Medição em tempo real da permeabilidade da barreira epitelial no Organoids Intestinal humana

Summary

Este protocolo descreve a medição da permeabilidade da barreira epitelial em tempo real seguir tratamento farmacológico em organoids intestinal humana, usando microscopia fluorescente e vive microscopia de célula.

Abstract

Avanços na cultura 3D dos tecidos intestinais, obtidos através de biópsia ou gerados a partir de células-tronco pluripotentes através de diferenciação direcionada, resultaram em modelos sofisticados em vitro da mucosa intestinal. Aproveitar estes sistemas emergentes do modelo exigirá adaptação de ferramentas e técnicas desenvolvidas para animais e sistemas de cultura 2D. Aqui, descrevemos uma técnica para medir a permeabilidade da barreira epitelial no organoids intestinal humana em tempo real. Isso é realizado pela microinjeção de dextrano fluorescente-etiquetadas e imagem em um microscópio invertido equipado com filtros de epifluorescente. Medição em tempo real da permeabilidade de barreira no organoids intestinal facilita a geração de dados de alta resolução temporais, no tecido epitelial intestinal humano, embora esta técnica também pode ser aplicada a Commit fixo abordagens de imagem. Este protocolo é facilmente adaptável para a medição da permeabilidade de barreira epitelial após a exposição a agentes farmacológicos, produtos bacterianos ou toxinas ou microorganismos vivos. Com pequenas modificações, esse protocolo também pode servir como um primer geral na microinjeção de organoids intestinal e os usuários podem escolher completar esse protocolo com aplicações a jusante adicionais ou alternativas após microinjeção.

Introduction

O epitélio intestinal forma uma barreira seletiva que medeia o direcional transporte de nutrientes, H₂O, íons e resíduos de produtos, minimizando inespecífica troca mediada por difusão de outras partículas entre o lúmen e o mesenquimais tecido ou sangue fornecimento^1,2. A permeabilidade inespecífica da barreira epitelial intestinal tem sido considerada um parâmetro chave funcional na saúde e na doença,^3,4,5,6, que reflete a taxa de difusão de pequenas moléculas através do epitélio através do espaço paracellular. Medição da permeabilidade da barreira epitelial pode efectuar-se em animal modelos⁷ e em pacientes humanos⁸ através da ingestão de lactulose, que não tem nenhum transportador específico no tracto gastrointestinal e a coleção subsequente e a medição das concentrações de lactulose no sangue periférico. Marcadores ingeridos alternativos da função de barreira, tais como hidratos de carbono fluorescente etiquetadas também estão disponíveis^9,10. Esta abordagem foi adaptada para a célula epitelial intestinal culturas cultivadas em Transwell suporta¹¹, uma abordagem simplificada que permite maior controle experimental, mas também tem sido criticada como um preditor pobre da vivo em permeabilidade devido à ausência de subtipos epiteliais diferenciados e estrutura de tecido¹². Utilizando câmaras representam ainda uma outra abordagem e permitir a medição da função de barreira epitelial na mucosa intestinal todo ex vivo¹³. Aplicação desta técnica é frequentemente limitada pelo tecido disponibilidade e condição^13,14. Assim, novos métodos que equilibrem a reprodutibilidade e a taxa de transferência com relevância fisiológica são necessários.

Desenvolvimentos recentes na organogênese em vitro conduziram à adopção de sistemas de cultura de tecido 3D modelo como uma plataforma sofisticada para recapitulando a dinâmica de tecidos complexos^{15,16,17 ,18,19,20,21,22,23}. Em particular, células-tronco (hPSC) derivada de pluripotentes humanas organoids intestinal humana (HIOs)^19,24 surgiram como um sistema reprodutível e experimentalmente tractable modelo para o estudo das interações hospedeiro-microbiana e barreira epitelial dinâmica^25,26,,^27,28. Da mesma forma, organoids de derivado de tecido humano (também conhecido como enteroids) pode ser derivado de um procedimento de biópsia simples e pode ser usado como um sistema tractable para estudar a fisiologia humana e doença^15,29,30. Microinjeção de organoids intestinal humano permite a entrega de compostos experimentais²⁵ ou vive micróbios^25,31,32,33 para a apical epiteliais superfície do lúmen de organoides. Leslie e Huang et al . ²⁵ recentemente adaptado a esta técnica para medir a permeabilidade de barreira em HIOs injetadas com isotiocianato de fluoresceína (FITC) rotulado dextrano após a exposição a toxinas bacterianas.

Este protocolo destina-se como um guia para a medição da permeabilidade da barreira epitelial em HIOs hPSC-derivados e derivados de tecido HIOs usando microscopia fluorescente. Com pequenas modificações, ele também pode servir como um primer geral na microinjeção de HIOs com compostos experimentais. Os usuários podem complementar este protocolo com aplicações a jusante adicionais ou alternativos após microinjeção.

Protocol

Normal, identificada de tecido intestinal adulto humano foi obtido de doadores de órgãos falecido através do dom da vida, Michigan. ES humanos célula linha H9 (registro de NIH #0062) foi obtido a partir do Instituto de pesquisa WiCell. Todos os tecidos humanos utilizado neste trabalho foi obtido de doadores não-vivos, eliminação foi identificado e foi realizado com a aprovação da Universidade de Michigan IRB (protocolo # HUM00093465 e HUM00105750).

