Summary
Deze methode laat zien hoe om te visualiseren pathogen invasie in insect cellen met driedimensionale (3D) modellen. Hemocytes van Drosophila larven waren besmet met virale of bacteriële pathogenen, ex vivo of in vivo. Besmette hemocytes werden vervolgens vast en gekleurd voor imaging met een confocal microscoop en de daaropvolgende 3D cellulaire wederopbouw.
Abstract
Tijdens de pathogene infectie van Drosophila melanogaster, spelen hemocytes een belangrijke rol in de immuunrespons in de infectie. Het doel van dit protocol is dus een methode om te visualiseren de pathogen invasie in een specifieke immuun compartiment van vliegen, namelijk hemocytes te ontwikkelen. Met behulp van de methode gepresenteerde, maximaal 3 × 10 kunnen6 live hemocytes worden verkregen bij 200 Drosophila 3rd instar-larven in 30 min. voor ex vivo infectie. Anderzijds kunnen hemocytes besmette in vivo via injectie van 3rd instar-larven opgevolgd door hemocyte extractie tot 24 uur na infectie. Deze besmette primaire cellen werden vastgesteld, gekleurd, en beeld met behulp van de confocal microscopie. 3D voorstellingen werden vervolgens gegenereerd van de afbeeldingen tot definitief Toon pathogen invasie. Daarnaast kwalitatief hoogwaardige RNA voor qRT-PCR kan worden verkregen voor het opsporen van het pathogene agens mRNA volgende infectie, en voldoende eiwit kan worden geëxtraheerd uit deze cellen voor westelijke vlekkenanalyse. Tezamen, presenteren we een methode voor definitieve verzoening van pathogen invasie en bevestiging van de infectie met behulp van bacteriële en virale pathogen typen en een efficiënte methode voor de extractie van de hemocyte te krijgen genoeg live hemocytes van Drosophila larven voor ex vivo en in vivo experimenten van de infectie.
Introduction
Drosophila melanogaster is een gevestigde modelorganisme voor de studie van aangeboren immuniteit1. Tijdens de aangeboren immuunrespons spelen hemocytes een belangrijke rol in de reactie op pathogene uitdaging. Hemocytes zijn van cruciaal belang voor het inkapselen van parasieten, evenals hebbend een belangrijke functie bij de bestrijding van het pathogene agens via fagocytische actie tijdens schimmel, virale en bacteriële infectie2,3.
Om best begrijpen van de host ingeboren immuunreactie op pathogene microbiële infectie, is het belangrijk om te visualiseren hoe het pathogene agens gastheer cellen binnenvalt tijdens infectie. Deze visualisatie draagt bij aan een goed begrip van het mechanisme van de invasie. Samen met details voor pathogen intracellulaire lokalisatie en de cellulaire respons bieden deze gegevens aanwijzingen over de reactie van de gastheer op infectie en de cellulaire organellen waarmee de microbe samenwerkt. 3D-model wederopbouw na beeldvorming door microscopie kunnen dus nuttig om te bepalen van de precieze locatie van ziektekiemen in de cellen van de gastheer. In deze studie gevisualiseerd we de invasie van Coxiella burnetii (C. burnetii), de verwekker van Q-koorts, een zoönotische ziekte die een ernstige bedreiging voor de gezondheid van mens en dier, in primaire Drosophila hemocytes vormt. Onlangs, werd aangetoond dat Drosophila zijn gevoelig voor het bioveiligheidsniveau 2 Nine Mile fase II (NMII) kloon 4 stam van C. burnetii is en dat deze spanning kan repliceren in Drosophila4, die aangeeft dat Drosophila kan worden gebruikt als een modelorganisme voor het bestuderen van de pathogenese van C. burnetii .
Eerdere studies hebben gewend hemocytes onderzoeken van de host immuunrespons aangeboren. Hemocytes zijn gebruikt voor morfologische opmerkingen5,6,7, Morfometrische analyse2,8, fagocytose analyse2,3, qRT-PCR2 , 9immunoprecipitation10,11, immunefluorescentie analyse10,12, immunokleuring13, immunoblotting3,10, 11 en immunohistochemistry9,14. Hoewel Drosophila S2 cellen ook beschikbaar voor verschillende in vitro experimenten zijn, veranderen immortalization en potentiële bestaande virale infectie hun gedrag15,16. Het gebruik van primaire cellen in tegenstelling tot een vereeuwigd cellijn, zoals S2 cellen, zorgt voor de studie van het aangeboren immuun functie in een systeem meer representatief is voor het hele organisme. Bovendien is de infectie van hemocytes in vivo, voorafgaand aan de winning, kunt de cellen om te interageren met andere host eiwitten en weefsel, een voordeel ten opzichte van extractie van hemocytes vóór ex vivo infectie. Een aantal verschillende methoden hebben gebruikt om het verkrijgen van een voldoende aantal hemocytes in een korte periode van tijd om te houden van de hemocytes leeft8,17,18,19.
