Interdiscip Rev RNA. 3 (1), 37-61 (2012).
- Machnicka, M. A., Olchowik, A., Grosjean, H., Bujnicki, J. M. Distribution and frequencies of post-transcriptional modifications in tRNAs. RNA Biol. 11 (12), 1619-1629 (2014).
- Torres, A. G., Piñeyro, D., Rodríguez-Escribà, M., Camacho, N., Reina, O., Saint-Léger, A., Filonava, L., Batlle, E., Ribas de Pouplana, L. Inosine modifications in human tRNAs are incorporated at the precursor tRNA level. Nucleic Acids Res. 43 (10), 5145-5157 (2015).
- Cognat, V., Deragon, J. M., Vinogradova, E., Salinas, T., Remacle, C., Maréchal-Drouard, L. On the evolution and expression of Chlamydomonas reinhardtii nucleus-encoded transfer RNA genes. Genetics. 179 (1), 113-123 (2008).
- Zheng, G., Qin, Y., Clark, W. C., Dai, Q., Yi, C., He, C., et al. Efficient and quantitative high-throughput tRNA sequencing. Nat Methods. 12 (9), 835-837 (2015).
- Grelet, S., McShane, A., Hok, E., Tomberlin, J., Howe, P. H., Geslain, R. SPOt: A novel and streamlined microarray platform for observing cellular tRNA levels. PLoS One. 12 (5), e0177939 (2017).
- Eriani, G., Karam, J., Jacinto, J., Morris Richard, E., Geslain, R. MIST, a Novel Approach to Reveal Hidden Substrate Specificity in Aminoacyl-tRNA Synthetases. PLoS One. 10 (6), e0130042 (2015).
- Grelet, S., McShane, A., Geslain, R., Howe, P. H. Pleiotropic Roles of Non-Coding RNAs in TGF-β-Mediated Epithelial-Mesenchymal Transition and Their Functions in Tumor Progression. Cancers. 9 (7), (2017).
- Belanger, A. E., Hatfull, G. F. Exponential-phase glycogen recycling is essential for growth of Mycobacterium smegmatis. J Bacteriol. 181 (21), 6670-6678 (1999).
- Chan, P. P., Lowe, T. M. GtRNAdb: A database of transfer RNA genes detected in genomic sequence. Nucl. Acids Res. 37 (Database issue), D93-D97 (2009).
- Schmidt, C. F. The Effect of Radioactive Phosphorus upon a Suspension of Escherichia coli. J Bacteriol. 55 (5), 705-710 (1948).