1. microinjector instalação

1. Obter os materiais listados na Tabela de materiais.
2. Coloque o micromanipulador, escopo de dissecação e fonte de luz na biossegurança do armário. Limpe a configuração de microinjeção com etanol 70% ou outro desinfetante antes da sua utilização experimental. Evite a exposição prolongada a desinfetantes contendo alvejante, que pode corroer o equipamento microinjeção.
   Nota: Um exemplo de uma montagem de microinjector completo é mostrado na Figura 1.
3. Posicione o escopo de dissecação para que a parte do olho pode ser usado através da porta de acesso do escudo para a armário de biossegurança.
   1. Como alternativa, use um banco limpo com sistema de fluxo de ar positivo no lugar de um armário com pontos de acesso do microscópio de biossegurança.
4. Montar o micromanipulador no lado direito do microscópio de acordo com as instruções do fabricante e ajustar para que os controles podem ser facilmente alcançados e ajustados. O micromanipulador deve ser montado sobre uma chapa de ferro ou outra forma estabilizada.
   Nota: Usuários canhotos podem querer colocar o micromanipulador à esquerda do escopo de dissecação.
5. Montar o titular micropipeta para o braço de micromanipulador e conecte o tubo analógico, inserindo-o no suporte da micropipeta.
6. Encha a seringa de vidro de 10 mL com aproximadamente 5-7 mL de óleo mineral estéril.
7. Conecte a seringa de vidro de 10ml cheia de óleo mineral para a extremidade aberta do tubo analógico usando o mecanismo de fechamento de Luer. Coloque a seringa de vidro à esquerda do escopo de dissecação, em frente do micromanipulador.
8. Pressione suavemente a seringa, empurrando através da tubulação de óleo mineral. Irrigue aproximadamente 10 gotas de óleo mineral da ponta do titular micropipeta e recolher em uma placa de Petri ou recipiente similar e descarte.
   Nota: Este passo remove todo o ar do tubo e deve ser realizado antes de cada sessão de microinjeção.

2. preparação para o microinjection

1. 24 h antes da microinjeção:
   1. Prepare a solução de dextran FITC suspendendo re-dextrano FITC na concentração de 2 mg/mL em PBS estéril ou em soro fisiológico. Preparar um volume total de > 250 µ l.
      Nota: Concentrações de maiores ou menores de FITC-dextrano podem ser utilizadas, variando de aproximadamente 0.1 - 10 mg/mL. Ajuste a concentração de FITC-dextran para se adequar a jusante do aplicativo de imagem.
   2. Culturas de organoides instalação em lâminas de câmara de vidro de 4 ou 8 poços ou outro navio de cultura apropriado para vivercom microscopia, com até 4-6 HIOs por alvéolo, incorporado em solução de matriz 50 µ l célula e cultivadas em EGF, Noggin e R-Spondin (ENR) fator de crescimento mídia ^{19 ,24}. Cuide-se para Espaçar uniformemente o organoids (aproximadamente 5mm separado) para evitar a captura de HIOs múltiplos em um único campo microscópico durante a análise de imagens em tempo real. Para um guia completo para manutenção e cultura HIO ver McCraken et al ²⁴.
      Nota: Este protocolo foi desenvolvido usando células-tronco derivadas HIOs e os resultados representativos (ver abaixo) demonstram o uso deste modelo de cultura de tecidos. No entanto, o mesmo protocolo é facilmente adaptado para derivado de tecido intestinal epitelial organoids^15,29. HIOs derivado de tecido são tipicamente menores do que o PSC-derivado HIOs e falta o apoio basolateral mesenquimais célula estrutura^15,29,30. Microinjeção de HIOs derivado de tecido pode exigir um maior grau de habilidade técnica e experiência. O grau em que dados de permeabilidade de barreira epitelial obtidos usando HIOs derivado de tecido podem correlacionar com HIOs hPSC-derivado é desconhecido.
   3. Incube HIOs numa incubadora de cultura de célula padrão no 42 ° C e 5% CO₂ antes da microinjeção.
2. 30 minutos antes da microinjeção, ligue a biossegurança do armário e levantar o escudo de vidro para a altura de trabalho ideal.
3. Remova todos os itens desnecessários a biossegurança do armário. A desordem aumenta o risco de vazamentos ou outros acidentes quando trabalhando espaços confinados.
4. Spray e limpe cuidadosamente a superfície de trabalho com etanol 70% ou outro desinfetante. Limpe com uma toalha de papel.
5. Verifique o nível de óleo mineral na seringa vidro anexado para o microinjector. Se houver menos de 3 mL de óleo mineral restantes, desenrosque a seringa e encher dentro da gabinete, tomando cuidado para evitar a introdução de bolhas de biossegurança. Não encha mais de 7 mL.
6. Ligue a lâmpada para iluminar o escopo de dissecação. Ajuste a ocular para conforto pessoal.
7. Posição o micromanipulador à direita do escopo de dissecação. Fixe o micromanipulador para uma chapa de ferro usando uma base magnética. Alterne o suporte magnético para a posição OFF para ajustar a posição do micromanipulador e fixe o suporte à placa de ferro, definindo o suporte magnético para a posição ON.
8. Conta de instalação
   1. Recupere um filamento de vidro único 1 mm do recipiente de armazenamento fornecido pelo fabricante.
   2. Inserir o filamento de vidro no centro da bobina de cobre do aquecimento do extrator da micropipeta.
      Nota: Consulte a Figura 2 para um guia para preparar o extrator micropipeta.
   3. Posicione o filamento de modo que a bobina de cobre do aquecimento é aproximadamente no meio do filamento de vidro. Isso garantirá que o extrator gera duas agulhas de microinjeção utilizável de cada filamento de vidro.
   4. Fixe o filamento de vidro usando os grampos apertando o top braçadeira em primeiro lugar, certificando-se de que o filamento de vidro é protegido dentro bosque entalhado para evitar quebra.
   5. Estenda o braço extrator para sua posição vertical máxima antes de apertar a braçadeira inferior.
      Nota: Esta etapa é essencial. Estender totalmente o braço extrator resultará em irregular separação das duas partes do filamento de vidro.
   6. Verifique as configurações de aquecimento e puxando o mecanismo.

