Articolo metodologico
Membrana cellulare ferendo tramite due fotoni laser è un metodo ampiamente usato per la valutazione della membrana risigillazione capacità e può essere applicato a più tipi di cellule. Qui, descriviamo un protocollo in vitro live-imaging per membrana menzionerà in disferlinopatia paziente cellule dopo ablazione laser del due-fotone.
Numerosi insulti patofisiologici possono danneggiare le membrane cellulari e, quando accoppiato con difetti innati nella riparazione della membrana cellulare o integrità, possono provocare la malattia. Comprensione dei meccanismi molecolari sottostanti che circonda la riparazione della membrana delle cellule è, pertanto, un obiettivo importante per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche per malattie connesse con dinamiche disfunzionali della membrana cellulare. Molti studi in vitro ed in vivo , finalizzati alla comprensione di chiusura in vari contesti di malattia della membrana cellulare utilizzano l'ablazione laser del due-fotone come standard per la determinazione dei risultati funzionali dopo trattamenti sperimentali. In questa analisi, le membrane cellulari sono sottoposte a ferimento con un laser del due-fotone, che provoca la membrana cellulare per rottura e tintura fluorescente per infiltrarsi nella cella. L'intensità di fluorescenza all'interno della cellula può essere monitorata quindi per quantificare la capacità della cellula di risigillare stessa. Ci sono diversi metodi alternativi per la valutazione della risposta della membrana cellulare a lesioni, come pure la grande variazione nel due-fotone laser ferendo approccio stesso, pertanto, un modello unificato di cella ferendo beneficamente servirebbe a diminuire il variazione tra queste metodologie. In questo articolo, descriviamo un semplice due fotoni laser ferendo il protocollo per la valutazione della membrana cellulare riparazione in vitro in entrambi sani e disferlinopatia paziente del fibroblasto cellule trasfettate con o senza un plasmide dysferlin full-length.
La membrana cellulare delle cellule eucariotiche è costituito da un doppio strato di fosfolipidi tempestato di proteina che definisce l'ambiente intra/extracellulari della cella ed è essenziale per il mantenimento della sopravvivenza delle cellule e l'omeostasi cellulare. Membrana cellulare lesioni derivanti da insulti meccanici o chimici sono comuni in vari tipi di cellule di mammiferi, tra cui scheletrico e muscolo cardiaco, stomaco e polmone cellule1,2,3,4. Oltre alle lesioni conseguenti alla funzione fisiologica quotidiana, le membrane c....
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Cellule umane del fibroblasto utilizzate in questo studio sono state utilizzate con l'approvazione del Comitato di etica umana della facoltà di medicina e odontoiatria presso l'Università di Alberta.
1. transfezione delle celle con Full-Length del plasmide DYSF
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Fibroblasti umani sani, nei fibroblasti del paziente non trattato disferlinopatia e nei fibroblasti del paziente transfettati con un plasmide contenente la sequenza di dysferlin full-length sono stati sottoposti a due fotoni laser ferendo per valutare la chiusura della capacità di membrana in tempo reale. Le cellule del fibroblasto umano sano visualizzato bassi livelli di attivazione di fluorescenza FM 4-64 segue laser ferendo e fibroblasti di pazienti non trattati hanno esibito un alto g.......
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Ferendo due fotoni laser della membrana cellulare è una tecnica versatile e precisa per valutare le dinamiche della membrana una chiusura in vitro. In questo articolo, abbiamo descritto un protocollo per la determinazione della membrana cellulare chiusura della capacità in disferlinopatia paziente cellule utilizzando il laser del due-fotone ferendo dosaggio. I nostri risultati indicano che le cellule pazienti disferlinopatia sono difettose in chiusura della membrana cellulare, che è coerente con i risultati di a.......
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Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Questo lavoro è stato supportato dalla University of Alberta facoltà di medicina e odontoiatria, The gli amici di Garrett Cumming ricerca sedia, HM Toupin neurologici scienza ricerca sedia fondo, distrofia muscolare Canada, Canada Fondazione per l'innovazione (CFI), Alberta educazione e tecnologia avanzata (AET), istituti canadesi di Health Research (CIHR), viaggio di Jesse - la Fondazione per Gene e terapia cellulare, donne e Health Research Institute bambini (WCHRI), e Alberta innova soluzioni di salute (AIHS ).
Vorremmo ringraziare il Dr. Steven Laval per la fornitura di noi con il plasmide dysferlin full-length. Vorremmo anche ringrazia....
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11320033 | |
| Siero fetale bovino | Sigma-Aldrich | F1051 | |
| Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Tripsina-EDTA (0,05%), rosso fenolo | Thermo Fisher | 25300062 | |
| Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Piastre con fondo in vetro rivestite di collagene da 35 mm | MatTek | P53GCOL-1.5-14-C | |
| Terreni privi di siero | Thermo Fisher | 31985070 | |
| Reagente di trasfezione | Thermo Fisher | 15338100 | |
| FM 4-64 Colorante | Invitrogen | T13320 | |
| Tyrode' s Sali Soluzione | Sigma-Aldrich | T2397 | |
| Microscopio a scansione laser confocale | Carl Zeiss | NA | |
| Chameleon Laser a due fotoni | coerente | NA |
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