Summary
Microinjection van Nasonia vitripennis embryo's is een essentiële methode voor het genereren van de wijzigingen van het erfelijk genoom. Hier beschreven is een gedetailleerde procedure voor microinjection en transplanteren van Nasonia vitripennis embryo's, die toekomstige genoom manipulatie in dit organisme aanzienlijk zal vergemakkelijken.
Abstract
De wesp juweel Nasonia vitripennis heeft ontpopt als een effectieve modelsysteem voor het bestuderen van processen met inbegrip van geslacht bepaling, haplo-diploïde geslacht bepaling, venom synthese en host-symbiont interacties, onder anderen. Een belangrijke beperking van het werken met dit organisme is het gebrek aan effectieve protocollen voor het uitvoeren van gerichte genoom wijzigingen. Een belangrijk onderdeel van de wijziging van het genoom is de levering van de reagentia, CRISPR/Cas9 moleculen, waaronder in embryo's door middel van microinjection bewerken. Terwijl microinjection goed ingeburgerd in vele modelorganismen is, deze techniek vormt een bijzondere uitdaging om uit te voeren in de N. vitripennis voornamelijk te wijten aan de grootte van de kleine embryo en het feit dat embryonale ontwikkeling doet zich geheel binnen een parasitized bromvlieg Verpopping. De volgende procedure overwint deze significante uitdagingen terwijl demonstreren een gestroomlijnde, visuele procedure voor het effectief verwijderen van wasp embryo's van gastheer poppen, microinjecting, parasitized en zorgvuldig verplanten hen terug in de ontvangende voor de voortzetting en voltooiing van ontwikkeling. Dit protocol zal sterk vergroting van het vermogen van onderzoeksgroepen uit te voeren geavanceerde genoom wijzigingen in dit organisme.
Introduction
De jewel wesp, N. vitripennis, is een van de vier soorten binnen het geslacht Nasonia , dat zijn ectoparasitoïde van vlees eten vliegen zoals Sarcophaga bullata1. Als gevolg van hun fast-Generatierekeningen perioden, gemak van het houden van kippen in het laboratorium, en een aantal unieke en belangrijke biologische kenmerken, is N. vitripennis een focus voor de ontwikkeling van meerdere experimentele instrumenten gevonden in traditionele modelorganismen geweest . Bijvoorbeeld, omvatten sommige unieke biologische kenmerken een haplo-diploïde reproductie systeem2, een relatie met microbiële en genetische parasieten3,4, en een inplanten (B) chromosoom5,6 ,7. Samen genomen, maken deze N. vitripennis een belangrijke experimenteel systeem voor experimenten gericht op het ophelderen van de moleculaire en cellulaire aspecten van deze processen, naast anderen met inbegrip van venom productie8, 9, geslacht bepaling10,11, en evolutie en ontwikkeling van as patroon formatie12,13,14. Bovendien, de genetische toolkit te bestuderen van de biologie van N. vitripennis is sterk toegenomen in de afgelopen tien jaar of zo, met de volgorde van een hoge resolutie genoom15, verschillende genuitdrukking bestudeert16,17,18, en de mogelijkheid om functioneel genexpressie afhankelijk RNA-interferentie (RNAi)19,20, die samen hebben verbeterd de werkwillig en de mogelijkheden van het uitvoeren van de omgekeerde genetica in dit organisme verstoren.
Ondanks de vele belangrijke wetenschappelijke vooruitgang en uitgebreide toolkits in dit organisme, vanaf de huidige kennis heeft slechts één groep met succes uitgevoerd embryonale microinjections voor het genereren van erfelijk genoom wijzigingen21. Dit is voornamelijk te wijten aan de moeilijkheden van het werken met embryo's van N. vitripennis , zoals ze zijn heel kwetsbaar en klein is, wordt ~2/3 de grootte van Drosophila melanogaster embryo's, waardoor ze over het algemeen moeilijk te manipuleren. Bovendien, stort N. vitripennis vrouwtjes hun eieren op vooraf gestoken bromvlieg poppen, waarbinnen het geheel van de embryogenese, larvale, en pop ontwikkeling plaatsvindt. Daarom, voor succesvolle microinjections, pre blastoderm fase embryo's moeten efficiënt geïncasseerd via host poppen, snel microinjected, en onmiddellijk terug in hun gastheren voor ontwikkeling worden getransplanteerd. Deze stappen moet precisie en beweeglijkheid om te voorkomen beschadiging van de microinjected van de embryo's of de pop gastheren, waardoor de techniek zeer uitdagend. Niettegenstaande is er een korte protocol publiceerde meer dan een decennium geleden dat N. vitripennis embryo microinjection22 beschrijft. Echter, deze procedure is vereist dat de vers gelegd embryo's worden verdroogde, het maakt gebruik van plakband om de eieren voor microinjection te verankeren, en omvat een visuele demonstratie van de techniek niet. Daarom hier beschreven is een bijgewerkte en herziene protocol, met inbegrip van een visuele procedure, waarin een verbeterde stapsgewijze protocol voor de N. vitripennis embryo microinjections die kunnen worden gevolgd door elke fundamentele lab voor het genereren van erfelijk genoom wijzigingen in deze belangrijke model insect.