Selecione o calor #1 com o toggle (990) e defina PULL no 059 (Figura 2).

Ligue o instrumento usando o comutador On/Off.

Fechar o escudo protetor do plexiglás e pressione o botão de tração na face inferior direito, do extrator. A bobina de cobre começarão a calor e brilho laranja brilhante. Como a temperatura sobe, o filamento de vidro vai começar a esticar e eventualmente separar. Após a separação das duas extremidades do filamento de vidro, o instrumento irá desligar.
Nota: A bobina de cobre continuará a ser extremamente quente durante alguns minutos. O filamento de vidro puxada será referido como uma 'conta' a partir daí no protocolo.

Tendo o cuidado de evitar tocar a bobina de cobre, remova um dos microcapilares de vidro. A conta deve ter um ponto muito bem. Lidar com a conta cuidadosamente com luvas de látex ou nitrilo e proceder imediatamente para o gabinete de segurança biológica que contém a configuração de microinjector.
Nota: A conta de vidro é muito frágil e extremamente afiada. Manuseie com cuidado.

Solte a tampa do braço micromanipulador. Introduza a extremidade aberta do titular micropipeta o fim brusco de conta a puxada e empurre-o para dentro até que para.

Prenda a extremidade romba da conta para o braço de micromanipulador apertando novamente a tampa.
Nota: Ao instalar a conta no sistema de microinjeção tome cuidado para evitar tocar a ponta afiada. Isso irá reduzir a chance de contaminação e preservar a ponta fina para o microinjection. Prenda corretamente a conta pode resultar em instabilidade ou ruptura do vidro filamento durante microinjeção.

Abra a ponta do conta vidro. Durante a preparação da conta a puxada do vidro, a ponta do ponto provavelmente vai derreter de forma a selar a ponta afiada da conta. Para remover esse bloqueio:

1. Posicione o micromanipulador tal que a conta está apontada para baixo na fase de vidro do escopo dissecar sem tocar nesta superfície.
2. Encontrar uma superfície de plástico estéril (parte de baixo de uma tampa da placa de cultura funciona perfeitamente) e colocá-lo no palco microscópio directamente por baixo da agulha conta no palco do escopo de dissecação.
3. Centre a ponta da conta sob a área de visualização e certifique-se de que é visível ao olhar através da ocular do microscópio abaixo dos 1,5 ampliação de X.
4. Usando os controles de micromanipulador, avance lentamente o braço micromanipulador e conta para a tampa de cultura de plástico estéril até que a ponta mal contata a superfície plástica e liberta-se a ponta da conta.
   Nota: Mire o menor intervalo possível que permite o fluxo de fluido do filamento de vidro para minimizar o dano para o HIO durante microinjeção.
5. Volta a conta longe da superfície estéril para minimizar a possibilidade de quebra acidental, antes de prosseguir.
6. Verifique a conta para o fluxo pressionando-se a seringa de vidro, empurrando através da tubulação de óleo mineral. Se o fim da conta foi aberto você verá uma pequena gota de óleo mineral emergem da ponta da conta depois de alguns segundos. Se isso não ocorrer, repita o passo anterior e re-teste.

3. estéril Microinjection

Nota: Uma vez que a conta tem sido preparada, instalada e testada, começa HIOs microinjecting. A Figura 3 ilustra um derivado de tecido HIO que tenha sido injetado com sucesso com FITC-dextrano.

