Summary
Questo protocollo descrive la misura della permeabilità della barriera epiteliale in tempo reale dopo il trattamento farmacologico in organoids intestinale umana utilizzando la microscopia a fluorescenza e microscopia cellulare di vivere.
Abstract
Progressi nella cultura 3D dei tessuti intestinali ottenuti mediante biopsia o generate da cellule staminali pluripotenti tramite differenziazione diretto, hanno portato nei modelli sofisticati in vitro della mucosa intestinale. Sfruttando questi sistemi modello emergenti richiedono adattamento di strumenti e tecniche sviluppate per gli animali e sistemi di coltura 2D. Qui, descriviamo una tecnica per misurare la permeabilità della barriera epiteliale in organoids intestinale umana in tempo reale. Ciò avviene mediante microiniezione di destrano fluorescente etichettati e imaging su un microscopio invertito con filtri epifluorescente. Misura in tempo reale della permeabilità della barriera in organoids intestinale facilita la generazione di dati ad alta risoluzione temporale in tessuto epiteliale intestinale umano, anche se questa tecnica può essere applicata anche al timepoint fisso approcci di imaging. Questo protocollo è facilmente adattabile per la misura della permeabilità di barriera epiteliale dopo l'esposizione ad agenti farmacologici, prodotti batterici o tossine o microrganismi vivi. Con modifiche minori, il presente protocollo può anche servire come un iniettore generale il microinjection dei organoids intestinale e gli utenti possono decidere di integrare questo protocollo con applicazioni a valle aggiuntive o alternative dopo microiniezione.
Introduction
L'epitelio intestinale forma una barriera selettiva che media il trasporto direzionale di nutrienti, H2O, ioni e prodotti di scarto, riducendo al minimo scambio di diffusione-mediata non specifico di altre particelle tra il lume e la mesenchimali del tessuto o sangue alimentazione1,2. La permeabilità non specifica della barriera epiteliale intestinale lungamente è stata considerata un parametro funzionale chiave sia in salute e in malattia3,4,5,6, che riflette il tasso di diffusione di piccole molecole attraverso l'epitelio tramite lo spazio paracellulare. Misura della permeabilità della barriera epiteliale possa essere condotti in modelli animali7 e in pazienti umani8 attraverso l'ingestione di lattulosio, che non ha nessun trasportatore specifico nel tratto gastrointestinale e la successiva raccolta e la misurazione delle concentrazioni di lattulosio nel sangue periferico. Marcatori ingeriti alternativi della funzione di barriera come carboidrati fluorescente contrassegnati sono anche disponibili9,10. Questo approccio è stato adattato per intestinale delle cellule epiteliali colture cresciute su Transwell supporta11, un approccio semplificato che consente un maggiore controllo sperimentale, ma inoltre è stato criticato come un preannunciatore povero di in vivo permeabilità a causa dell'assenza di sottotipi epiteliali differenziate e tessuto struttura12. Utilizzando camere rappresentano ancora un altro approccio e consentire la misurazione della funzione di barriera epiteliale nella mucosa intestinale complesso ex vivo13. Applicazione di questa tecnica è spesso limitata dal tessuto disponibilità e condizione13,14. Sono quindi necessari nuovi metodi che equilibrano la riproducibilità e la velocità effettiva con rilevanza fisiologica.
Recenti sviluppi nell'organogenesi in vitro hanno portato all'adozione di sistemi di coltura del tessuto 3D modello come una sofisticata piattaforma per ricapitolare le dinamiche di tessuti complessi15,16,17 ,18,19,20,21,22,23. In particolare, pluripotenti umane della cellula formativa (hPSC) derivata organoids intestinale umano (HIOs)19,24 sono emersi come sistema modello riproducibile e sperimentalmente trattabili per lo studio delle interazioni ospite-microbiche e barriera epiteliale dinamica25,26,27,28. Analogamente, organoids tessuto-derivato umano (noto anche come enteroids) può essere derivato da una procedura di biopsia semplice e può essere utilizzato come un sistema trattabile per studiare la fisiologia umana e malattia15,29,30. Microiniezione di organoids intestinale umana permette per la consegna di composti sperimentali25 o live microbi25,31,32,33 per l'apicale epiteliale superficie del lume organoid. Leslie e Huang et al. 25 recentemente adattato questa tecnica per misurare la permeabilità della barriera in HIOs microiniettati con isotiocianato di fluorescina (FITC) etichettato destrano dopo esposizione a tossine batteriche.
Questo protocollo è inteso come una guida per la misura della permeabilità della barriera epiteliale in HIOs hPSC-derivato e tessuto-derivato HIOs utilizzando la microscopia a fluorescenza. Con modifiche minori, può anche servire come un iniettore generale il microinjection di HIOs con composti sperimentali. Gli utenti possono integrare questo protocollo con applicazioni aggiuntive o alternative a valle dopo microiniezione.
Protocol
Normale, tessuto intestinale adulto umano de-identificata è stata ottenuta da donatori di organo defunto attraverso il dono della vita, Michigan. Delle cellule di ES umano linea H9 (registro NIH #0062) è stata ottenuta dall'Istituto di ricerca WiCell. Tutto il tessuto umano utilizzato in questo lavoro è stato ottenuto da donatori non-viventi, de-è stato identificato ed è stata condotta con l'approvazione dell'IRB di Università del Michigan (protocollo n # HUM00093465 e HUM00105750).