Protocol
1. N. Vitripennis kolonie fokken
- Instellen van verschillende kolonies (~ 3-5) door het plaatsen van 200-500 N. vitripennis volwassenen (met een 3:1 verhouding van de vrouw: man) in bug slaapzaal kooien.
Nota: Alternatief voor het gebruik van insect slaapzalen, wespen kan ook in meerdere kleine glazen reageerbuizen aangesloten met katoen met ongeveer 15-20 wespen/injectieflacon worden gekweekt.- Handhaven van de wespen op 25 ± 1 ° C met een relatieve luchtvochtigheid van 30% en een licht donker cyclus 12:12, voederen dagelijks met kleine druppeltjes van 1:10 (v/v) sacharose/water oplossing.
Opmerking: Verspreiding van wasp kolonies en collecties kan ook worden uitgevoerd bij kamertemperatuur zonder gecontroleerde luchtvochtigheid; echter, lagere temperaturen dan 25 ° C zal iets lager de ontwikkelingstoxiciteit timing van de embryo's.
- Handhaven van de wespen op 25 ± 1 ° C met een relatieve luchtvochtigheid van 30% en een licht donker cyclus 12:12, voederen dagelijks met kleine druppeltjes van 1:10 (v/v) sacharose/water oplossing.
- Kunnen wespen om te paren gedurende ten minste 4 dagen voorafgaand aan de injecties.
- Voor de eerste twee dagen, kunnen erop vrouwtjes te voeden met vers S. bullata poppen, evenals kleine druppels van een 1:10 (v/v) sacharose/water oplossing.
- Verwijder voor de volgende twee dagen, de bromvlieg poppen om te beroven van de vrouwelijke wespen van een oviposition site, waardoor ze zeer gravid.
2. verzameling en de uitlijning van de N. Vitripennis pre blastoderm fase embryo 's
- Toestaan van vrouwelijke wespen aan parasitize (oviposit embryo's) in jonge hosts (S. bullata poppen). Hosts om vers te houden, hosts opslaan in 4 ° C onmiddellijk na het verkrijgen van hen en alleen te verwijderen wanneer nodig.
Opmerking: Jonge hosts kunnen worden bepaald door het hebben van een rood gekleurde puparium overwegende dat oudere hosts een donkerder gekleurde puparium (figuur 1A hebben).- Plaats van individuele verse S. bullata poppen in een schuim stopper met een gat van poppen en middelgrote snij in het midden. Alleen bloot ~ 0.2 cm van het voorste einde (voorkeur oviposition site) van de host voor maximale concentratie van parasitization en gemakkelijker embryo's worden verzameld.
Opmerking: Het voorste einde is afgerond, terwijl het achterste einde dikker is en een 'krater-like' opening (figuur 1B bevat). - Host poppen (ongeveer 5 gastheer poppen per 100 wespen) in deze regeling in de kooi plaatsen en wacht ongeveer 45 min zodat wespen aan het parasitize (Figuur 2- ii).
Opmerking: Het is zeer belangrijk dat de embryo's zo jong mogelijk, idealiter binnen het eerste uur zijn van de oviposited wordt, om ervoor te zorgen dat ze in de fase van pre-blastoderm. Oude embryo's (> 1,5 h) moet niet worden geïnjecteerd. - Parasitized hosts verwijderen door deze met de hand en voorzichtig poetsen/blazen af eventuele die wespen te halen. Vervang ze met verse hosts na elke ~ 15 min om door te gaan verzamelen vroeg geënsceneerd eieren tijdens de injecties.
- Plaats van individuele verse S. bullata poppen in een schuim stopper met een gat van poppen en middelgrote snij in het midden. Alleen bloot ~ 0.2 cm van het voorste einde (voorkeur oviposition site) van de host voor maximale concentratie van parasitization en gemakkelijker embryo's worden verzameld.
- De vers parasitized hosts verwijderen uit kooi met de hand. Onder een Microscoop ontleden, gebruik pincet, schil zorgvuldig weg het posterieure einde (0,4 cm) van de buitenkant puparium (pop shell) om de eieren van de N. vitripennis (Figuur 2- iii) bloot te stellen.
Opmerking: Zorg moet worden genomen om te voorkomen dat het prikken van de pop huid; Als dit gebeurt, zal de Hemolymfe de wasp embryo's, die zeer moeilijk zullen te verwijderen voor microinjection bevochtigen. - Gebruik vloeibare Lijm lijm een dekglaasje aan op een schone glasplaatje ter voorbereiding van een embryo uitlijning dia (Figuur 3).