1. Encha a conta com o material de injeção. Mergulhe a ponta da conta de vidro na suspensão injeção FITC dextrano, tendo o cuidado de evitar quebrar a ponta da conta contra os lados ou o fundo do tubo. Uma vez que a ponta da conta está submersa na solução, puxe para trás a seringa de óleo mineral para atrair cerca de 10 µ l da suspensão FITC dextran para a conta.
   Nota: É recomendável usar tubos de 1,5 mL ou 0,5 mL para as soluções de injeção/culturas, uma vez que estas serão as mais facilmente acessíveis para a conta instalada. Alternativamente, injeção de soluções podem ser extraídas de uma placa de Petri estéril ou parafilm estéril, que pode reduzir a chance de lesão de farelos, limitando a necessidade de um tubo em estreita proximidade com a conta. Se a suspensão é altamente viscosa ou se a abertura da conta é excepcionalmente pequena, pode levar vários segundos para encher a conta. Não desenhe suspensões microinjeção para o tubo plástico microinjeção como isto pode contaminar o sistema inteiro microinjeção.
2. Pare de encher a conta quando a suspensão de microinjeção preenche 90% do comprimento da conta vidro. Pressione a seringa levemente antes de retirar a conta a partir da solução de microinjeção para garantir que a ponta da conta não contém bolsões de ar.
   Nota: Se o exame da conta revela bolsões de ar, esvaziar e encher novamente.
3. Remova as placas de cultura HIO da incubadora de cultura celular e transferência para a biossegurança do armário com o microinjector.
4. Remova a tampa da placa de cultura de HIO dentro do armário a biossegurança e centro do primeiro poço no palco microscópio, para que seja claramente visível através da ocular do escopo na configuração de menor ampliação.
5. Gire o braço micromanipulador tal que a conta está apontada para baixo, para a cultura HIO bem em um ângulo > 45° em relação à fase de microscópio. Isso é mais facilmente realizado manualmente girando o conjunto do braço de micromanipulador sobre seu eixo horizontal no ponto onde o apoio do braço horizontal micromanipulador encontra a posição vertical, uma vez que os controles bem (mostradores pretos) tem uma gama limitada de movimento. Posicione a ponta da conta acima a primeira cultura bem em aproximadamente 1 cm acima da superfície da mídia (Figura 3A). Uma imagem representativa demonstrando microinjection de derivado de tecido intestinal epitelial organoids é mostrada na Figura 3B.
6. Verifique que tanto a ponta do filamento de vidro e o HIO(s) são visíveis através da ocular. Coloque novamente se necessário.
7. Avança a conta lentamente girando o botão de controle do eixo z no sentido horário.
   Nota: A julgar a posição da ponta da conta, particularmente, a profundidade, requer prática. Como a ponta atinge a superfície da mídia, note uma ligeira distorção visual da ponta da conta.

Proceda com cuidado deste ponto para evitar quebrar a conta contra a parte inferior da placa de cultura ou danificar os HIOs.

Perfure o HIO com a ponta de conta. A superfície externa do HIO vai deprimir um pouco como a conta começa a aplicar pressão e estalará retomar a forma como a ponta penetra o lúmen. Pode ser difícil identificar a ponta da conta dentro do lúmen HIO. Ajuste as configurações de iluminação ou ampliação do escopo de dissecação, se houver dificuldade em ver a conta.

Retire as mãos dos controles micromanipulador quando a conta está corretamente posicionada com a ponta da conta perto do centro do HIO.

Pressione a seringa de óleo mineral ligeiramente para empurrar a solução microinjeção fora a conta e no lúmen HIO. O HIO pode expandir ligeiramente para acomodar o volume da injeção.
Nota: tenha cuidado para evitar excesso de enchimento o HIO como isso fará com que os organoides estourar. Como regra geral, qualquer expansão visível do volume HIO significa que é hora de parar. O volume médio do lúmen HIO maduro é aproximadamente de 1 µ l, mas pode variar significativamente. Automatizado de seringa, bombas podem ser usadas no lugar de uma seringa manual para permitir o controle fino do volume injetado.

Retire a conta do HIO usando o controle do eixo z e uma posição acima da superfície da mídia.

Mover para o próximo alvo HIO com a conta posicionada acima da mídia para evitar danos acidentais para os HIOs durante manobras e injetar em uma maneira similar (ver etapas 3.6-3.11).

1. Encha a conta usando a abordagem descrita acima.
   Nota: Se a ponta quebrar a qualquer momento durante a microinjeção, não tente continuar as injeções. Mude a ponta de acordo com as instruções abaixo.

Altere a conta entre os tratamentos, ou em caso de ruptura. Solte o grampo na extremidade do braço micromanipulador e remova a conta do suporte para micropipeta.
Cuidado: Não manuseie a conta perto de ponta afiada. A ponta fina da conta é extremamente afiada e será facilmente perfurar pele e luvas. Use cautela e estar ciente de todos os movimentos, manipulação da conta usando o manipulador apenas e nunca colocar as mãos entre o ponto da conta e as culturas HIO. Procure tratamento médico imediatamente no caso de uma agulha de uma conta que contém agentes infecciosos ou toxinas.
Nota: Em alguns casos, pode ser difícil confirmar visualmente bem sucedida microinjeção de HIO. A visibilidade das suspensões de microinjeção clara pode ser reforçada pelo uso da adição de concentrações mais elevadas de FITC-dextrano.