1. microinjector Setup
- Ottenere i materiali elencati nella Tabella materiali.
- Collocare il micromanipolatore, dissezione scope e sorgente luminosa nella biosicurezza armadio. Pulire l'installazione di microiniezione con etanolo al 70% o altro disinfettante prima dell'uso sperimentale. Evitare l'esposizione prolungata ai disinfettanti a base di candeggina, che può corrodere la strumentazione di microinjection.
Nota: Un esempio di un assemblaggio completo microinjector è illustrato nella Figura 1. - Posizionare l'ambito dissezione in modo che la parte dell'occhio può essere utilizzata attraverso la porta di accesso nello scudo per la biosicurezza.
- In alternativa, è possibile utilizzare un banco pulito con sistema di flusso di aria positiva al posto di una cappa di biosicurezza con punti di accesso del microscopio.
- Assemblare il micromanipolatore sul lato destro del microscopio secondo le istruzioni del produttore e regolare in modo che i controlli possono essere facilmente raggiunto e regolati. Il micromanipolatore dovrebbe essere montato su una piastra di ferro oppure stabilizzati.
Nota: Gli utenti mancini desideri posizionare il micromanipolatore a sinistra dell'ambito per dissezione. - Montare il supporto di una micropipetta al braccio micromanipolatore e collegare il tubo analogico inserendo il titolare di una micropipetta.
- Riempire la siringa di vetro da 10 mL con circa 5-7 mL di olio minerale sterile.
- Collegare la siringa di vetro 10 mL riempita con olio minerale all'estremità aperta del tubo analogico utilizzando il meccanismo di blocco Luer. Posizionare la siringa di vetro a sinistra dell'ambito per dissezione, fronte dal micromanipolatore.
- Premere delicatamente la siringa, spingendo l'olio minerale attraverso il tubo. Circa 10 gocce di olio minerale a filo dalla punta del titolare micropipetta e raccogliere in una capsula di Petri o recipiente simile e scartare.
Nota: Questo passaggio rimuove tutta l'aria dal tubo e deve essere eseguito prima di ogni sessione di microiniezione.
2. preparazione per il microinjection
- 24 h prima microiniezione:
- Preparare soluzione del dextrano FITC sospendendo ri-destrano FITC ad una concentrazione di 2 mg/mL in PBS sterile o soluzione fisiologica. Preparare un volume totale di > 250 µ l.
Nota: Concentrazioni superiori o inferiori di FITC-Destrano possono essere utilizzate, che vanno da circa 0,1 - 10 mg/mL. Regolare la concentrazione di FITC-Destrano per soddisfare a valle l'applicazione di imaging. - Installazione organoid culture su 4 o 8 pozzetti vetrini da camera o altro vaso di coltura adatto per vivono microscopia, con fino a 4-6 HIOs per pozzetto, incorporato nella soluzione di 50 µ l cella matrix e coltivate in EGF, Noggin e R-Spondin (ENR) fattore di crescita media 19 ,24. Prendersi cura per lo spazio il organoids uniformemente (distanza di circa 5 mm) per evitare la cattura di HIOs multipli in un singolo campo microscopico durante l'analisi di formazione immagine in tempo reale. Per una guida completa alla cultura HIO e manutenzione vedere McCraken et al. 24.
Nota: Questo protocollo è stato sviluppato utilizzando cellule staminali derivate HIOs e i risultati rappresentativi (Vedi sotto) dimostrano l'uso di questo modello di coltura del tessuto. Tuttavia, lo stesso protocollo si adatta facilmente a organoids epiteliali intestinali tessuto-derivato15,29. Tessuto-derivato HIOs sono in genere più piccoli di HIOs PSC-derivato e mancanza il supporto mesenchymal basolaterale delle cellule struttura15,29,30. Microiniezione di HIOs tessuto-derivato può richiedono un maggior grado di capacità tecnica ed esperienza. Il grado a cui dati di permeabilità di barriera epiteliale ottenuti utilizzando tessuto-derivato HIOs possono correlare con HIOs hPSC-derivato è sconosciuto. - Incubare HIOs in un'incubatrice di coltura cellulare standard a 42 ° C e 5% di CO2 prima microiniezione.
- Preparare soluzione del dextrano FITC sospendendo ri-destrano FITC ad una concentrazione di 2 mg/mL in PBS sterile o soluzione fisiologica. Preparare un volume totale di > 250 µ l.
- 30 minuti prima di microiniezione, accendere la biosicurezza armadietto e alzare lo scudo di vetro per l'altezza di lavoro ottimale.
- Rimuovere tutti gli elementi inutili dalla cappa di biosicurezza. Disordine aumenta il rischio di cadute o altri incidenti quando si lavora in spazi ristretti.
- Spray e pulire accuratamente la superficie di lavoro con etanolo al 70% o altro disinfettante. Pulire utilizzando un tovagliolo di carta.