Opmerking: Een hoge prestaties instant lijm wordt gebruikt om hechtsterkte en drogen snelheid, echter een lijm die kan voorkomen dat het dekglaasje aan bewegen op de dia is acceptabel. - Kous de embryo's van de host zorgvuldig met een natte penseel van de fine-tip, om ervoor te zorgen niet te beschadigen de zachte pop huid van de gastheer.
Opmerking: een ' embryo pick,' dat is in wezen een helft van een paar van ultrafijne verlostang, kan worden gebruikt in plaats van een verfkwast. - Overdracht ~ 20 embryo's één-voor-één op de dia, direct grenzend aan de kant van het dekglaasje aan met een natte penseel. Oriënteren anterior ultimo het embryo tegen de rand van de dia van de dekking, zodat de achterste einde van de embryo's wordt gewezen in dezelfde richting (Figuur 2- iv). Dit zal zorgen voor hogere precisie van injecteren in dezelfde positie onder alle embryo's.
Opmerking: Deze verbeterde techniek vereist geen dubbelzijdige plakband om te lossen embryo's aan de dia, zoals eerder beschreven21,22. Bovendien, niet droog van embryo's, en bestrijk de eieren met halonen olie tijdens de injectie zoals eerder is beschreven voor N. vitripennis embryo microinjection22.
3. naald voorbereiding voor Microinjections
- Plaats een aluminosilicaat capillaire glas in de trekker van een naald.
Opmerking: Een goede naald is van cruciaal belang voor succesvolle N. vitripennis embryo's injecties. De naalden van de injectie moet een sharp en fine-tip om gemakkelijk penetratie door het chorion. Kwarts en borosilicaat capillaire naalden ook kunnen worden gebruikt (Figuur 4). - De warmte naar 605, de snelheid naar 130, de vertraging naar 80, de Trek ingesteld op 70 en de Druk tot 500 op de trekker van een naald.
Opmerking: Extra naald trekker instellingen voor het trekken van kwarts en borosilicaat naalden is te zien in tabel 1; de parameters kunnen variëren voor verschillende trekkers en gloeidraden. - Het activeren van de trekker van de naald tot de juiste naald. Herhaal zo nodig voor de productie van meerdere naalden.
Opmerking: Getrokken naalden kunnen worden opgeslagen door ze te plaatsen in een petrischaal met die verschillende parallel van commerciële modeler van klei rolt. - Schuine rand van het uiteinde van de naald door het licht aanraken van de tip om de schurende traanplaat rond 10 s bij 25 ° C (Figuur 2- iii).
Opmerking: De injectie naalden profiteren Afschuining door bevordering van de indienststelling van de embryo's met minimale schade terwijl het tegelijkertijd het verbeteren van de stroom van regenten via de naald.
4. embryo Microinjection
- Voorbereiden van de injectie mengsel, bestaande uit genoom wijziging reagentia (bijvoorbeeld transposon + helper transposase, of CRIPSR reagentia, enz.), en bewaar deze op ijs.
- Laden de naald van de injectie met 2 µL van injectie mengsel met behulp van tips van de microloader.
Opmerking: Het mengsel van de injectie aangetoond in het protocol bestaat uit single-gids RNA (sgRNA) (s) en recombinant Cas9 eiwit vermengd in H2O. - Plaats het glasplaatje met de beklede embryo's op het podium van een samengestelde microscoop.
- Steek voorzichtig de naald in het achterste einde van het embryo met een verticale hoek van 25-35 °.
Opmerking: Als het mengsel van teveel injectie wordt geïnjecteerd in het embryo het breken wegnemen van het cytoplasma van het embryo. Bovendien, ten onrechte afgeschuinde of gebroken naalden met te groot voor een opening kan ook leiden tot embryo breuk.
- Probeer opnieuw Afschuining naalden als verstopping optreedt. Het cytoplasma van N. vitripennis embryo's is ongewoon viskeuze en plakkerig, die leidt tot frequente naald verstopping (1/25 injecties).
Opmerking: Het is belangrijk de embryo's om vochtig te houden tijdens de periode van de injectie door regelmatig toe te voegen-geïoniseerd water met behulp van het penseel. De hoeveelheid water op de borstel is sleutel tot embryo's verplaatsen en uitlijnen met gemak. Teveel water resulteert in embryo's die drijvend en te weinig water ze moeilijk maakt te bewegen. - Injecteren ~ 20-40 eieren op een moment (moet duren ongeveer 10 min), dan stoppen. Overdracht van de geïnjecteerde eieren met een natte penseel door het licht aanraken van de geïnjecteerde eieren en plaats ze in een gastheer. Volg injecteren weer met behulp van een frisse nieuwe eitjes gelegd (> 1 h oude).