In deze studie presenteren we een methode om hemocytes extract van Drosophila 3rd instar-larven voor pathogene microbiële infectie met C. burnetii, Listeria monocytogenes (Listeria) of Invertebrate iriserende Virus 6 (IIV6). We beschrijven de methoden voor in vivo en ex vivo hemocyte infecties. In vivo- en ex vivo-besmette hemocytes waren gevisualiseerd met confocale microscopie en gebruikt voor het bouwen van 3D-modellen van de C. burnetii invasie. Bovendien, met behulp van het protocol van de extractie, ex vivo-besmette hemocytes werden gebruikt voor gen- en eiwit expressie testen. In het bijzonder om te onderzoeken in hoeverre van infectie met IIV6 en Listeria, werd totaal RNA of eiwit geïsoleerd uit de cellen voor qRT-PCR of westelijke vlekkenanalyse. Samen genomen, het protocol biedt methoden voor het verzamelen van snel grote aantallen hemocytes van 3rd instar-larven en bewijs dat primaire hemocytes, besmet in vivo of ex vivo, zijn een geschikt platform voor microbiële pathogen infectie studies en toepasselijke downstream analyses uitgevoerd, zoals microscopie, transcriptomics en proteomics.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ex vivo infectie
- Medium en apparatuur
- Bereiden onder steriele condities, verse Drosophila Hemocyte isoleren Medium (DHIM) met 75% Schneiders Drosophila medium met 25% foetale boviene Serum (FBS) en filter steriliseren het.
- Laag 2-3 stukjes van 10 x 10 cm paraffine film onder een stereomicroscoop.
- De glazen viscometerbuizen voor te bereiden. De trekker van de capillaire kachel ingesteld op 55% van de maximale. Trek het capillair tot een scherpe punt van ongeveer 10 µm.
- Aanvulling van de funderingsput het capillair met minerale olie.
- Monteren van gevulde capillaire buis op het nanoinjector (Figuur 1A) en open uiteinde dichtgesmolten capillair door het afbreken van het uiteinde met een tang (Figuur 1B). De buitendiameter van de tip dient 100 µm voor gemakkelijke opname van de hemocytes.
- Uitwerpen van zo veel olie mogelijk van de capillaire buis tip, vul dan met DHIM. Voor eenvoudige visualisatie van de grens van up-genomen Hemolymfe en de olie, bevatten een luchtbel tussen de olie- en DHIM (Figuur 1B').
- Hemolymfe extractie
- Kies 3rd instar Drosophila larven van binnenuit muur van voedsel flesjes voorzichtig met een pincet en plaats hen in een 100 µm zeef (Figuur 1C). 3rd instar-larven zijn 3-6 dagen na vruchtbare ei leggen door een volwassen vrouwtje te vinden.
Opmerking: Deze experimenten gebruikt het genotype, w1118; P {w+ mC= Hml-GAL4.Δ} 2, P {w+ mC= UAS-2xEGFP} AH2, aangezien hemocytes van deze dieren express verbeterde groen fluorescent proteïne (EGFP) om te helpen bij de identificatie van de cellen door microscopie. - 5 mL steriel water giet larven en schud de zeef voor 5 s. plaats de zeef op taak wissen om het overtollige water te verwijderen (Figuur 1C').
- Breng de larven in een tube van 1,5 mL microcentrifuge. Anesthetize hen met CO2 gas voor 5 s (Figuur 1D).
- Plaats de larven op paraffine film onder de stereomicroscoop, met de dorsale-zijde naar boven(Figuur 2).
- Plaats het glas capillaire licht op het larvale posterieure lichaam op zijn plaats te houden en verstoren de posterieure cuticle openen met behulp van fijn puntige pincet (Figuur 2B).
- Laat de Hemolymfe te stromen naar de paraffine film (Figuur 2C).
- Een pool van Hemolymfe met inbegrip van hemocytes van 20-50 larven op een moment op de paraffine-film te maken.
- Duren gepoolde Hemolymfe met behulp van de glazen capillaire op het nanoinjector (Figuur 2D).
Opmerking: Er mag ongeveer 10-20 µL van Hemolymfe. - Werpen de Hemolymfe in een tube van 1,5 mL microcentrifuge met 500 µL van DHIM(Figuur 2).
- Herhaal de stappen 1.2.4) - 1.2.9) voor elke batch van larven.
- Kies 3rd instar Drosophila larven van binnenuit muur van voedsel flesjes voorzichtig met een pincet en plaats hen in een 100 µm zeef (Figuur 1C). 3rd instar-larven zijn 3-6 dagen na vruchtbare ei leggen door een volwassen vrouwtje te vinden.
- Het aantal hemocytes te tellen.
- Pipetteer 5 µL van 0.4% Trypan blauw-oplossing in een tube 0,6 mL microcentrifuge om de dode cellen vlek. Voorzichtig mengen de DHIM en de hemocytes in de 1,5 mL-buis met behulp van een precisiepipet, en breng 5 µL van DHIM met inbegrip van de hemocytes aan de 0,6 mL microcentrifuge buis en meng voorzichtig.
- Pipetteer 10 µL van cellen uit het mengsel van 1:1 Trypan blauw: hemocyte in de hemocytometer.
- Het aantal levende hemocytes, die zijn niet gekleurd met Trypan blauw in elk van de velden 4 hoek van de hemocytomter en bereken de concentratie van de hemocytes per milliliter met behulp van de formule:
waarbij X staat voor de concentratie van levende hemocytes per milliliter; a, b, c en d zijn het aantal levende cellen (zoals bepaald door Trypan blauwe uitsluiting) in elk 4 velden geteld in de hemocytometer. Deling door 2 van het totale aantal cellen geteld is te wijten aan de verdunning 1:1 van de cellen met blauwe Trypan. Gekleurd met Trypan blauwe cellen worden beschouwd als dood.