4. tratamento farmacológico de HIOs

1. Para testar compostos entregados ao epitélio apical, resuspenda em PBS estéril contendo 2 mg/mL FITC-dextrano e microinjeção no lúmen HIO conforme indicado acima (seção 3). Para o experimento de representante, resuspenda o Clostridium difficile toxina TcdA a 12,8 ng / µ l em PBS contendo FITC-dextrano.
2. Para testar compostos entregados ao compartimento basolateral, substituir a mídia externa de cultura com novas mídias contendo 2 mM glicol de etileno-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-ácido etilenodiaminotetracético (EGTA)(positive control), veículo de PBS sozinho (controlo negativo ), ou outro composto experimental após microinjeção de FITC-dextrano.
   Nota: Dosagem e sincronismo da aplicação de compostos farmacológicos, toxinas ou outros agentes podem variar de acordo com a questão experimental.

5. ao vivo da imagem latente de Organoids Microinjected

1. Começa a microinjeção imediatamente seguinte de imagens ao vivo. Transferi as placas de cultura para um microscópio fluorescente, equipado com uma câmara umidificada mantida a 37 ° C e 21% O₂ e 5% de CO₂ , com uma célula viva automatizada sistema de imagem. Fechar a câmara ambiental e iniciar o processo de geração de imagens.
2. Lançamento do software de análise de imagem (por exemplo, softWoRx) na área de trabalho. Clique em "Arquivo" e selecione "Acquire (resolução 3D)" para inicializar a imagem e o software de controle de microscópio.
3. Conjunto de excitação/emissão para FITC (475 nm excitação/523 nm emissão), ajustar a potência de transmissão para 5% e a lente de 4x. Defina o tempo de exposição a 0,025 ms (Figura 4A).
   Nota: Tempo de exposição deve ser variado de acordo com a força do sinal fluorescente. Em geral, o sinal de fluorescência FITC só irá diminuir. Portanto, para garantir a máxima sensibilidade, os tempos de exposição inicial devem ser ajustados, tal que o sinal fluorescente gravado é apenas abaixo do ponto de saturação da câmera e software de imagem.
4. Encontre os HIOs na ampliação de 4x usando o controlador digital ligado ao microscópio. Centro do HIO dentro da visão de campo (Figura 4A).
5. Clique em "Exibir" na barra de ferramentas e selecione "Lista de ponto" para revelar uma nova janela. Clique em "Marcar o ponto" para armazenar a posição atual do palco na lista ponto (Figura 4A).
6. Repita as etapas de 5.4 e 5.5 até as posições de todos os HIOs foram registradas. Usando um bloco de notas ou registro digital, anote o número de identificação exclusivo atribuído a cada posição de microscopia programado e as imagens captadas naquela posição. Os arquivos de imagem serão marcados com esse número de ID e será importante associar números de ID de imagem HIOs e tratamentos específicos após a conclusão da coleta de dados.
7. Para configurar a coleção de imagens automatizados, clique em "Arquivo" e depois "Experimento" na barra de ferramentas. Nome do experimento com a data ou outro nome exclusivo.
8. Defina os parâmetros para a coleção de imagens ao passar por cada uma das guias a opção como mostrado na Figura 4B.
   1. Desmarque "Z de corte" sob a aba "Corte".
   2. Sob a guia "Canais", insira os parâmetros da janela superior esquerdo "3D resolver". Para poupar tempo, a primeira linha será preenchida automaticamente quando chequei a caixa à esquerda.
   3. Na aba ' lapso de tempo ", marque a caixa rotulada"Lapso de tempo"e digite o intervalo de tempo entre imagens na linha rotulada"Lapso de tempo"e a duração total do experimento na linha rotulada"Tempo Total". O software automaticamente irá calcular o número de pontos de tempo.
   4. Sob a aba "Pontos", marque a caixa rotulada "Lista de pontos de visita".

Você pode também manualmente digitar os números de ponto específico a ser incluído no experimento digitando na caixa de texto.

Não altere as opções padrão sob as abas "Painéis" ou "Acções".

Clique na guia "Executar" Enter a data do experimento na caixa rotulada "nome do arquivo de imagem" e definir os dados salvar localização em "Configurações".

Clique na seta verde para executar a macro do experimento. Um contador de lapso de tempo irá acompanhar o progresso experimental.

No final do curso tempo planejado, exportar e salvar todos os arquivos de imagem como imagens TIFF RGB de 24 bits (Figura 4).

1. Na barra de ferramentas, selecione o processo seguido pelo construtor de tarefa.
2. No menu builder tarefa, adicione arquivos, navegando para a pasta de dados especificada em 5,9. Destaque todos os arquivos que terminam em "DV", digitando "*.dv" no prompt. Selecionar tudo (Ctrl + A) e clique em "Adicionar".
3. Clique em + sob a seção denominada "Tarefa". Selecione "Exportar como..." e clique na aba "Opções".
4. Definir "Formato de exportação" para "Imagens TIFF" e marque a caixa abaixo para adicionar uma pasta de saída"Custom". Este é o local onde as imagens TIFF serão exportadas. Selecione RGB de 24 bits em "Tipo de saída TIFF" e clique em "Concluído".
5. Clique em "Enviar para a fila" para executar a Macro de exportação.