Opmerking: Ideaal dit protocol is vooral effectief als iemand voortdurend verzamelt en voering van eieren, terwijl een andere persoon is injecteren de genoom wijziging componenten en verplanten ingespoten embryo's host poppen.
5. verplanten Injected G0 N. vitripennis embryo's op Pre-stung Host
- Zorgvuldig plaatst de ingespoten G0 embryo's op een eerder gestoken S. bullata poppen (Figuur 2- vi) met een natte penseel na microinjection.
Opmerking: De poppen van de host gebruikt voor het verzamelen van de embryo's voor microinjection werkt voor dit doel. Ook, ondanks aanzienlijke inspanningen, er is momenteel geen beschikbare kunstmatige dieet dat gebruikte22kan worden.- Plaats maximaal 40 ingespoten embryo's één tegelijk op één vooraf gestoken host om overbevolking en larvale concurrentie te vermijden.
Opmerking: Injectie zal leiden tot schade aan de embryo's; achteloos transplantatie van ingespoten embryo's naar de host poppen kan knijp de ingespoten component of de dooier uit, en leiden tot de dood van de embryo's.
- Plaats maximaal 40 ingespoten embryo's één tegelijk op één vooraf gestoken host om overbevolking en larvale concurrentie te vermijden.
- Plaats van de host-poppen in een petrischaal met vochtige filterpapier en katoenen ballen, en hen uit te broeden bij 25 ° C met ongeveer 70% luchtvochtigheid tot ingespoten embryo's uitkomen (ongeveer 1-2 dagen) (Figuur 2- vii).
Opmerking: Bovenal hosts kunnen worden overgelaten met een geschilde uit puparium en de N. vitripennis eieren Nieuwengels normaal zo lang als ze worden geïncubeerd in een bevochtigde kamer (petrischaal met vochtige filterpapier en katoenen ballen) ter voorkoming van uitdroging. Bij kamer temperatuur en vochtigheid van de vochtige katoenen ballen aan het broeden is voldoende voor het geval dat vochtigheid kan niet worden gecontroleerd. - Breng de host-poppen in een nieuwe petrischaal op 70% vochtigheid en 25°C na G0 embryo's hatch.
- Dagelijks toezicht op de host poppen en ingespoten G0 larven. Als de host poppen een vieze geur hebben, overbrengen in de ingespoten larven nieuwe gezonde gastheer poppen.
6. screening voor genoom-wijzigingen
- Verwijder elke N. vitripennis poppen uit de host met een fijne penseel of embryo pick. Ingespoten G0 larven moeten ongeveer 8 dagen post injectie verpoppen.
- Elke verwijderde Verpopping plaats in een geïsoleerde glazen ampul aangesloten met katoen en laten ontstaan als G0 volwassenen, ervoor te zorgen dat de gearceerde vrouwtjes zullen Maagd die zal helpen met stroomafwaartse genetische kruisen.
Opmerking: Vrouwen kunnen worden gesorteerd van de mannetjes door vleugel lengte: vrouwtjes hebben langere vleugels die uit te voorbij het lichaam profiel breiden toen aan de kant. Alle microinjected vrouwelijke poppen kunnen samen worden geplaatst in een aangesloten flacon, en hetzelfde geldt voor mannelijke poppen. - Scherm G0 personen, na eclosion, door beide PCR of visueel (als een fenotypische gen verstoren). Bijvoorbeeld, als CRISPR wordt gebruikt voor het maken van verwijderingen in een bepaald gen en het verstoorde gen een zichtbaar fenotype verleent, vervolgens sorteren en houden van personen met een gemuteerde versie van het getroffen fenotype (Figuur 2- viii)21. Indien echter het betrokken gen voor een niet-zichtbare fenotype, zoals een mutant van een essentiële gen codeert, uitvoeren een Overstekende regeling (cross G0 mannelijke met wild type vrouw of cross G0 vrouwelijke met wild type man) om te herstellen en scherm voor erfelijke mutanten via keuring letaliteit of steriliteit.
Opmerking: Vergelijkbaar met D. melanogaster, N. vitripennis volwassenen kan worden geïmmobiliseerd door blootstelling aan CO2 toestaan om eenvoudig te manipuleren. Bovendien zal unmated vrouwtjes aanleiding geven tot 100% haploïde mannelijke broedsels, dus daarom dat een mutant unmated vrouw kan aanleiding geven tot groot aantal mutant mannetjes die kunnen worden gebruikt voor latere analyse.
Opmerking: Mutaties in essentiële genen zal moeten worden gehouden door de paring overlevende G0 geïnjecteerd vrouwtjes (vermoedelijk heterozygoot voor een mutatie) te wild type males; in dit specifieke geval, moet de helft van de mannelijke nakomelingen van1 G sterven als gevolg van de overname van de dodelijke mutatie, terwijl de helft van de G-1 vrouwelijke nakomelingen dragers van de dodelijke zullen. - G0 volwassenen en scherm G1 nageslacht voor transgenic invoegingen Transgenese markers te gebruiken als het doel Transgenese is genenoverdracht. Momenteel Transgenese moet nog worden aangetoond in N. vitripennis.