-
Ex vivo Infecties
- Bepaal het aantal putten te worden ontpit met cellen op basis van timepoints en biologische repliceert u nodig hebt voor elk experiment. 5.0 × 104 hemocytes zijn wenselijk voor RNA en eiwit zuivering na infectie.
- Bereken het volume van de ziekteverwekker voorraad moeten worden verdund met DHIM voor infectie met behulp van de volgende formule:
waar multipliciteit van infectie (MOI) is het aantal virale of bacteriën gewenst per cel.
Opmerking: MOI gebruikt hangt af van de individuele experiment en tests uitgevoerd. Hier, 10 genoom equivalenten (GE) / cel C. burnetii, of 10 CFU/cel van Listeria, 1 TCID50distributiedatum van IIV6 werd gebruikt. - 500 µL van pathogen medium voorbereiden door elk putje van de plaat van een 24-well door het juiste volume van DHIM toe te voegen aan het virale of bacteriële volume in een buis.
- Plaats een 12 mm ronde cover glas (nr. 1 dikte) in een put van een 24-well-plate.
- Het splitsen van de DHIM met inbegrip van de hemocytes in de putjes van de plaat van een 24-well.
- 500 µL van pathogen medium toevoegen aan hemocytes in een put.
- Centrifugeer de plaat bij 1.000 x g gedurende 5 min.
- Incubeer de plaat gedurende 1 uur bij 28 ° C. Elke 15 min, zachtjes kantelen de plaat van terug naar voorzijde en links naar rechts voor 5 s met de hand.
- Na de 1 h van invasie/bijlage stap 1.4.8), zachtjes Pipetteer af het pathogeen medium en wassen van de hemocytes met verse DHIM en het vullen met 500 µL van verse DHIM.
- Incubeer de besmette hemocytes gedurende de gewenste tijd. In deze experimenten, C. burnetii- of IIV6-besmet hemocytes worden ge¨ uncubeerd 24u en Listeria-besmette hemocytes worden ge¨ uncubeerd 1, 2 of 4 uur.
2. in vivo infectie
- Infectie
- Warm de Drosophila fruit sap agarplaat bij kamertemperatuur voor 15 min. platen zijn gemaakt zoals eerder beschreven20.
- 30 g agar toevoegen aan 700 mL water en autoclaaf voor 40 min.
- Los 0,5 g methyl paraben in 10 mL absolute ethanol.
- Voeg de methyl paraben oplossing tot 300 mL van vruchtensapconcentraat.
- Snel Meng het sap concentraat in de gesteriliseerde met autoclaaf agar-oplossing en 5 mL in 10 × 35 mm petrischalen afzien.
- Nadat de platen zijn afgekoeld gedurende 15 minuten, bewaar ze bij 4 ° C.
- Bereiden van 3rd instar-larven als volgt 1.2.1) - 1.2.3).
- Plaats de gist plakken op een agarplaat. Maak een fijn gesneden in de agarplaat waar de larven migreren kunnen om te voorkomen dat het drogen (Figuur 3A). Monteren van een 0,001 mm puntige wolfraam naald met een pincet gebruik van paraffine film(figuur 3, onderB, C) bedrijf.
- Pipeteer 50 µL van hoge-titer mCherry waarin -C. burnetii (5,95 × 109 GE/mL) op de paraffine film onder de stereomicroscoop en plaats de larven in het zwembad van bacteriën.
- Plaats de larven in het zwembad van bacteriën. De larven prikken met een naald van wolfraam (Figuur 3D). Overdracht van de larven op een bord van de agar (Figuur 3E).
- Overdracht van de resterende pathogen medium op het bord van de agar en verzegel de plaat met paraffine film.
- De larven op de plaat in vochtige lucht houden totdat de gewenste tijd na infectie (Figuur 3F). In dit experiment, C. burnetii-geïnfecteerde larven zijn op de plaat voor 24u.
- Warm de Drosophila fruit sap agarplaat bij kamertemperatuur voor 15 min. platen zijn gemaakt zoals eerder beschreven20.
- Hemolymfe extractie en beplating van hemocytes
- Bereiden van het medium en apparatuur na stap 1.1).
- Plaats een 12 mm ronde cover glas (nr. 1 dikte) in een put van een 24-well-plate. Pipetteer 500 µL van DHIM in de put.
- Extract de Hemolymfe uit de geïnfecteerde larven als volgt 1.2.4) 1.2.8).
- Werpen van de Hemolymfe in goed onderstaande stap 2.2.2).
- Herhaal 2.2.3) en 2.2.4) voor meervoudige batches van larven.
- Centrifugeer de plaat bij 1.000 x g gedurende 5 min.
3. visualisatie
- Vaststelling en vlekken
- Na het toestaan van de hemocytes te vestigen op het ronde glas van de cover in de put, zachtjes het medium van elk putje te verwijderen.
- Voeg voorzichtig 200 µL van 4% paraformaldehyde (PFA) aan elk putje van vaste hemocytes. Laat de hemocytes gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur inwerken.
- Verwijderen van de 4% PFA en zachtjes Voeg 200 µL van PBS met 0,1% Triton X-100 en 1% boviene serumalbumine (BSA) aan elk putje. Laat de hemocytes gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur inwerken.