- Controllare il livello dell'olio minerale nella siringa di vetro attaccata al microinjector. Se c'è meno di 3 mL di olio minerale restanti, svitare la siringa e riempite nuovamente dentro la cappa di biosicurezza, facendo attenzione ad evitare l'introduzione di bolle. Non riempire più di 7 mL.
- Accendere la lampada per illuminare il campo di applicazione per dissezione. Regolare l'oculare per il comfort personale.
- Posizione il micromanipolatore a destra del campo di applicazione per dissezione. Fissare il micromanipolatore ad una piastra di ferro utilizzando un supporto magnetico. Interruttore magnetico stand sulla posizione OFF per regolare la posizione del micromanipolatore e fissare il supporto alla piastra di ferro impostando il supporto magnetico in posizione on.
- Microcapillary installazione
- Recuperare un filamento di vetro singolo 1 mm dal contenitore di deposito fornito dal produttore.
- Inserire il filamento di vetro attraverso il centro della bobina di rame riscaldamento dell'estrattore della micropipetta.
Nota: Vedere la Figura 2 per una guida alla preparazione la levetta della micropipetta. - Posizionare il filamento in modo che la bobina di rame del riscaldamento è circa a metà il filamento di vetro. Questo farà sì che l'estrattore genera due aghi di microinjection utilizzabile da ogni filamento di vetro.
- Fissare il filamento di vetro con i morsetti avvitando la parte superiore morsetto prima, assicurandosi che il filamento di vetro è protetto all'interno del boschetto dentellato per prevenire rotture.
- Estendere il braccio estrattore in posizione verticale massima prima di serrare il morsetto inferiore.
Nota: Questo passaggio è essenziale. Caso di estendere completamente il braccio estrattore comporterà irregolare separazione delle due sezioni del filamento di vetro. - Controllare le impostazioni per il riscaldamento e tirando il meccanismo.
Nota: La bobina di rame rimarrà estremamente calda per alcuni minuti. Il filamento di vetro tirato verrà essere denominato un 'microcapillary' da questo punto in avanti nel protocollo.
Nota: Il vetro microcapillary è estremamente nitide e molto fragile. Maneggiare con cura.
Nota: Quando si installa il microcapillary sul sistema di microiniezione fare attenzione a non toccare l'estremità affilata. Questo ridurrà la probabilità di contaminazione e preservare il punto di fine per il microinjection. Fallimento per proteggere in modo efficace il microcapillary può causare instabilità o rottura del filamento di vetro durante la microiniezione.
- Posizionare il micromanipolatore in modo tale che il microcapillary è puntato verso il basso nella fase di vetro dell'ambito dissezione senza toccare la superficie.
- Trovare una superficie di plastica sterile (la parte inferiore del coperchio di cottura cultura funziona perfettamente) e posizionarlo sul palco microscopio direttamente sotto l'ago microcapillary sul palco dell'ambito per dissezione.
- Centro la punta di microcapillary sotto l'area di visualizzazione e assicurarsi che sia visibile quando si guarda attraverso l'oculare del microscopio sotto 1,5 ingrandimenti.
- Utilizzando i controlli di micromanipolatore, far avanzare lentamente il braccio di micromanipolatore e microcapillary verso il coperchio di plastica sterile cultura fino a che la punta tocchi appena la superficie di plastica e la punta della microcapillary si libera.
Nota: Obiettivo per il più piccola possibile rottura che consente di flusso del fluido dal filamento di vetro al fine di minimizzare il danno per il HIO durante la microiniezione. - Eseguire microcapillary lontano dalla superficie sterile per minimizzare il rischio di rotture accidentali prima di procedere.
- Verifica la microcapillary per flusso premendo la siringa di vetro, spingendo l'olio minerale attraverso il tubo. Se è stato aperto alla fine del microcapillary vedrete una piccola goccia di olio minerale emergono dalla punta della microcapillary dopo pochi secondi. Se ciò non accade, ripetere il passaggio precedente e ripetere il test.
3. sterile Microinjection
Nota: Una volta che il microcapillary è stato preparato, installato e testato, iniziano microinjecting HIOs. La figura 3 illustra un HIO di tessuto-derivato è stato iniettato con successo con FITC-Destrano.
- Riempire il microcapillary con il materiale di iniezione. Immergere la punta della microcapillary di vetro la sospensione di iniezione del dextrano FITC, facendo attenzione a evitare di rompere la punta del microcapillary contro i lati o il fondo della provetta. Una volta che la punta della microcapillary è immerso nella soluzione, tirare indietro la siringa di olio minerale per attirare circa 10 µ l della sospensione di destrano FITC verso il microcapillary.
Nota: Si consiglia di utilizzare provette da 1,5 mL o 0,5 mL per l'iniezione di soluzioni/culture poiché saranno più facilmente accessibile per il microcapillary installato. In alternativa, iniezione soluzioni si possono trarre da una capsula di Petri sterile o parafilm sterile, che può ridurre la probabilità della ferita di sharps limitando la necessità di contenere un tubo in prossimità della microcapillary. Se la sospensione è altamente viscosa o l'apertura della microcapillary è eccezionalmente piccolo, potrebbe richiedere diversi secondi per riempire il microcapillary. Non disegnare sospensioni microiniezione nel tubo plastica microiniezione come questo potrebbe contaminare il sistema di microiniezione intero. - Smettere di riempire il microcapillary quando la sospensione di microiniezione riempie il 90% della lunghezza del microcapillary vetro. Premere leggermente la siringa prima di ritirare il microcapillary dalla soluzione microiniezione per assicurarsi che la punta della microcapillary non contenga sacche di aria.