Representative Results
Dit protocol biedt gedetailleerde richtsnoeren voor de kolonie fokken, pre blastoderm embryo's worden verzameld, uitlijning, microinjection en latere transplantatie na injectie en kan worden gebruikt voor efficiënte genoom engineering in N. vitripennis. Zoals afgebeeld in Figuur 2, de algemene volgorde van stappen voor een succesvolle microinjection in N. vitripennis omvatten: (i) het toelaat van mannelijke en vrouwelijke volwassenen om te paren (~ 4 dagen), (ii) het leveren van verse host vliegen poppen (S. bullata) geplaatst een gemodificeerde schuim stekker erop vrouwtjes en rekening houdend met oviposition (~ 45 min), (iii) zorgvuldig peeling weg de parasitized host poppen cuticle bloot te verzamelen pre blastoderm stadium wasp embryo's (~ 15 min), (iv) uitlijnen verzamelde embryo's (~ 15 min), (v) microinjecting onderdelen van de wijziging van de genoom in embryo's (~ 15 min), (vi) zorgvuldig plaatsen ingespoten embryo's terug in vooraf gestoken hosts te voorzien in adequate ontwikkeling (~ 15 min), en (vii) voorkomen uitdroging van de geïnjecteerde embryo/host door de overdracht van in een bevochtigde kamer met ongeveer 70% relatieve vochtigheid (~ 15 min). Parasitized hosts worden vervolgens gedurende ongeveer 14 dagen om te zorgen voor de volledige ontwikkeling van N. vitripennis embryo's geïncubeerd. Zodra geïnjecteerd, volwassenen voortkomen uit de host (viii), isoleren, paren en hen individueel te screenen op de aanwezigheid van verwachte mutaties.
Voor effectieve naald penetratie en microinjection in N. vitripennis embryo's, worden verschillende soorten glazen capillaire naalden met gloeidraad, met inbegrip van kwarts, aluminosilicaat en borosilicaat soorten getest. Het komt voor dat de kwaliteit van naald essentieel is voor het vermijden van breuk/verstopping tijdens de injectie, en voor het bereiken van hoge tarieven van beide embryo overleving en transformatie-efficiëntie. Voor elk type glas, een effectieve protocol werd ontwikkeld om naalden te trekken om een gewenste hypodermische-achtige lange tip effectief voor N. vitripennis embryo microinjection met behulp van verschillende micropipet trekkers (P-1000 en P-2000) (tabel 1 Figuur 4).
Voor het optimaliseren van de procedure, de overlevingskans van de patiënt worden gemeten na injectie van wisselende hoeveelheden genoom wijziging onderdelen. De hier gebruikte onderdelen voor de wijziging van genoom waren gemengd gids RNAs en Cas9 eiwitten voor CRISPR-gemedieerde genoom bewerken, die eerder werden gedemonstreerd om goed in de N. vitripennis21te werken. Vergelijkbaar met wat was eerder gemeld, hier een sgRNA gericht op het gen Cinnaber is ontworpen en gesynthetiseerd. Door gericht op dit gen verstoren en wordt een gemakkelijk identificeerbare fenotypische verandering gezien in de kleur van de ogen van het organisme19,21. Een mengsel van de injectie combineren een verscheidenheid van de concentraties van sgRNA (0, 20, 40, 80, 160 en 320 ng/µL) met Cas9 eiwit (0, 20, 40, 80, 160 en 320 ng/µL) is gemaakt en ingespoten in embryo's van wild type N. vitripennis. Overlevingskans van ingespoten embryo's blijkt te zijn dosisafhankelijk (tabel 2)21. De verhoogde concentratie van sgRNA en Cas9 eiwit leiden tot verminderde overlevingskans van de patiënt (tabel 2), misschien als gevolg van additieve af-target effecten. Hoge luchtvochtigheid (~ 70%) komt ook voor als belangrijk voor embryo overleving na de transplantatie naar hosts, als lage luchtvochtigheid (~ 10%) resulteerde in de dood van 100% op alle ingespoten embryo's.