- Verwijder de PBS en zachtjes Voeg 200 µL van 1 × 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) aan elk putje. De hemocytes gedurende 10 minuten in het donker bij kamertemperatuur incuberen.
- Verwijder de DAPI-oplossing en zachtjes PBS toevoegen aan elk putje. Laat de hemocytes gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur inwerken.
- 10 µL van het medium antifade montage op een glasplaatje Microscoop neerzet.
- Na het verwijderen van de PBS van elk putje, door de glazen cover uit de 24-well plaat met behulp van fine-puntige pincet te verwijderen. Zachtjes het glas cover op de antifade montage medium op het glasplaatje, met de hemocytes naar beneden te plaatsen.
- Laat de dia te drogen door deze te plaatsen in het donker 's nachts.
- Confocale Imaging
- Configureren van de confocal microscoop voor drie kleur beeldvorming van de DAPI EGFP en mCherry. De volgende instellingen gebruiken: DAPI excitatie (ex-) 405 nm, emissie (em) 415-480 nm; EGFP ex 488 nm, em 493-564 nm; mCherry ex 587 nm, em 597-700 nm.
- Leg het monster met de Microscoop en de focus op het monster met behulp van een 63 X / 1.4 numerieke diafragma (nvt) doelstelling. Zoek de gewenste hemocytes in het gezichtsveld voor imaging.
- Aanpassen van de macht en detector winsten laser om te bereiken van de juiste belichting van het monster. Controleer meerdere z-vliegtuigen om ervoor te zorgen dat het niveau van blootstelling is geschikt voor de gehele steekproef dikte.
- Het vinden van de bovenste en onderste positie op de z-as van een hele hemocyte. Deze positie als de begin- en eindposities voor z-afdelen instelt.
- Gebruik alleen scannen zoom om de afbeelding het gebied met de hemocyte. Zoom veelvouden van 3 X worden vaak gebruikt.
- Verzamelen van de serie van de afbeelding op de juiste resolutie, zoals 1024 x 1024 pixels in het x-y vlak en 0,3 µm afstand in de z-dimensie.
- Wederopbouw van het 3D-model
Opmerking: Open-sourcesoftware bestaat waarmee veel van de functies die hieronder beschreven voor de wederopbouw van het 3D-model.- Importeer het bestand van de serie z-gesegmenteerd afbeelding in de software gekoppeld van de confocal microscoop voor de wederopbouw van het 3D-model.
- Selecteer een cel weergegeven: Co lokalisatie van kernen gekleurd met DAPI en mCherry uiten van C. burnetii in een EGFP uiting van hemocyte. Gewas het beeld serie bevat slechts een enkele cel.
- Selecteer de 3D-Viewer optie die Hiermee reconstrueert u het 3D-model met behulp van voorverpakte algoritme van de software. Kies het gewenste type 3D-weergave tussen Blend, oppervlak en gemengde opties. Bij deze methode, worden hemocytes, kernen en C. burnetii weergegeven met behulp van surface modellen.
- Observeren de 3D gereconstrueerde cel vanuit verschillende posities bekijken door de muisknop ingedrukt te houden en de cursor over het scherm te slepen. De cel afdrukstand en positie van de gemodelleerde lichtbron voor het optimaliseren van het beeld aanpassen. Andere opties voor dekking, Minimum en Maximum drempelwaarde, Specular, Ambient, Shineness en Gamma bestaan voor het optimaliseren van het beeld.
- Neem dwarsdoorsneden via het objectmodel met opdrachten clipping en vectorafbeeldingsbestanden te visualiseren de interieur inhoud van de hemocyte.
4. toepassing voor gen en/of eiwit analyse
- Na de infectie met IIV6 en Listeria, lyse cellen voor latere qRT-PCR of westelijke vlekkenanalyse21 en volgende fabrikant instructies zoals hiervoor is beschreven.
Opmerking: Raadpleeg de Tabel van materialen voor de inleidingen voor qRT-PCR en de antilichamen voor westelijke vlek. - Analyseren van PCR producten door agarose de Elektroforese van het gel, als eerder beschreven22, om ervoor te zorgen de juiste lengte van de versterkte product.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Als u wilt verzamelen waarmaken hemocytes voor ex vivo infectie, 3 × 10 werden6 hemocytes gehaald uit 200 Drosophila 3rd instar-larven. Ontwikkeling van onze methode, waren een aantal verschillende technieken geprobeerd. Individuele larvale dissectie zou maximaal 1,5 uur, en een gemiddelde van ~ 8000 cellen werden verkregen met behulp van deze methode18, waarvan de meeste niet levend door het einde van de collectie waren. Vervolgens, we hebben geprobeerd om uit te pakken Hemolymfe, die de hemocytes, vanaf 20 larven in een keer met een glazen capillair19, maar het capillair werd verstopt met Cuticula materiaal en de Hemolymfe watertje niet kundig voor efficiënt worden overgenomen door het glas capillair. Tot slot, we mechanisch verstoord de schubbenlaag van 20-50 larven per partij met fijne pincet12, en maakte een pool van Hemolymfe voor gemakkelijke opname. Hierdoor easy collectie van een grote hoeveelheid hemocytes uit een groot aantal larven (tabel 1).