Copie as imagens TIFF exportadas em 5.11 para um driver externo ou um servidor se você estará realizando a análise pós-imagem latente (secção 6) em um computador diferente.
Nota: O tecido HIO e meios de comunicação podem ser armazenados para histologia³⁴, PCR³⁵), Western blot³⁶, ou outras análises a jusante.

6. análise de post-imagem

1. Certifique-se de que o ImageJ³⁷ está instalado e funcionando corretamente no computador a ser usado para análise.
   Nota: Fiji³⁷ é uma distribuição alternativa do programa ImageJ núcleo que funcionará igualmente bem para esta análise.
2. Inicie a análise de lote selecionando "Processo" e depois "Lote" e finalmente "Macro" do menu do ImageJ.
3. Defina a entrada para o diretório que contém as imagens TIFF coletadas durante o curso do tempo experimental. Abra o arquivo de macro ImageJ "thesholdmeasure.ijm" ou diretamente copiar/colar o código de macro para a janela. Clique em "Processo" para iniciar o processamento de arquivos.
   Nota: Limite mínimo valor x (setThreshold(x,255);) pode ser definido como qualquer número 0 - 255 e devem ser ajustados a fim de eliminar a fluorescência de fundo. Valores < 100 são recomendados. Para determinar empiricamente o valor limiar, execute a macro de imagens em uma única imagem que representa um organoides sem sinal fluorescente. A intensidade média da imagem pode servir como um guia para definir o limite apropriadamente. Para a análise representante apresentada abaixo, o limite foi definido como "42".
4. ImageJ produzirá uma grande tabela que contém a área de todos os pixels dentro da escala de intensidade de limiar, e a média, mediana, mínimo e intensidade máxima (limite) valorizam para a área dentro dos limites de intensidade de limiar. Salve como um CSV ou XLS.
5. Mudança de intensidade ao longo do tempo pode ser computadorizada em uma planilha³⁹ manipulando-se a tabela de dados para realizar o cálculo abaixo ou pode ser automatizado usar um apropriado linguagem de programação. Um exemplo de script de análise escrito em R ⁴⁰ é fornecido com este manuscrito.
   Nota: Para cada HIO, intensidade de fluorescência relativo pode ser quantificada como . Eliminação tempo ⁴¹ (t_1/2) de FITC-dextrano no lúmen HIO foi calculado da seguinte forma:
   1. Primeiro, calcular a "área sob a curva" (AUC) da curva que descreve a intensidade da fluorescência relativo ao longo do tempo (t) como:
      
   2. Em seguida, calcular o "afastamento" () taxa com o volume de distribuição (V_d) definida como 1 para a fluorescência normalizada em t = 0:
      
   3. Em seguida, definir a "constante de velocidade de eliminação" () como:
      
   4. E finalmente, calcular o tempo de"eliminação" (t_1/2) como:
      
      A equação reduzida é assim:
      

Results

HIOs eram diferenciadas das células-tronco pluripotentes humanas e cultivadas em solução de matriz celular como anteriormente descrito^19,24. Após 4 semanas de cultura, os HIOs tinham expandido suficientemente para permitir a microinjeção. HIOs foram injetadas com 4 kDa conjugado FITC dextrano suspenso em PBS ou PBS contendo toxina de Clostridium difficile TcdA. C. difficile é um micróbio patogénico oportunista gastrointestinal que apresenta toxicidade epitelial mediada por toxina em HIOs²⁵. Como um controle positivo, EGTA foi adicionado para os meios de cultura HIO em um subconjunto de HIOs injetado com PBS e FITC-dextrano. EGTA é um quelante de cálcio que provoca rápida de polimerização do citoesqueleto de actina⁴². Fluorescência FITC foi monitorizada em tempo real em um microscópio de imagens ao vivo dentro de uma câmara de ambiente controlado e imagens foram capturadas em intervalos de 10 minutos.

Análise post-hoc de dados de imagem revelou diferenças substanciais na retenção de fluorescência FITC (Figura 5). HIOs injetados com PBS mantido quase todos do sinal fluorescente presente em t = 0, porém HIOs que também foram injetados com TcdA de tratados com EGTA exibiram um decréscimo substancial na intensidade fluorescente por microinjeção de 8 horas pós (Figura 5a). dados de imagens de foram quantificados para HIOs todos em todos os pontos de tempo gerar um conjunto de dados de alta resolução, que representa a mudança relativa em intensidade fluorescente ao longo do tempo em cada condição experimental (Figura 5B). Diferenças na permeabilidade epitelial avaliaram-se calcular o tempo médio de eliminação (t_1/2 ) de FITC para cada grupo de tratamento (tabela 1), e comparando as diferenças em t t_1/2 entre grupos usando o Student t-teste. Controle-Tratado HIOs reteve a maioria do sinal fluorescente de FITC por mais de 16 horas (t_1/2 = 17 ± 0,3 h). Tratamento com EGTA reduziu significativamente o tempo de eliminação FITC-dextrano relativo controle HIOs (t_1/2 = 2,6 ± 0,2 h; P = 1,3 x 10^-8). Consistente com os resultados publicados anteriormente²⁵, microinjeção de TcdA aumentou significativamente permeabilidade da barreira epitelial em relação ao tratamento controle (t_1/2 = 7,6 ± 0,6 h; P = 5,4 x 10^-4). Assim, tanto externo (EGTA) e microinjected (TcdA) compostos são capazes de induzir alterações significativas na permeabilidade da barreira epitelial em HIOs. Estes resultados sugerem que os efeitos de uma vasta gama de agentes farmacológicos, metabólitos, produtos bacterianos, citocinas, fatores de crescimento e outros compostos na função de barreira epitelial podem ser avaliados usando esta abordagem.