Figuur 1 . Voorbereiding van host poppen (S. bullata) voor N. vitripennis embryo oviposition. (A) Jong en oud S. bullata poppen. Oudere poppen hebben een donkerder schubbenlaag terwijl jongere poppen een meer rode tint aan hun cuticula hebben. Jongere poppen hebben de voorkeur voor het maximaliseren van de oviposition. Posterieure en anterieure uiteinden van de poppen kunnen ook worden onderscheiden door een "krater-achtige opening aan het achterste uiteinde, overwegende dat het anterior einde naar een afgeronde punt komt. (B) Host (S. bullata) Verpopping voorbereiding N. vitripennis embryo oviposition. Invoegen van de host-poppen in een schuim stekkertje een poppen heeft grootte gat uitgehakt. Hebben de posterieure kant van het gezicht van de poppen host binnen de stekker terwijl 0.2 cm van het voorste einde blootgesteld te voorzien in maximale concentratie van oviposition in het voorste gedeelte. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Tijdlijn voor het maken van N. vitripennis mutanten door microinjection. Tijdlijn van de N. vitripennis embryo's worden verzameld, CRISPR/Cas9 microinjection en na injectie procedures. N. vitripennis volwassenen mochten om te paren in afwezigheid van een oviposition site voor 4 dagen (ik). Na, een vers, flesh vliegen host poppen, S. bullata, geplaatst in een schuim stop over alleen het bloot van 0,5 cm van de posterieure einde, werd geïntroduceerd in de gravid vrouwtjes voor 45 min toe voor parasitization (ii). Gelijktijdig werden injectie materialen waaronder microinjection naalden- en CRISPR/Cas9 onderdelen voorbereid (iii). Embryo's zijn verzameld uit het gastland (iv), uitgelijnd (v) en ingespoten met CRISPR/Cas9 onderdelen (vi). De geïnjecteerde embryo's werden zorgvuldig overgebracht terug naar een vooraf gestoken host (vii) en geïncubeerd tot volledig ontwikkelde (14 dagen) (viii). Wanneer de volwassenen ontstaan, waren mutanten gescreend voor fenotypes van verwachte CRISPR/Cas9 geïnduceerde mutaties in het target-gen (ix). De gehele procedure duurt doorgaans 19 dagen in beslag. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Gemodificeerde microscoopglaasje voor embryo's voering. (A) A dekglaasje aan. (B) een microscoopglaasje. (C) een embryo aanpassing apparaat.Een dekglaasje aan kan worden gelijmd op een microscoopglaasje op lijn embryo's worden gebruikt voor injectie. Het doel van het dekglaasje aan is om op te treden als een rand om te zorgen voor gemakkelijke manipulatie en bekleding van embryo's. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 . Injectie naald voorbereiding. (A) voorbeelden van goede en slechte aluminosilicaat glas naalden. (B) de tips van een unbeveled, goed schuine en slecht schuine naald. Aluminosilicaat glazen capillaire buizen werden getrokken met behulp van een trekker van de micropipet. De geproduceerde naald tips waren dan voorzichtig geopend en verfijnd met behulp van een beveler. De goed afgeronde naald heeft een zeer scherp tip, en de slechte schuine naald heeft een botte tip. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Capillaire glas Type | Sutter naald Puller Model | Warmte | Filament | Velocity | Vertraging | Trek | Druk |
| Kwarts | P-2000 | 750 | 4 | 40 | 150 | 165 | - |
| Aluminosilicaat | P-1000 | 605 | - | 130 | 80 | 70 | 500 |
| Borosilicaat | P-1000 | 450 | - | 130 | 80 | 70 | 500 |
Tabel 1. Instellingen voor de trekker van de naald.
Opmerking: Naald trekker instelling variëren van machine naar machine zodat elk lab zult nodig hebben hun eigen naald trekker instellingen optimaliseren. Deze tabel is gewijzigd van Li et al. 21
| sgRNA-1 | Cas9 | Totale embryo 's | Transplantatie (10% vochtigheid) | Transplantatie (70% vochtigheid) | |||
| Larven overlevenden | Larven overlevenden | Volwassen overlevenden | |||||
| Totaal (%) | Totaal (%) | ♂ | ♀ | Totaal (%) | |||
| Geen injectie | Geen injectie | 100 | 94 (94) | 96 (96) | 66 | 26 | 92 (92) |
| Water | Water | 100 | 0 (0) | 78 (78) | 44 | 32 | 76 (76) |
| 20 ng/µL | 20 ng/µL | 100 | 0 (0) | 74 (74) | 34 | 34 | 68 (68) |
| 40 ng/µL | 40 ng/µL | 100 | 0 (0) | 67 (67) | 30 | 32 | 62 (62) |
| 80 ng/µL | 80 ng/µL | 100 | 0 (0) | 53 (53) | 24 | 22 | 46 (46) |
| 160 ng/µL | 160 ng/µL | 100 | 0 (0) | 41 (41) | 16 | 22 | 38 (38) |
| 320 ng/µL | 320 ng/µL | 100 | 0 (0) | 25 (25) | 10 | 10 | 20 (20) |
Tabel 2. Injectie en -transplantatie nabestaanden en mutagenese tarieven gebaseerd op de injecties van verschillende concentraties van sgRNA en Cas9. Deze tabel is gewijzigd van Li et al. 21
Discussion
De recente sequentiebepaling van het genoom van de N. vitripennis heeft ontketend een belangrijke behoefte voor moleculaire tools te karakteriseren functioneel onbekende genen binnen deze soorten23. Het CRISPR-Cas9-systeem, en vele andere gen bewerkingsgereedschappen, hebben bewezen waardevol zijn bij het onderzoeken van gene functies voor een aantal organismen24. Echter voor het genereren van erfelijke mutaties, nodig deze tools embryo microinjections uitvoeren. Daarom aangetoond hier is een gedetailleerde visuele techniek die een aantal innovaties waarmee bevat voor efficiënte N. vitripennis embryo microinjections.