Om aan te geven dat de uitgepakte hemocytes levend en geschikt voor de infectie waren, werd een Trypan blauwe uitsluiting assay uitgevoerd voor de berekening van het percentage van levende hemocytes geëxtraheerd met behulp van de methode die hier gepresenteerd (Figuur 6A). Bovendien, vergeleken we onze methode voor extractie van hemocyte met een eerder gepubliceerde methode waar het doel was het ontwikkelen van een verstoring van de mechanische methode om te isoleren en onderscheid maken tussen circuleren en inwoner hemocytes van individuele Drosophila larve23. Bij vergelijking tussen de twee methoden van 10 onafhankelijke experimentele isolatie, we kunnen constateren dat de levensvatbaarheid van de cellen was iets groter met behulp van de methode die hier gepresenteerd (Figuur 6A); echter, de methode van Petraki et al. leverde bijna tweemaal zoveel hemocytes van elk 10 ontleed larven (Figuur 6B). Een reden voor het toegenomen aantal hemocytes van het Petraki et al. methode is dat deze methode resident (sessiele) hemocytes, evenals de circulerende hemocytes verzamelt. Om te bevestigen dat de cellen geëxtraheerd met de methode die hier gepresenteerd in feite hemocytes waren, benut wij een vlieg lijn met transgenen voor de hemolectin (Hml) promotor rijden GAL4 in circulerende hemocytes die de upstream activator volgorde (UAS bindt) verbeterde groen fluorescent proteïne (EGFP) transcriptie en expressie in de hemocytes te activeren. Hemocytes van hml-GAL4 > UAS-EGFP larven werden gehaald in chambered dekglaasje dia's, vaste, permeabel en gekleurd met DAPI21zoals hiervoor is beschreven. Figuur 7 laat zien dat de meeste DAPI-positieve cellen ook EGFP-positief. Kwantificering van co meningsuiting werd uitgevoerd vanaf meerdere afbeeldingen, van die we berekend dat 86±9% van de cellen geïsoleerd waren hemocytes.
Het protocol in innovatieve 3D-modellen van pathogen invasie in Drosophila hemocytes 3rd instar-larven na ex vivo of in vivo C. burnetii infectie is onttrokken. We waren in staat om het imago van C. burnetii infectie omdat de bacteriën express mCherry. Nadat de besmette hemocytes werden vastgesteld en gekleurd, werden ze beeld voor DAPI EGFP en mCherry met behulp van de confocal microscopie. Hemocyte infectie tarieven, zoals bepaald door het percentage van EGFP-positieve cellen die eveneens tentoongesteld mCherry ingangsvideosignaal, voor zowel ex vivo of in vivo C. burnetii infecties was bijna 100%. Dit was te verwachten omdat een MOI van 10 GE/cel werd gebruikt voor ex vivo infectie, die leiden infectie van 100% van de cellen24 tot moet. Met betrekking tot de in vivo infecties, omdat larven zijn geplaatst in een druppel van de hoge-titer van mCherry waarin -C. burnetii (5,95 × 109 GE/mL), het aantal bacteriën ongeveer 10.000 hoger is dan het aantal hemocytes per larve. Daarom is een 100% besmettingstarief verwacht voor de infecties in vivo .
Z-profielen werden vervolgens verzameld door middel van de hemocyte te visualiseren de gehele cel in 3D en ter bevestiging van de aanwezigheid van C. burnetii in het interieur van de cel. Figuur 4 toont transparante dwarsdoorsneden van een hemocyte (in groen) met C. burnetii (in rood) te zien in het interieur van de cel. De beelden waren ook gereconstrueerd in een 3D-model (Figuur 5) vertegenwoordigen de oppervlakken van de hemocyte en C. burnetii, C. burnetii in het interieur van de cross-sectioned hemocytes opnieuw te tonen. Interessant, in vivo-besmette hemocytes tentoongesteld grotere cytoplasmatische extensies en waren platter in de natuur, terwijl ex vivo-besmette hemocytes werden meer bolvormig (Figuur 5). Dit kan duiden op een grotere bevolking van lamellocytes in de in-vivo-bevolking en plasmatocytes in de ex vivo bevolking7besmet. Terwijl lamellocyte differentiatie over het algemeen tijdens parasitaire wesp infectie25 veroorzaakt wordt, volstaat verwonding van de larven van Drosophila ook ertoe lamellocyte differentiatie26. Tot slot, terwijl niet wordt gebruikt in de experimenten die hier gepresenteerd, zijn er GFP-uiting vormen van Listeria27 en IIV628 , die kunnen worden gebruikt voor het genereren van 3D-modellen van hemocyte infectie. In plaats daarvan, Listeria- en IIV6-besmet hemocytes werden gebruikt voor het westelijke bevlekken en qRT-PCR experimenten.
Met behulp van de methode die hier gepresenteerd, infecties zijn uitgevoerd zowel ex vivo en in vivo voor imaging. Daarnaast, volgde pathogenen mRNA en eiwit analyse ex vivo infecties. Specifiek, uitgepakte hemocytes besmet waren met IIV6 en werden toegepast op qRT-PCR analyse. Bleek aanzienlijk hogere niveaus van IIV6-193R, een virale gen dat voor een vermeende inhibitor van apoptosis29, tussen mock - en IIV6-geïnfecteerde cellen (Figuur 8A codeert). Elektroforese van de versterkte producten bevestigd de aanwezigheid van een band voor het product IIV6-193R gen in het besmette monster, maar niet de mock-geïnfecteerde monster (Figuur 8B). Versterkte banden voor de endogene controle van RpII werden gevonden in alle monsters, en IIV6 infectie in S2 cellen werden uitgevoerd als positieve controle. Aangezien IIV6 infecties werden uitgevoerd bij een MOI van 1 TCID50distributiedatum, werden ongeveer 50% van de cellen geacht worden besmet, op basis van de Poisson-verdeling-24.