Nota: Se l'esame della microcapillary rivela tasche d'aria, svuotare e riempire nuovamente. - Rimuovere le piastre di coltura HIO dall'incubatrice della coltura cellulare e trasferimento per la biosicurezza con il microinjector.
- Rimuovere il coperchio dalla piastra di coltura di HIO all'interno della cappa di biosicurezza e centrare il primo pozzo sul tavolino del microscopio in modo che è chiaramente visibile attraverso l'oculare dell'ambito con l'impostazione di ingrandimento più basso.
- Girare il braccio di micromanipolatore tale che il microcapillary è puntato verso il basso nella cultura HIO bene ad angolo > 45° rispetto allo stage di microscopio. Ciò avviene più facilmente ruotando manualmente il gruppo braccio micromanipolatore sull'asse orizzontale nel punto dove il supporto del braccio orizzontale micromanipolatore incontra il supporto verticale, poiché i controlli bene (quadranti neri) hanno una gamma limitata di movimento. Posizionare la punta del microcapillary sopra la prima cultura bene a circa 1 cm sopra la superficie del supporto (Figura 3A). Un'immagine rappresentativa dimostrando microinjection dei organoids epiteliali intestinali tessuto-derivato è mostrata nella Figura 3B.
- Verifica che sia la punta del filamento di vetro e il HIO(s) sono visibili attraverso l'oculare. Riposizionare se necessario.
- Far avanzare lentamente il microcapillary ruotando in senso orario la manopola di controllo dell'asse z.
Nota: A giudicare la posizione della punta della microcapillary, in particolare la profondità, richiede pratica. Come la punta viola la superficie del supporto, notare una leggera distorsione visiva della punta microcapillary.
Nota: fare attenzione per evitare di riempire eccessivamente il HIO ciò causerebbe la organoid scoppiare. Come regola generale, qualsiasi espansione visibile del volume HIO significa che è il momento di smettere. Il volume medio del lume HIO maturo è di circa 1 µ l, ma può variare significativamente. Automatizzato siringa pompe possono essere utilizzate in sostituzione di una siringa manuale per consentire un controllo accurato del volume iniettato.
- Riempire il microcapillary utilizzando l'approccio descritto in precedenza.
Nota: Se la punta si rompe in qualsiasi punto durante la microiniezione, non tentare di continuare le iniezioni. Cambiare la punta secondo le istruzioni riportate di seguito.
Attenzione: Non maneggiare il microcapillary vicino l'estremità appuntita. Il punto di fine della microcapillary è estremamente forte e sarà facilmente puntura della pelle e guanti. Prestare attenzione ed essere consapevoli di tutti i movimenti, movimentazione microcapillary utilizzando il manipolatore solo e mai mettere le mani tra il punto della microcapillary e le culture HIO. Cercare il trattamento medico immediatamente in caso di un bastone di ferro da un microcapillary contenenti agenti infettivi o tossine.
Nota: In alcuni casi, potrebbe essere difficile da confermare visivamente successo microiniezione di HIO. La visibilità delle sospensioni di microiniezione chiaro può essere migliorata mediante uso di aggiunta di più alte concentrazioni di FITC-Destrano.
4. pharmacological Treatment of HIOs
- Per testare composti consegnati all'epitelio apicale, risospendere in PBS sterile contenente 2 mg/mL FITC-Destrano e microinject nel lumen HIO come indicato sopra (sezione 3). Per l'esperimento rappresentativo, risospendere tossina di Clostridium difficile TcdA a 12,8 ng / µ l in PBS contenente FITC-Destrano.
- Per testare composti consegnati al comparto basolaterale, sostituire i supporti esterni di cultura con i nuovi media contenente 2 mM glicole etilenico-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-acido etilendiamminotetraacetico (EGTA)(positive control), veicolo di PBS da solo (controllo negativo ), o altro composto sperimentale dopo microiniezione di FITC-Destrano.
Nota: Il dosaggio e la tempistica dell'applicazione di composti farmacologici, tossine o altri agenti può variare secondo la questione sperimentale.
5. live Imaging dei Organoids iniettati
- Iniziare dal vivo imaging microiniezione immediatamente seguente. Trasferire le piastre di coltura di un microscopio a fluorescenza dotato di una camera umidificata mantenuta a 37 ° C e 21% O2 e 5% CO2 con una cellula viva automatizzata sistema di imaging. Chiudere la camera ambientale e avviare il processo di imaging.
- Avviare il software di analisi di immagine (ad esempio, softWoRx) dal desktop. Fare clic su "File" e selezionare "Acquire (Resolve 3D)" per inizializzare l'imaging e software di controllo del microscopio.