Over het algemeen deze gedetailleerde techniek biedt een aantal belangrijke innovaties, ten opzichte van bestaande methoden23, die voorzien in efficiënte N. vitripennis embryo microinjections. Bijvoorbeeld om te vergemakkelijken de snelle verzamelen van embryo's, wordt een oviposition-instrument (schuim stopper) gemaakt en gebruikt om te beperken ei leggen geheel naar het posterieure einde van de host (Figuur 1), die sterk vergemakkelijkt verzamelen van talrijke embryo's binnen een korte periode van tijd. Technieken voor het opfokken van wasp kolonies met grote aantallen voor het verzamelen van grotere aantallen van eieren zijn ook verbeterd en gedefinieerd. Bovendien, om te versnellen embryo uitlijning, is een embryo aanpassing apparaat waarmee dat embryo's efficiënt worden uitgelijnd en worden geïnjecteerd zonder having voor toepassing dubbelzijdig plakband teneinde de embryo's plaats (Figuur 3) ontwikkeld.
Anderzijds komt dat doordat de embryo's vochtig met water tijdens de injectie en niet desiccating van de embryo's of hen af te dekken met olie overlevingskans van de patiënt verbeterde. Bovendien verschillende capillaire glassoorten zijn getest en parameters voor het samenstellen van de perfecte naalden voor N. vitripennis microinjection (tabel 1, Figuur 4) worden bepaald. Bovendien volgende microinjection, embryo overleving tarieven zijn in staat om aanzienlijk te verhogen als gevolg van ingespoten eieren in vooraf gestoken hosts aan het broeden in hoge-vochtigheid (70%) kamers geplaatst. Deze innovaties zorgen voor een meer gestroomlijnde en succesvolle microinjection procedure voor N. vitripennis.
Kleine wijzigingen in termen van injectie apparatuur, en het grootbrengen van de procedures kunnen worden aangebracht bij dit protocol, afhankelijk van de voorkeuren van de gebruiker. Een aantal kritische stappen zullen echter essentieel voor het met succes het genereren van mutanten in de N. vitripennis. Bijvoorbeeld, werken snel zodat ingespoten embryo's zijn > 1 h oude, en ervoor te zorgen dat injectie naalden scherp genoeg om te minimaliseren van schade aan het embryo beide zullen essentieel. Hoewel dit protocol moet effectief voor het genereren van mutaties in de genen van vele (zo niet alle), is een belangrijke beperking de eis van de CRIPSR/Cas9 te richten op een reeks van PAM (NGG) die de volgorde van de doelgroep zal dicteren.
Kortom, kan deze verbeterde techniek worden gebruikt voor het genereren van vele soorten genoom wijzigingen, zoals mutaties, verwijderingen, en misschien zelfs invoegen met behulp van CRIPSR/Cas9 technologieën21, of zelfs transgenic invoegingen voor het genereren van transgene N. vitripennis, die zeer functioneel onderzoek in dit organisme moet versnellen.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door een genereuze University of California, Riverside (UCR) laboratorium startfonds, gevormd O.S.A, USDA nationale Instituut voor voedsel en landbouw (NIFA) Hatch Fuenllana project (1009509)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bugdorm | Bugdorm | 41515 | Insect Rearing Cage |
| Glass Test Tubes | Fisher Scientific | 982010 | |
| Flesh fly pupae, Sarcophaga bullata | Carolina Insects | 144440 | |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV10 | |
| Diamond abrasive plate (0.7u to 2.0u tip sizes) | Sutter Instruments | 104E | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | Kite R | |
| Femtojet Express programmable microinjector | Eppendorf | ||
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 or P-2000 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 | |
| Compound Microscope | Leica DM-750 | ||
| Aluminosilicate glass capillary tubing 1mm(outside diameter) X 0.58mm (inner diameter) | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Can also use Borosilicate or Quartz |
| Identi-Plugs | JAECE | L800-B | Foam plugs |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | |
| Micro Cover glass | VWR | 48366045 | |
| Adhesive | Aron Alpha | AA471 | For glueing coverslip onto microscope slide |
| Fine-tip paintbrush | ZEM | 2595 | |
| Ultra-fine tip forcep | Fisher Scientific | 16-100-121 | |
| Femtotips Microloader tips | Fisher Scientific | E5242956003 |
References
- Rivers, D. B., Denlinger, D. L. Developmental fate of the flesh fly, Sarcophaga bullata, envenomated by the pupal ectoparasitoid, Nasonia vitripennis. J Insect Physiol. 40 (2), 121-127 (1994).