Totaal eiwit van mock - of Listeria -besmet hemocytes werd verzameld op 1, 2 en 4 uur na infectie en eiwitconcentratie werd bepaald door Bicinchoninic zuur (BCA) assay. 100% van de cellen werden verwacht dat besmette ex vivo aangezien de MOI 10 CFU/cel24 was. Westelijke bevlekken bevestigt de aanwezigheid van Listeria-afgeleid van eiwitproducten in de besmette hemocytes, met een hoog niveau bereikt door 4 uur na infectie (Figuur 9). Listeria entmateriaal wordt gebruikt als een positieve controle voor de opsporing van Listeria-specifieke banden. De aanwezigheid van actine wordt weergegeven in de hemocyte monsters te bevestigen niveaus van proteïne laden. Samen genomen, deze resultaten wijzen erop dat de hemocytes geëxtraheerd met behulp van de methode die hier gepresenteerd geschikt voor beide experimenten virale en bacteriële infectie zijn.
Figuur 1 : Overzicht van apparatuur en materialen die worden gebruikt voor de winning van hemocyte. Apparatuur was voor het eerst bereid vóór dissectie. A) de getrokken glazen capillaire was de nanoinjector ingevoegd na terug gevuld met minerale olie. B) het gesmolten puntje van het glas capillaire werd gebroken met een tang aan het maken van een 100 µm-buitendiameter. B') DHIM werd overgenomen door het capillair cel verontreiniging te vermijden en luchtbellen ingevoerd om een duidelijk onderscheid maken tussen olie- en DHIM. C) larven zijn gepickt uit voedsel flesjes en in een zeef cel geplaatst. C') larven zijn gewassen in steriel water en water wordt verwijderd met het wissen van een taak, D) larven zijn overgebracht in een microcentrifuge buis en verdoofd met2 CO-gas. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Tijdlijn en vloed grafiek voor de winning van hemocytes. A) larven worden op hun dorsale zijde vóór het openen van de epidermis geplaatst. B) de schubbenlaag wordt verstoord met fijne puntige pincet en de capillaire naald. C) de Hemolymfe is bloedde op paraffine film. D) zwembaden van Hemolymfe van 20-50 larven worden overgenomen met de glazen capillaire en nanoinjector. E) de Hemolymfe en hemocytes worden overgebracht naar een microcentrifuge buis met 500 µL DHIM met een hemocytometer worden geteld. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: In vivo infectie. A) Drosophila fruit sap agar platen en gist plakken worden gebruikt voor de incubatie van in vivo geïnfecteerde larven. Besnoeid in de agarplaat om larven levensduur (grijze pijlen). B) een 0,001 mm puntige wolfraam naald is aan pincet gebruik van paraffine film gekoppeld. C) de tip van 0,001 mm puntige wolfraam naald. D) de larve is geprikt met wolfraam naald in de pool van het pathogene agens op de paraffine-film onder de stereomicroscoop. E) de opstaande larven worden geplaatst op de agarplaat. F) de plaat is verzegeld met paraffine film en op vochtige papieren handdoeken in de container gehouden tot het juiste moment. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Dwarsdoorsneden van pathogen invasie in de hemocytes. Secties onttrokken 3D confocale scanning van pathogen-geïnfecteerde hemocytes. A, B) de xy-delen toont C. burnetii (in het rood gemarkeerd met witte pijlpunten) in het interieur van de hemocyte. De grijze pijlpunten Toon de kernen van hemocytes. A', A ', B') uitzicht met inbegrip van yz - en xz-sectie beelden tonen de invasie van C. burnetii in de hemocytes van 2 extra uitkijkplaatsen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : 3D-modellen van pathogen invasie in de hemocytes. Gereconstrueerde 3D-modellen van de C. burnetii invasie in de hemocytes worden gegenereerd na ex vivo en in vivo infectie. Model kan vrij worden gedraaid met behulp van de software; Hier staan 6 punten bekijken met de hemocyte in het groen, C. burnetii in het rood (witte pijlpunten), en de kern in het blauw (grijs pijlpunten). De beelden van de dwarsdoorsnede toont het interieur van de pathogeen-binnengevallen cellen zijn vertoond. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6 : Het percentage en de bevolking van levende hemocytes. Hemocytes werden gehaald uit groepen van 10-3rd instar-larven met behulp van de methode van het Petraki et al. en de methode die hier gepresenteerd. A) het percentage van de levende hemocytes werd berekend voor elke techniek door Trypan blauwe uitsluiting assay. B) de totale bevolking van hemocytes werd vergeleken tussen de twee technieken. De staafdiagrammen vertegenwoordigen de gemiddelde ± standaardafwijking van N = 10 biologische replicatieonderzoeken per methode van extractie en kwantitatieve analyse type. P-waarden worden aangegeven van een tweezijdige Student T-test uitgaande ongelijke variantie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7 : Beelden van uitgepakte hemocytes met het stuurprogramma hemolectin. Hemocytes werden gehaald uit 80 larven van w1118; P {w [+ mC] = Hml-GAL4.