- Impostata eccitazione/emissione FITC (475 nm eccitazione/523 nm emissione), impostare la potenza di trasmissione al 5% e la lente a 4x. Impostare il tempo di esposizione a 0,025 ms (Figura 4A).
Nota: Il tempo di esposizione dovrebbe essere variata per soddisfare la forza del segnale fluorescente. In generale, il segnale di fluorescenza di FITC solo diminuirà. Quindi, per garantire la massima sensibilità, i tempi di esposizione iniziale dovrebbero essere regolati, tale che il segnale fluorescente registrato è appena sotto il punto di saturazione della fotocamera e software di imaging. - Trovare il HIOs con un ingrandimento 4x utilizzando il controller digitale collegato al microscopio. Centro HIO entro la visualizzazione campo (Figura 4A).
- Fare clic su "Visualizza" sulla barra degli strumenti e selezionare "Punto elenco" per rivelare una nuova finestra. Fare clic su "Punto" per memorizzare la posizione corrente della fase nell'apposito elenco (Figura 4A).
- Ripetere i passaggi 5.4 e 5.5 sono state registrate le posizioni di tutti i HIOs. Utilizzando un blocco note o un record digitale, annotare il numero di ID univoco assegnato a ciascuna posizione programmata microscopia e le immagini catturate in quella posizione. I file di immagine saranno contrassegnati con questo numero di ID e sarà importante associare i numeri di ID di immagine con HIOs e trattamenti specifici al termine della raccolta dei dati.
- Per impostare la raccolta automatizzata di immagine, fare clic su "File" e poi "Esperimento" nella barra degli strumenti. Nome l'esperimento con la data o un altro nome univoco.
- Impostare i parametri per la raccolta di immagini passando attraverso ciascuna delle schede opzione come mostrato in Figura 4B.
- Deseleziona "Z sezionamento" sotto la scheda "Sezionamento".
- Sotto la scheda "Canali", immettere i parametri dalla finestra superiore sinistro "risolvere 3D". Per risparmiare tempo, la prima riga popolerà automaticamente quando la casella a sinistra nella controllata.
- Sotto la scheda ' time-lapse ", selezionare la casella di controllo"Time lapse"e immettere l'intervallo di tempo tra le immagini della riga contrassegnata come"Time-lapse"e la durata totale dell'esperimento della riga contrassegnata come"Tempo totale". Il software calcolerà automaticamente il numero di intervalli di tempo.
- Sotto la scheda "Punti", la casella denominata "Visita punto elenco".
- Sulla barra degli strumenti, selezionare processo seguito dal generatore di attività.
- Nel menu Generatore di attività, è possibile aggiungere file accedendo alla cartella dati specificata in 5.9. Evidenziare tutti i file che terminano in "DV" digitando "*.dv" nel prompt. Seleziona tutto (Ctl + A) e fare clic su "Aggiungi".
- Clicca su + sotto la sezione denominata "Attività". Selezionare "Esporta come..." e fare clic sulla scheda "Opzioni".
- Set "Formato di esportazione" a "Immagini TIFF" e la casella qui sotto per aggiungere un "Custom Output Folder". Questa è la posizione dove verranno esportate le immagini TIFF. Selezionare RGB a 24 bit sotto "Tipo di output TIFF" e fai clic su "Fine".
- Fare clic su "Invia a coda" per eseguire la Macro di esportazione.
Nota: Il tessuto HIO e media può essere conservato per l'istologia34, PCR35), Western blot36, o altre analisi a valle.
6. post-analisi di imaging
- Assicurarsi che ImageJ37 è installato e funziona correttamente sul computer per essere utilizzato per l'analisi.
Nota: Fiji37 è una distribuzione alternativa del programma core ImageJ che funzionerà altrettanto bene per questa analisi. - Avviare l'analisi batch selezionando "Processo" e poi "Batch" e infine "Macro" dal menu di ImageJ.
- Impostare l'ingresso alla directory contenente le immagini TIFF raccolte durante il corso di tempo sperimentale. Aprire il file di macro di ImageJ "thesholdmeasure.ijm" o direttamente copia e incolla il codice di macro nella finestra. Fare clic su "Processo" per iniziare l'elaborazione dei file.
Nota: Il valore di soglia minima x (setThreshold(x,255);) può essere impostata su qualsiasi numero da 0 - 255 e deve essere regolato in modo da eliminare la fluorescenza di fondo. Valori < 100 sono raccomandati. Per determinare empiricamente il valore di soglia appropriata, è possibile eseguire la macro imaging su una singola immagine che rappresenta un organoid con nessun segnale fluorescente. L'intensità media di questa immagine può servire come una guida per impostare la soglia in modo appropriato. Per l'analisi rappresentativa presentate di seguito, la soglia è stata impostata su "42". - ImageJ produrrà una grande tabella che contiene l'area di tutti i pixel all'interno della gamma di intensità di soglia, e la media, mediana, minimo e intensità massima (limite) di valore per l'area entro i limiti di intensità di soglia. Salvare questo come un CSV o XLS.