Tratamento	Meia-vida (h)	SEM (h)	Inferior a 95% CI (h)	Superior a 95% CI (h)	n
Controle	17,11	0.3	16.45	17.78	11
EGTA	2,58	0,19	1.78	3.38	3
TcdA	7.56	0,63	5.93	9.18	6

Tabela 1: tempo de eliminação (t_1/2) para FITC-dextran em HIOs tratados com EGTA ou TcdA. As unidades são pós-microinjeção de horas.

Figura 1: layout básico de uma microinjector e micromanipulador para microinjeção de HIO. Esta imagem mostra o complemento total de equipamentos utilizados para a realização de microinjeção de HIOs. Componentes-chave são rotulados e ordenação de informações pode ser encontrado na tabela de materiais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: extrator de micropipeta. O cobre, aquecimento da bobina hc, braçadeira superior c1, braçadeira inferior (c2), braço extrator (pa), alavanca de seleção de calor (ht) são identificados pelas setas. A configuração correta para o HEAT 1 e puxe são indicadas no texto em vermelho. A inserção mostra um filamento de vidro corretamente montado pronto para o aquecimento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: imagens representativas de um derivado de tecido HIO injetado com FITC-dextrano. Imagem do (A) demonstrando o posicionamento da conta de vidro apenas antes da inserção no HIO e microinjeção. (B) Brightfield imagem de um derivado de tecido humano intestinal organoids depois da microinjeção de FITC-dextrano. Note que o sinal de fluorescência é aparente mesmo sem o uso de um conjunto de filtro específico. Esta coloração auxilia precisão microinjeção. 3 ampliação X , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: viver o trabalho de imagem. (A) Screenshot ilustrando as etapas necessárias para definir os parâmetros de microscópio, encontrar os HIOs no slide e salvar a posição da fase para cada HIO ser fotografada. Configurações de pré-imagem (B) para capturar o canal FITC em intervalos regulares em cada uma das posições especificadas na exportação de pós-imagens r. (C) de dados em formato DV arquivos como imagens TIFF com uma imagem TIFF por HIO por ponto de tempo.Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: resultados representativos. (A)-células tronco derivadas organoids intestinal humana (HIO) injetadas com FITC-dextrano de 2 mg/mL (4 kDa) fotografada por 20 horas. HIOs também foram injetadas com PBS (controle) ou toxina Clostridium difficile TcdA (12,8 ng / µ l) ou tratados com 2mm EGTA adicionado à cultura mídia externa. Ampliação de 4x. (B) parcela de média intensidade FITC normalizada ao longo do tempo em HIOs tratados com PBS (controle), TcdA ou EGTA. Barras de erro representam no MEV mostrou e n = 11 HIOs (controle), 3 HIOs (EGTA), 6 HIOs (TcdA). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Este protocolo estabelece um método de uso geral para a microinjeção de HIOs hPSC-derivados e derivados de tecido intestinal organoids e a medição da permeabilidade da barreira epitelial em tempo real. Também demonstrámos a nossa abordagem para análise e interpretação dos dados gerados usando estes métodos. Dada a crescente adoção do organoids intestinal sistemas modelo^16,20,21,28 e o interesse de longa data na permeabilidade da barreira intestinal como um fisiologicamente relevantes funcional resultado^3,4,5,6, prevemos que outras pessoas que trabalham neste campo será capazes de aplicar e construir sobre esses métodos.

Há várias etapas que são essenciais para a aplicação desta técnica. Acesso ao hPSC de alta qualidade - ou tecido derivada HIO de tecido deve ser estabelecido antes da experimentação extensiva com microinjeção. HIO macrostructure pode ser heterogêneo, com variação no tamanho e na forma, embora a identidade de tecido e a morfologia celular é altamente reprodutível quando utilizando a metodologia estabelecida para gerar HIOs²⁴. HIOs esféricas, consistindo de um único lúmen semi-transparente e medindo aproximadamente 1 mm de diâmetro são ideais para microinjeção e medição de fluorescência luminal em tempo real. Em alguns casos, microinjeção irá falhar, resultando em colapso do HIO ou óbvio vazamento de material injetado. HIOs falhadas podem ser removidos da cultura bem a critério do usuário usando uma micropipeta padrão. Considere as lentes objetivas disponíveis em uma plataforma de imagem ao selecionar HIOs para microinjeção e imagem. Em geral, 2-4 X objectivas são ideais para capturar o sinal fluorescente completo do HIO, embora um objetivo X 10 pode ser utilizado se as lentes de baixa potência não estiverem disponíveis ou se o HIOs disponíveis são < 1 mm de diâmetro. Software de imagem deve permitir a captura automatizada de imagens fluorescentes em pontos definidos ao longo do tempo.