Δ} 2, P {w [+ mC] = UAS-2xEGFP} AH2. De promotor voor Hml rijdt GAL4 in hemocytes, circuleren die bindt UAS EGFP transcriptie en expressie te activeren. De hemocytes werden vastgesteld en bevlekt met DAPI als eerder beschreven20. Hemocytes zijn gemonteerd op chambered coverslips en beeld door differentiële interferentie contract (DIC) en fluorescentie microscopie. Het blauwe kanaal toont de kern gekleurd met DAPI en het groene kanaal toont de hemocytes uiten van EGFP. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 8 : qRT-PCR en gel elektroforese. De expressie van het IIV6-193R-gen werd waargenomen door qRT-PCR alleen in de hemocytes IIV6-besmet. A) 193R genexpressie was genormaliseerd naar de interne controle, RpII, en presenteerde als een verhouding. Het nummer van de cyclus van de hemocytes mock-besmet werd willekeurig ingesteld op een maximale cyclus aantal 40 p.a. Aangezien 193R niet in deze monsters aangetroffen is. Gegevens vertegenwoordigen de gemiddelde ± standaardafwijking van N = 3 biologische duplo's per groep. De P-waarde geeft een tweezijdige Student T-test uitgaande van ongelijke variantie. B) de qRT-PCR producten worden weergegeven door agarose gelelektroforese. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 9 : Westelijke vlekkenanalyse. De uitdrukking van Listeria antigenen en actine in mock- en Listeria-besmette hemocytes van 3rd instar Drosophila larven op 1, 2 en 4 uur na infectie (p.i.) worden bepaald door het westelijke bevlekken. Totaal eiwit concentraties werden vastgesteld door de Bicinchoninic zuur (BCA) bepaling te normaliseren van de totale hoeveelheid eiwit in elke rijstrook van de gel geladen. Entmateriaal gebruikt voor het infecteren van de hemocytes werd gebruikt als een voorbeeld van de positieve controle. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Methode | Gemiddeld aantal larven voor hemocyte extractie |
Gemiddeld aantal totale hemocytes |
| Hemolymfe capillaire extractie (deze methode) |
192.44 (SD: 86.05) | 4.56 x 105 cellen (SD: 5.83 x 105) |
| (Bereik: 70-390, N = 25 proeven) | (Bereik: 1.20 x 105 - 2.95 x 106 cellen) | |
| Individuele larven dissectie |
26.67 (SD: 11.55) | 8.33 x 103 cellen (SD: 6,66 x 103) |
| (Bereik: 20-40, N = 10 proeven) | (Bereik: 4,00 x 103 - 1,60 x 104 cellen) | |
| larvale capillaire winning * |
N/B * | N/B * |
| * hemocytes konden worden geëxtraheerd met behulp van deze methode toe te schrijven aan de verstopping van de capillaire naald | ||
Tabel 1: aantal larven ontleed en geëxtraheerd met behulp van verschillende technieken hemocytes. Het gemiddelde aantal ontleed larven en uitgepakte hemocytes werden vergeleken tussen de methode die hier gepresenteerd en andere methoden. Onze methode resulteerde in verzameling van hogere aantallen larven en hemocytes. De larvale capillaire extractiemethode werd ook geprobeerd, maar de hemocytes konden worden geëxtraheerd door verstopping van de capillaire tip.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Om beter te begrijpen hoe de cellen van de gastheer besmet raken, is het belangrijk om het verduidelijken van de lokalisatie voor pathogen in de cellen, met name wanneer experimenteren op het eerder geteste pathogenen en cel type combinaties4. Terwijl het bestuderen van de cascade van de cellulaire reactie na infectie kunt productief pathogen invasie aangeven, is de combinatie van beeldvorming en cellulaire respons data essentieel om aan te tonen van de ziekteverwekker invasie en infectie. Terwijl de rapporten met 2D afbeeldingen van pathogen invasie in de cellen van de gastheer heeft de neiging om aan te geven van de productieve infectie, kunnen enkele vragen blijven met betrekking tot de timing van de initiële pathogen invasie in cellen van de gastheer. Dus, 3D-modellen gereconstrueerd op basis van z-sectie scannen van 2D-afbeeldingen kunnen deze vragen en geven pathogen locatie in de cellen van de gastheer (figuren 4 en 5). Een beperking van het gebruik van primaire hemocytes is echter hun levensduur in celkweek. Een vorig rapport stelt dat de hemocyte overleven in cel voedingsbodems slechts 8 h18 is, en in ons infectie protocol, we konden aan het uitvoeren van tests up tot 24 h, maar niet langer. Daardoor was het niet mogelijk te observeren van hoge niveaus van C. burnetii replicatie of de vorming van de parasitophorous-vacuole die niet begint te vormen tot 2 dagen na infectie en niet observably grote tot 4-6 dagen na infectie30 .