- Cambiamento di intensità nel corso del tempo può essere computata in un foglio di calcolo39 manipolando la tabella dati per eseguire il calcolo qui sotto o possa essere automatizzati utilizzando un adatto linguaggio di programmazione. Uno script di analisi di esempio scritto in R 40 è dotato di questo manoscritto.
Nota: Per ogni HIO, l'intensità di fluorescenza relativa può essere quantificata come
. Eliminazione tempo 41 (t1/2) quello di FITC-Destrano nel lume HIO è stato calcolato come segue:- In primo luogo, calcolare il "area sotto la curva" (AUC) dalla curva che descrive l'intensità di fluorescenza relativa nel tempo (t) come:
- Quindi, calcolare la "clearance" (
) tasso con il volume di distribuzione (Vd) definito come 1 per la fluorescenza normalizzata a t = 0:
- A questo punto, definire la "costante di velocità di eliminazione" (
) come:
- E infine, calcolare il "tempo di eliminazione" (t1/2) come:
L'equazione ridotta è così:
- In primo luogo, calcolare il "area sotto la curva" (AUC) dalla curva che descrive l'intensità di fluorescenza relativa nel tempo (t) come:
. Eliminazione tempo 41 (t1/2) quello di FITC-Destrano nel lume HIO è stato calcolato come segue:
) tasso con il volume di distribuzione (Vd) definito come 1 per la fluorescenza normalizzata a t = 0:
) come:
Representative Results
HIOs sono stati differenziati da cellule staminali pluripotenti umane e coltivate in soluzione a matrice cellulare come in precedenza descritto19,24. Dopo 4 settimane nella cultura, il HIOs aveva ampliato sufficientemente per consentire per il microinjection. HIOs erano microiniettati con 4 kDa coniugato FITC Destrano sospese in PBS o PBS contenente la tossina di Clostridium difficile TcdA. C. difficile è un agente patogeno opportunistico gastrointestinale che presenta tossicità epiteliale tossina-mediata in HIOs25. Come controllo positivo, EGTA è stato aggiunto al terreno di coltura HIO in un sottoinsieme di HIOs iniettato con PBS e FITC-Destrano. EGTA è un chelante del calcio che causa de-rapida polimerizzazione dell'actina citoscheletrica42. Fluorescenza FITC è stato monitorato in tempo reale su un microscopio di imaging dal vivo all'interno di una camera ambientale controllata e immagini sono state catturate in intervalli di 10 minuti.
Analisi post-hoc dei dati di imaging ha rivelato differenze sostanziali nella conservazione di fluorescenza FITC (Figura 5). HIOs iniettato con PBS conservato quasi tutto il segnale fluorescente presente a t = 0, tuttavia HIOs che inoltre sono stati iniettati con TcdA di trattati con EGTA ha esibito una sostanza diminuzione nell'intensità fluorescente dal post-microinjection 8 ore (Figura 5a). dati di formazione immagine sono stati quantificati per HIOs tutti tutti gli intervalli di tempo generare un dataset ad alta risoluzione che rappresenta la variazione relativa intensità fluorescente nel tempo in ogni condizione sperimentale (figura 5B). Differenze nella permeabilità epiteliale sono state valutate dal calcolo del tempo di media di eliminazione (t1/2 ) di FITC per ciascun gruppo di trattamento (tabella 1) e confrontare le differenze t t 1/2 tra gruppi utilizzo dello studente t-test. Controllo-trattati HIOs mantenuto la maggior parte del segnale fluorescente FITC per più di 16 ore (t1/2 = 17 ± 0,3 h). Trattamento con EGTA riduce significativamente il tempo di eliminazione di FITC-Destrano relativo controllo HIOs (t1/2 = 2,6 ± 0,2 h; P = 1,3 x 10-8). Coerente con risultati precedentemente pubblicati25, microiniezione di TcdA significativamente aumentata permeabilità di barriera epiteliale rispetto al trattamento di controllo (t1/2 = 7,6 ± 0,6 h; P = 5,4 x 10-4). Così, sia esterni (EGTA) e iniettati (TcdA) composti sono in grado di indurre alterazioni significative nella permeabilità della barriera epiteliale in HIOs. Questi risultati indicano che gli effetti di una vasta gamma di agenti farmacologici, metaboliti, prodotti batterici, citochine, fattori di crescita e altri composti sulla funzione di barriera epiteliale possono essere valutati mediante questo approccio.
| Trattamento | Half-Life (h) | SEM (h) | Abbassare CI di 95% (h) | Superiore 95% IC (h) | n |
| Controllo | 17.11 | 0.3 | 16.45 | 17,78 | 11 |
| EGTA | 2.58 | 0,19 | 1.78 | 3.38 | 3 |
| TcdA | 7,56 | 0,63 | 5,93 | 9,18 | 6 |
Tabella 1: significa tempo di eliminazione (t1/2) per FITC-Destrano in HIOs trattati con EGTA o TcdA. Le unità sono post-microiniezione ore.