- Whiting, A. R. The Biology of the Parasitic Wasp Mormoniella vitripennis [=Nasonia brevicornis] (Walker). Q Rev Biol. 42 (3), 333-406 (1967).
- Ferree, P. M., Avery, A., Azpurua, J., Wilkes, T., Werren, J. H. A bacterium targets maternally inherited centrosomes to kill males in Nasonia. Curr Biol. 18 (18), 1409-1414 (2008).
- Hurst, G. Male-Killing Bacteria in Insects: Mechanisms, Incidence, and Implications. Emerg Infect Dis. 6 (4), 329-336 (2000).
- Aldrich, J. C., Leibholz, A., Cheema, M. S., Ausiό, J., Ferree, P. M. A "selfish" B chromosome induces genome elimination by disrupting the histone code in the jewel wasp Nasonia vitripennis. Sci Rep. 7, 42551 (2017).
- Werren, J. H., Stouthamer, R. PSR (paternal sex ratio) chromosomes: the ultimate selfish genetic elements. Genetica. 117 (1), 85-101 (2003).
- Nur, U., Werren, J. H., Eickbush, D. G., Burke, W. D., Eickbush, T. H. A "selfish" B chromosome that enhances its transmission by eliminating the paternal genome. Science. 240 (4851), 512-514 (1988).
- Danneels, E. L., Rivers, D. B., de Graaf, D. C. Venom Proteins of the Parasitoid Wasp Nasonia vitripennis: Recent Discovery of an Untapped Pharmacopee. Toxins. 2 (4), 494-516 (2010).
- de Graaf, D. C., et al. Insights into the venom composition of the ectoparasitoid wasp Nasonia vitripennis from bioinformatic and proteomic studies. Insect Mol Biol. 19 Suppl 1, 11-26 (2010).
- Verhulst, E. C., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. W. Maternal control of haplodiploid sex determination in the wasp Nasonia. Science. 328 (5978), 620-623 (2010).
- Grillenberger, B. K., et al. Genetic structure of natural Nasonia vitripennis populations: validating assumptions of sex-ratio theory. Mol Ecol. 17 (12), 2854-2864 (2008).
- Pultz, M. A. A major role for zygotic hunchback in patterning the Nasonia embryo. Development. 132 (16), 3705-3715 (2005).
- Lynch, J. A., Brent, A. E., Leaf, D. S., Pultz, M. A., Desplan, C. Localized maternal orthodenticle patterns anterior and posterior in the long germ wasp Nasonia. Nature. 439 (7077), 728-732 (2006).
- Lynch, J. A., Olesnicky, E. C., Desplan, C. Regulation and function of tailless in the long germ wasp Nasonia vitripennis. Dev Genes Evol. 216 (7-8), 493-498 (2006).
- Werren, J. H., et al. Functional and evolutionary insights from the genomes of three parasitoid Nasonia species. Science. 327 (5963), 343-348 (2010).
- Ferree, P. M., Fang, C., Mastrodimos, M., Hay, B. A., Amrhein, H., Akbari, O. S. Identification of Genes Uniquely Expressed in the Germ-Line Tissues of the Jewel Wasp Nasonia vitripennis. G3. 5 (12), 2647-2653 (2015).
- Akbari, O. S., Antoshechkin, I., Hay, B. A., Ferree, P. M. Transcriptome profiling of Nasonia vitripennis testis reveals novel transcripts expressed from the selfish B chromosome, paternal sex ratio. G3. 3 (9), 1597-1605 (2013).
- Sackton, T. B., Werren, J. H., Clark, A. G. Characterizing the infection-induced transcriptome of Nasonia vitripennis reveals a preponderance of taxonomically-restricted immune genes. PloS one. 8 (12), e83984 (2013).
- Werren, J. H., Loehlin, D. W., Giebel, J. D. Larval RNAi in Nasonia (parasitoid wasp). Cold Spring Harb Protoc. (10), (2009).
- Lynch, J. A., Desplan, C. A method for parental RNA interference in the wasp Nasonia vitripennis. Nat Protoc. 1 (1), 486-494 (2006).
- Li, M., et al. Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9. Sci Rep. 7 (1), 901 (2017).
- Meer, M. M. M., Witteveldt, J., Stouthamer, R. Development of a microinjection protocol for the parasitoid Nasonia vitripennis. Entomol Exp Appl. 93 (3), 323-327 (1999).
- Werren, J. H., et al. Functional and evolutionary insights from the genomes of three parasitoid Nasonia species. Science. 327 (5963), 343-348 (2010).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
