Questo metodo descrive la clonazione, espressione e purificazione di Nsa1 ricombinante per determinazione strutturale di cristallografia a raggi x e small-angle x-ray scattering (SAXS) ed è applicabile per l'analisi strutturale di ibrido di altre proteine che contiene sia ordinato e disordinati domini.
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Articolo metodologico
Combinando la cristallografia a raggi x con piccolo angolo x-ray Scattering per modellare le regioni non strutturate di Nsa1 da S. Cerevisiae
In questo articolo
Sommario
Abstract
Determinazione della struttura Full-Length del fattore di assemblaggio del ribosoma Nsa1 da Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) è impegnativo a causa della disordinata e proteasi labile C-terminale della proteina. Questo manoscritto descrive i metodi per purificare ricombinante Nsa1 da S. cerevisiae per l'analisi strutturale di cristallografia a raggi x sia SAXS. Cristallografia a raggi x è stato utilizzato per risolvere la struttura del dominio N-terminale WD40 ben ordinato di Nsa1, e poi SAXS è stato utilizzato per risolvere la struttura del C-terminale di Nsa1 in soluzione. Dati di scattering di soluzione è stato raccolto da Full-Length Nsa1 in soluzione. Le ampiezze di scattering teorici sono state calcolate dalla struttura di cristallo ad alta risoluzione del dominio WD40, e poi una combinazione di corpo rigido e ab-initio modellazione ha rivelato il C-terminale di Nsa1. Attraverso questo approccio ibrido è stata ricostruita la struttura quaternaria della proteina intera. I metodi presentati qui dovrebbero essere generalmente applicabili per la determinazione strutturale di ibrido di altre proteine composta da un mix di domini strutturati e non strutturati.
Introduzione
I ribosomi sono macchine di grande ribonucleoproteina che svolgono il ruolo essenziale di tradurre mRNA in proteine in tutte le cellule viventi. I ribosomi sono composti da due subunità che sono prodotte in un processo complesso chiamato ribosoma biogenesi1,2,3,4. Assemblaggio del ribosoma eucariotico si basa sull'aiuto di centinaia di assemblaggio ribosomal essenziali fattori2,3,5. Nsa1 (Nop7 associato 1) è un fattore di assemblaggio ribosoma eucar....
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Protocollo
1. recombinant della proteina produzione e purificazione del Nsa 1
- Nsa1 Expression Design di plasmide e clonazione
- Ottenere o acquistare DNA genomic di S. cerevisiae .
- PCR amplificano le sequenze bersaglio di Nsa1 (Nsa1FL, residui 1-463) e C-terminale troncato Nsa1 (Nsa1ΔC, residui 1-434) con appositi primer usando il DNA genomic isolato da S. cerevisiae e una temperatura di fusione circa 60 ° C con un tempo di estensione di 1-2 min. Per amplificare Nsa1 sono stati utilizzati i seguenti primer:
SC_Nsa1_FLFw:CGCCAAAGGCCTATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGTGGATAG
SC_Nsa1_FLRv:AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTTGCTTTTCTTA....
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Risultati
Nsa1 era PCR amplificati da DNA genomic di S. cerevisiae e subclonato in un vettore contenente un tag di affinità di 6 x-istidina N-terminale seguito da MBP e un sito di proteasi TEV. Nsa1 fu trasformato in cellule di e. coli BL21 (DE3) e alti rendimenti dell'espressione della proteina sono stati ottenuti dopo induzione con IPTG e crescita a 25 ° C durante la notte (Figura 1A). Nsa1 è stato purificato per affinità su resina di affinità immob.......
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Discussione
Usando questo protocollo, ricombinante Nsa1 da S. cerevisiae è stato generato per studi strutturali di cristallografia a raggi x sia SAXS. Nsa1 era ben educati in soluzione e cristallizzato in diverse forme cristalline. Durante l'ottimizzazione di questi cristalli, è stato scoperto che il C-terminale di Nsa1 era sensibile alla degradazione della proteasi. L'alta risoluzione, forma cristallina ortorombica solo potrebbe essere duplicato con varianti di troncamento di C-terminale di Nsa1, probabilmente perché il C-.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Dati di diffrazione sono stati raccolti a sud-est squadra regionale a accesso collaborativo (SER-CAT) ID-22 e 22-BM beamlines presso Advanced Photon fonte (APS), Argonne National Laboratory. I dati SAXS è stato raccolto sulle Sibille beamline presso Advance Light Source (ALS), Lawrence Berkeley National Laboratory. Vorremmo ringraziare il personale presso la beamline Sibille per il loro aiuto con elaborazione e raccolta dei dati remota. Siamo grati alla ricerca di spettrometria di massa National Institute di Environmental Health Sciences (NIEHS) e gruppo di sostegno per aiuto per determinare i limiti del dominio della proteina. Questo lavoro è stato supportato da noi ....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Molecular Cloning of Nsa1 | |||