Diversas modificações do presente protocolo são possíveis a fim de atender às necessidades de experimentais. Por exemplo, os resultados dos testes de função de barreira podem ser dependentes do tamanho molecular dos compostos em uso⁴³ e pode ser apropriado testar preparações de dextrano de variação de peso molecular. Além disso, pode efectuar-se a imagem brightfield além de imagens de fluorescência como um indicador da integridade estrutural global do tecido²⁵. Ao executar a microinjeção de bactérias vivas^{25,28,31,32,33,44}, pode ser necessário adicionar penicilina e estreptomicina ou gentamicina para os meios de cultura HIO antes ou depois da microinjeção. Fora da conta vai ser contaminada durante o enchimento com a suspensão da cultura bacteriana e isto poderá ser transferido para a mídia HIO. Alternadamente, microinjeção pode ser executada em HIOs suspendidos na matriz extracelular (por exemplo, Matrigel) sem mídia, adicionando a mídia após a conclusão da microinjeção. Isto pode limitar a contaminação para a matriz extracelular e a face externa do HIO. Ao planejar a ensaios de crescimento microbiano, pode ser necessário remover os antibióticos na mídia após 1-2 h para evitar, retardar ou impedir o crescimento de organismos microinjected.

Finalmente, reconhecendo que nem todos os pesquisadores terão acesso a equipamentos de microscopia, adequado para a imagem latente em vitro , é importante salientar que os procedimentos descritos no presente protocolo para coleta de dados de fluorescência podem ser aplicados a imagens tomadas em momentos fixos usando microscopia epifluorescente padrão sem captura automatizada de imagem ou controles ambientais. Exemplos desta abordagem podem ser encontrados nos relatórios por Leslie e Huang et al . ²⁵, que examinaram a atividade de toxina de c. difficile no hPSC-derivado organoids intestinal e Karve e Pradan et al ⁴⁴, que examinaram a permeabilidade da barreira epitelial em semelhante organoids intestinal hPSC-derivado, injetadas ao vivo e. coli. Operação manual do equipamento de imagem pode resultar em maior variação e dificuldade na normalização do sinal fluorescente. Quando executar imagem manual do FITC-dextran injetado HIOs é essencial para manter a ampliação fixa, intensidade de excitação fluorescente e tempos de exposição em todo o experimento para evitar distorcer as medições de intensidade fluorescente.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
EGTA 0,5 M estéril (pH 8,0)	Bioworld	405200081
Solução de matriz celular (Matrigel)	Corning	354230
Sistema de imagem de células vivas Deltavision RT	GE Life	Sciences 29065728	http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences/brands/deltavision/
Câmera	GE Life Sciences	29065728	Incluído com o sistema Deltavision
software de imagem softWoRx	GE Life Sciences	29065728	Incluído com o sistema Deltavision
Gabinete de biossegurança	Labconco	Cell Logic+	http://www.labconco.com/product/purifier-cell-logic-class-ii-type-a2-biosafety-cabinets-2/4262
1X PBS	Life Technologies	10010-023
Advanced DMEM-F12	Life Technologies	12634-010	Componente da mídia ENR; ver McCraken et al. 24
B27 suplemento (50X)	Life Technologies	17504044	Componente da mídia ENR; ver McCraken et al. 24
L-glutamina (100X)	Life Technologies	25030-081	Componente da mídia ENR; ver McCraken et al. 24
HEPES buffer	Life Technologies	15630080	Componente do meio ENR; ver McCraken et al. 24
Manipulator	Narshge	UM-3C
Micromanipulador	Narshge	UM-1PF
Pipeta Holder	Narshge	UP-1	Alternativa ao suporte de pipeta Xenoworks
Suporte magnético	Narshge	GJ-1
Escopo de dissecação	Olympus	SX61	Escopo recomendado, embora outros modelos sejam provavelmente compatíveis
Olympus IX71 Microscópio fluorescente	Olympus	IX71	Incluído com o sistema
Deltavision CoolSNAP HQ2	Photometrics	29065728	Incluído com o sistema Deltavision
Recombinante C. difficile Toxina A/TcdA Proteína	R& D Systems	8619-GT-020
EGF	R& D Systems	236-EG	Componente do meio ENR; ver McCraken et al. 24
R-spondin 1	R& D Systems	4645-RS	Componente da mídia ENR; ver McCraken et al. 24
Noggin	R& D Systems	6057-NG	Componente do meio ENR; ver McCraken et al. 24
Óleo mineral	Sigma-Aldrich	M8410
FITC-dextrano (4 kDa)	Sigma-Aldrich	46944
Extrator de micropipeta	Sutter Instruments	P-30
Nunc Lab-Tek II Lâminas de câmara	ThermoFisher Scientific	154526PK
Filamentos de vidro	WPI	TW100F-4
Suporte para micropipeta	Xenoworks	BR-MH2	Dispositivo preferido
Kit de tubulação analógica	Xenoworks	BR-AT
1/16 pol ponteira transparente	Xenoworks	V001104
O-ring 1-1,2 mm	Xenoworks	V300450