Figura 1: layout di base di un microinjector e micromanipolatore per il microinjection HIO. Questa immagine mostra il complemento completo delle attrezzature utilizzate per l'esecuzione di microiniezione di HIOs. Componenti chiave sono etichettati e informazioni sugli ordini possono essere trovati nella tabella materiali. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: estrattore micropipetta. Il rame riscaldamento bobina hc, morsetto superiore c1, morsetto inferiore (c2), braccio estrattore (pa), attiva/disattiva selezione di calore (ht) sono identificati dalle frecce. L'impostazione corretta di calore 1 e PULL sono indicate in rosso. L'inserto mostra un filamento di vetro correttamente montato pronto per il riscaldamento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: immagini rappresentative di un tessuto-derivato HIO iniettato con FITC-Destrano. (A) immagine dimostrando il posizionamento della microcapillary vetro appena prima dell'inserimento nel HIO e microiniezione. (B) immagine di campo chiaro di un tessuto-derivato organoids intestinale umano dopo microiniezione di FITC-Destrano. Si noti che il segnale di fluorescenza è apparente anche senza l'uso di un set di filtri specifici. Questa colorazione favorisce la precisione di microiniezione. Ingrandimento 3x Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Live imaging del flusso di lavoro. (A) schermata che illustra i passaggi necessari per impostare i parametri del microscopio, trovare il HIOs sulla diapositiva e salvare la posizione del palco per ogni HIO essere imaged. Le impostazioni di pre-imaging (B) per catturare il canale FITC a intervalli regolari presso ciascuna delle posizioni specificate in A. (C) Post-imaging esportazione di dati in formato DV file come immagini TIFF con un'immagine TIFF per HIO per punto di tempo.Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: risultati rappresentativi. (A) cellule staminali derivate organoids intestinale umano (HIO) microiniettati con 2 mg/mL FITC-Destrano (4 kDa) ripreso per 20 ore. HIOs erano anche microiniettati con PBS (controllo) o la tossina del Clostridium difficile TcdA (12,8 ng / µ l) o trattati con 2 mM EGTA aggiunto ai terreni di coltura esterno. Ingrandimento 4x. (B) trama di media intensità FITC normalizzato nel tempo in HIOs trattati con PBS (controllo), TcdA o EGTA. Barre di errore rappresentano s.e.m. e n = 11 HIOs (controllo), 3 HIOs (EGTA), 6 HIOs (TcdA). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Questo protocollo stabilisce un metodo generico per il microinjection di HIOs hPSC-derivato e tessuto-derivato organoids intestinale e la misura della permeabilità della barriera epiteliale in tempo reale. Inoltre abbiamo dimostrato il nostro approccio all'analisi e interpretazione dei dati ottenuti con questi metodi. Dato il crescente adozione dei organoids intestinale sistemi modello16,20,21,28 e l'interesse di lunga data nella permeabilità della barriera intestinale come un fisiologicamente rilevanti funzionale risultato3,4,5,6, ci aspettiamo che gli altri che lavorano in questo campo sarà in grado di applicare e costruire su questi metodi.
Ci sono diversi passaggi che sono fondamentali per l'applicazione di questa tecnica. Accesso a alta qualità hPSC - o tessuto derivata HIO tessuto dovrebbe essere stabilita prima sperimentazione estesa con microiniezione. HIO macrostruttura può essere eterogenea, con variazione di dimensioni e la forma, anche se identità del tessuto e la morfologia cellulare è altamente riproducibile quando si utilizza una metodologia consolidata per generare HIOs24. HIOs sferico costituito da un singolo lume semi-trasparente e misura circa 1 mm di diametro sono ideali per microiniezione e misura della fluorescenza luminal in tempo reale. In alcuni casi, microinjection avrà esito negativo, con conseguente crollo dell'HIO o evidenti perdite di materiale iniettato. HIOs fallito può essere rimosso dalla cultura bene a discrezione dell'utente utilizzando una micropipetta standard. Considerare le lenti dell'obiettivo su una piattaforma di imaging disponibili quando si seleziona HIOs microiniezione e imaging. In generale, 2-4 X lenti dell'obiettivo sono ideali per catturare il segnale fluorescente HIO completo, anche può essere usato un obiettivo 10x se lenti a bassa potenza non sono disponibili o se il HIOs disponibili sono < 1 mm di diametro. Software di imaging dovrà consentire l'acquisizione automatizzata delle immagini fluorescenti in punti definiti nel corso del tempo.
Diverse modifiche del presente protocollo sono possibili al fine di soddisfare le esigenze sperimentali. Ad esempio, i risultati dei test di funzione di barriera possono essere dipendenti dal formato molecolare dei composti in uso43 e potrebbe essere appropriato testare preparazioni di destrano di peso molecolare variabile. Inoltre, campo chiaro imaging può essere eseguito oltre a formazione immagine di fluorescenza come un indicatore dell'integrità strutturale complessiva del tessuto25. Quando si esegue la microiniezione di batteri vivi25,28,31,32,33,44, può essere necessario aggiungere penicillina e streptomicina o gentamicina per terreni di coltura HIO prima o dopo microiniezione. L'esterno del microcapillary sarà contaminato durante il riempimento con la sospensione di coltura batterica e questo può essere trasferito ai media HIO. In alternativa, microinjection può essere eseguita su HIOs sospese nella matrice extracellulare (ad es., Matrigel) senza supporto, aggiungendo il supporto una volta completata la microiniezione. Questo potrebbe limitare la contaminazione per la matrice extracellulare e la faccia esterna della HIO. Quando si pianificano i saggi di crescita microbica, può essere necessario rimuovere gli antibiotici nei media dopo 1-2 h per evitare di rallentare o prevenire la crescita di organismi iniettati.