| pMBP2 parallel vector | Sheffield et al, Protein Expression and Purification 15, 34-39 (1999) | Abbiamo utilizzato una versione modificata di pMBP2 che includeva un DNA genomico N-terminale His-tag (pHMBP) | |
| S. cerevisiae | ATCC | 204508D-5 | |
| Primers for cloning Nsa1 | |||
| SC_Nsa1_FLFw | IDT | CGC CAA AGG CCT ATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGTGTGT GGATAG | |
| SC_Nsa1_FLRv | IDT | AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTT GCTTTTTTACTGGCTTTAGAAGC AGC | |
| SC_Nsa1_DeltaCFw | IDT | GGGCGCCATGGGATCCATGAGG TTACTAGTCAGCTGTGTGG | |
| SC_Nsa1_DeltaCRv | IDT | GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC CTTCCTTTTTTTTGCTTCCCCC | |
| Recombinant Protein Production and Purification of Nsa1 | |||
| Escherichia coli BL21 (DE3) Star | Cells Invitrogen | C601003 | |
| pMBP- NSA1 e vari troncamenti | Lo et al., 2017 | ||
| molecolari | della selenometionina | MD12-503B | |
| IPTG, | Promega | V3953 | |
| senza diossano Cocktail di inibitori della proteasi senza EDTA | Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich | 4693159001 | |
| Cloruro di sodio | Caledon Prodotti chimici | di laboratorio 7560-1-80 | |
| Cloruro di magnesio esaidrato | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Tris Buffer, 1 M pH7.5 | KD Medical | RGF-3340 | |
| Glicerolo | Invitrogen | 15514-029 | |
| beta-mercaptoetanolo | Sigma | M6250 | |
| 1M Imidazolo, pH 8.0 | Teknova | I6980-06 | |
| Talon Affinity Resin | Clonetech | 635503 | |
| Filtro centrifugo Amicon Ultra 15 mL (MWCO 10K) | Millipore | UFC901024 | |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 Prep Grade Gel Colonna di filtrazione | GE-Healthcare | 28989335 | |
| proteasi TEV | preparata da NIEHS Protein Expression Core | Expression plasmide fornito da NCI (Tropea et al. Methods Mol Biology, 2009) | |
| 4-15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | BioRad | 456-8056 | |
| Cristallizzazione, Screening proteolitico | |||
| Schermo di cristallo | Hampton Research | HR2-110 | |
| Schermo di cristallo 2 | Hampton Research | HR2-112 | |
| Salt Rx | Hampton Research | HR2-136 | |
| Schermo indice | Hampton Research | HR2-144 | |
| Schermo PEG/Ion | Hampton Research | HR2-139 | |
| JCSG+ | Dimensioni molecolari | MD1-37 | |
| Wizard Precipitant Synergy | Dimensioni molecolari | MD15-PS-T | |
| Swissci 96 pozzetti 3 gocce UVP piastre a goccia | TTP Labtech | 4150-05823 | |
| Nastro sigillante cristallino largo 3 pollici | Hampton Research | HR4-506 | |
| Kit Proti-Ace | Hampton Research | HR2-429 | |
| PEG 1500 | Dimensioni | molecolariMD2-100-6 | |
| PEG 400 | Dimensioni molecolari | MD2-100-3 | |
| HEPES/idrossido di sodio pH 7,5 | Dimensioni molecolari | MD2-011-Citrato | |
| di sodio tribasico | Dimensioni | MD2-100-127 | |
| 22 mm x 0,22 mm Vetrini coprioggetti siliconati | Hampton Research | HR3-231 | |
| Piastre a 24 pozzetti con sigillante (piastra VDX con | Hampton Research | HR3-172 | |
| Anelli in nylon montati da 18 mM (da 0,05 mm a 0,5 mM) | Hampton Research | HR4-945, HR4-947, HR4-970, HR4-971 | |
| Kit di perline per semi | Hampton Research | HR2-320 | |
| Tappi magnetici in cristallo | Hampton Research | HR4-779 | |
| Bacchetta criogenica magnetica | Hampton Research | HR4-729 | |
| Schiuma criogenica Dewar | Hampton Research | HR4-673 | |
| Sistema di dischi in cristallo | MiTeGen | M-CP-111-021 | |
| Gonna intera 96 pozzetti Piastra trasparente | VWR | 10011-228 | |
| Tappetino sigillante AxyMat | VWR | 10011-130 | |
| Equipment | |||
| UVEX-m | JAN Scientific, Inc. | ||
| Spettrofotometro Nanodrop Lite | Thermo-Fisher | ||
| Mosquito Robot | TTP Labtech | ||
| Software/Websites | |||
| HKL2000 | Otwinoski e Minor, 1997 | ||
| Phenix | Adams et al., 2010 | ||
| Coot | Emsley et al., 2010 | ||
| ATSAS | Petoukhov et al., 2012 | https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/ | |
| Scatter | Rambo e Tainer, 2013 | ||
| Pymol | Il sistema di grafica molecolare PyMOL, versione 1.8 Schrö dinger, LLC. | ||
| BUNCH | Petoukhov e Svergun, 2005 | ||
| CRYSOL | Svergun et al, 1995 | ||
| PRIMUS | Konarev et al, 2003 | ||
| EOM | Tria et al, 2015 |
Riferimenti
- Thomson, E., Ferreira-Cerca, S., Hurt, E. Eukaryotic ribosome biogenesis at a glance. J Cell Sci. 126 (Pt 21), 4815-4821 (2013).
- Woolford, J. L. Jr, Baserga, S. J. Ribosome biogenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 195 (3), 643-681 (2013).
- Kressler, D., Hurt, E., Bas....
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Ristampe e permessi