Infine, riconoscendo che non tutti i ricercatori avranno accesso alla microscopia attrezzature adatte a imaging in vitro , è importante sottolineare che le procedure descritte in questo protocollo per la raccolta dati di fluorescenza possono essere applicate alle immagini scattate timepoints fisso usando la microscopia epifluorescente standard senza cattura immagine automatizzati o di controlli ambientali. Esempi di questo approccio possono essere trovati nelle relazioni di Leslie e Huang et al. 25, che ha esaminato attività di tossina di c. difficile in hPSC-derivati organoids intestinale e Karve e Liliane et al. 44, che ha esaminato la permeabilità della barriera epiteliale in simili organoids intestinale hPSC-derivato microiniettati con live e. coli. Manuale di apparecchiature di imaging può comportare una maggiore variazione e difficoltà a normalizzare il segnale fluorescente. Quando eseguire imaging manuale del FITC-Destrano iniettato HIOs è essenziale mantenere ingrandimento fisso, l'intensità di fluorescenza eccitazione e tempi di esposizione in tutto l'esperimento per evitare di falsare le misure di intensità di fluorescenza.
Disclosures
Gli autori hanno nessun concorrenti interessi finanziari o altri conflitti di interesse di rivelare.
Acknowledgments
Gli autori vorrei ringraziare d. ssa Stephanie Spohn e Abuaita di Basilea per molte discussioni utili su organoid microiniezione. Il JRS è supportato dal Consorzio intestinale delle cellule staminali (U01DK103141), un progetto di ricerca collaborativo finanziato dal National Institute of Diabetes e digestivo e malattie renali (NIDDK) e National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID). Il JRS e VBY sono supportati dal romanzo NIAID, alternativa sistemi modello per Consorzio malattie enteriche (NAMSED) (U19AI116482). DRH è supportata la concessione di formazione meccanismi di patogenesi microbica dall'Istituto nazionale dell'allergia e malattie infettive (NIAID, T32AI007528) e il premio scienza traslazionale e clinici all'Istituto Michigan clinica e salute Ricerca (UL1TR000433).
I file di dati completi e il codice di analisi dei dati utilizzati in questo manoscritto sono disponibili presso https://github.com/hilldr/HIO_microinjection.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EGTA 0.5 M sterile (pH 8.0) | Bioworld | 405200081 | |
| Cell matrix solution (Matrigel) | Corning | 354230 | |
| Deltavision RT live cell imaging system | GE Life Sciences | 29065728 | http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences/brands/deltavision/ |
| Camera | GE Life Sciences | 29065728 | Included with Deltavision system |
| softWoRx Imaging software | GE Life Sciences | 29065728 | Included with Deltavision system |
| Biosafety cabinet | Labconco | Cell Logic+ | http://www.labconco.com/product/purifier-cell-logic-class-ii-type-a2-biosafety-cabinets-2/4262 |
| 1X PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Advanced DMEM-F12 | Life Technologies | 12634-010 | Component of ENR media; see McCraken et al. 24 |
| B27 supplement (50X) | Life Technologies | 17504044 | Component of ENR media; see McCraken et al. 24 |
| L-glutamine (100X) | Life Technologies | 25030-081 | Component of ENR media; see McCraken et al. 24 |
| HEPES buffer | Life Technologies | 15630080 | Component of ENR media; see McCraken et al. 24 |
| Manipulator | Narshge | UM-3C | |
| Micromanipulator | Narshge | UM-1PF | |
| Pipette Holder | Narshge | UP-1 | Alternate to Xenoworks pipette holder |
| Magnetic stand | Narshge | GJ-1 | |
| Dissecting scope | Olympus | SX61 | Recommended scope, although other models are likely compatible |
| Olympus IX71 Fluorescent microscope | Olympus | IX71 | Included with Deltavision system |
| CoolSNAP HQ2 | Photometrics | 29065728 | Included with Deltavision system |
| Recombinant C. difficile Toxin A/TcdA Protein | R&D Systems | 8619-GT-020 | |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | Component of ENR media; see McCraken et al. 24 |
| R-spondin 1 | R&D Systems | 4645-RS | Component of ENR media; see McCraken et al. 24 |
| Noggin | R&D Systems | 6057-NG | Component of ENR media; see McCraken et al. 24 |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| FITC-dextran (4 kDa) | Sigma-Aldrich | 46944 | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-30 | |
| Nunc Lab-Tek II Chamber Slides | ThermoFisher Scientific | 154526PK | |
| Glass filaments | WPI | TW100F-4 | |
| Micropipette holder | Xenoworks | BR-MH2 | Preferred device |
| Analog Tubing kit | Xenoworks | BR-AT | |
| 1/16 in clear ferrule | Xenoworks | V001104 | |
| 1-1.2 mm O-ring | Xenoworks | V300450 |
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