Voor veel experimenten waar het eindpunt assays eiwit of RNA voor analyse gebruiken, zijn grote aantallen cellen meestal moeten produceren voldoende materiaal voor ondervraging. Bijvoorbeeld, gebruiken we hier, eindpunt analyses zoals westelijke bevlekken en qRT-PCR sonde welke mate pathogen besmetting in primaire hemocytes afgeleid van 3rd instar Drosophila larven. Dus de methode hier gepresenteerd is gericht op snelle larvale dissectie en de collectie van de Hemolymfe met voldoende live hemocytes voor ex vivo pathogen infectie. Deze methode introduceert het gebruik van een nanoinjector om de Hemolymfe en hemocytes snel. Plaatsen van de hemocytes in DHIM met 25% is FBS belangrijk voor hemocyte overleving. Bovendien, voor de ex vivo infecties die hier gepresenteerd, zijn een groot aantal hemocytes nodig. Om te voorkomen dat melanization31,32,33, moeten dissectie en hemocyte collectie snel gebeuren. Terwijl andere methoden voor hemocyte extractie18,19,23 bestaat, wordt de duur van deze methoden voor het verzamelen van een voldoende groot aantal hemocytes voor ex vivo infectie te lang was. De fijne punt van 100 µm is gunstig voor de opname van Hemolymfe zonder toegang tot andere organen die leiden kunnen tot verstopping van de capillaire naald. Het gebruik van een nanoinjector kan ook worden geautomatiseerd wanneer deze is aangesloten op een micromanipulator stadium en voetpedaal, zodat de gebruiker te richten op snelle dissectie van de Drosophila larven en het verminderen van de tijd dat de hemocytes zonder het omringende larvale cultuur-media, weefsels of cellen. Het gebruik van een pipet is echter ook brengt omhoog de Hemolymfe voor overdracht naar DHIM. Bovendien, onze methode maakt gebruik van CO2 gas om te anesthetize larven vóór dissectie; het gebruik van een koud blok paraffine film bekleding is een andere haalbare methode23. Tot slot, dissectie van de larven in een daling van DHIM tijdens de release van de Hemolymfe kan verminderen het aantal hemocytes die verloren gaan vastplakken aan de paraffine-film maar verhoogt de tijd die nodig is voor opname door de capillaire naald.
Een gemeenschappelijk immuunrespons bij Drosophila tot schade, die tijdens de openings- en dissectie van de larvale cuticle bestaat optreedt, is melanization31,32,33. Bij de winning van hemocytes zien we melanization van de hemocytes in de DHIM zo vroeg als 10 min na extractie. Als melanization een snel proces is, zou deze cellen van de ziekteverwekker infectie experimenten worden uitgesloten. Bovendien kan de anti-coagulant phenylthiourea worden toegevoegd aan DHIM voor de remming van het systeem activeren van phenoloxidase en melanization tijdens het verwonden van9. Niettemin, zoals melanization en apoptosis aangeboren immuunresponsen van Drosophila zijn, hun niveaus kunnen worden gekwantificeerde volgende hemocyte extractie en stimulatie met behulp van de beschreven methoden hier.
Terwijl herstellende van grote hoeveelheden eiwit of RNA materiaal een vereiste voor technieken zoals westelijke vlek en qRT-PCR is, vereisen nieuwe technieken, zoals RNAseq veel minder uitgangsmateriaal, zo weinig als 10 pg van kwalitatief hoogwaardige totaal RNA van een eencellige34. Experimenten zoals deze verhogen interessante experimentele vragen, en aangezien Drosophila hemocytes een heterogene populatie met crystal cellen, plasmatocytes en lamellocytes7, men beginnen kon te ondervragen de transcriptionele reactie van elke cel typ35. Bijvoorbeeld Kurucz et al., antilichamen die gebruikt kunnen worden om te isoleren van de Drosophila hemocyte subsets kunt weergeven die kunnen worden gebruikt voor hebben ontwikkeld transcriptionele of proteomic profilering na verschillende prikkels. Bovendien, kan de recente ontwikkeling van eencellige RNAseq technologie bepalen transcriptomes van elk celtype zonder het gebruik van antilichamen te scheiden in eerste instantie elke cel type36,37,38, 39. Voorts kan men vragen over genregulatie in de hemocyte subsets kunt weergeven die kan ons helpen te begrijpen hoe menselijke bloedcellen lineages afkomstig is en geëvolueerd van oude organismen door middel van vergelijkende genomica inspanningen. De combinatie van een breed scala van experimentele technieken voor de aanpak van problemen zoals deze vereist, en de hier beschreven techniek nuttig kan zijn voor dergelijke inspanningen bij de isolatie van een groot aantal hemocytes van ongewervelde larven vereist is.
Wij stellen hier, voor dat de combinatie van 3D-modellen met numerieke, biochemische gegevens voor bevestiging van de infectie. In de toekomst onderzoeken, kunnen we gebruiken de hier beschreven immuunresponsen om en te observeren het mechanisme van pathogen invasie in cellen van de gastheer door mede kleuring host eiwitten voor microscopie analyse methoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Wij zijn dankbaar aan Dr Robert Heinzen voor het verstrekken van voorraden van mCherry-uiten Coxiella burnetii. Wij bedanken Dr. Luis Teixeira voor het verstrekken van ongewervelde iriserende virus 6 en de Bloomington voorraad Center voor het verstrekken van vliegen voorraden. Dit project werd gedeeltelijk gefinancierd door NIH grant R00 AI106963 (voor A.G.G.) en Washington State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Schneider's Drosophila Medium | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 21720024 | 1.1.1), 2.1.2) |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences (HyClone) | SH30070.03HI | 1.1.1), 2.1.2) |
| Filter (0.22 µL) | RESTEK | 26158 | 1.1.1) |
| Strainer (100 µm) | Greiner bio-one | 542000 | 1.2.1), 2) |
| Stereo microscope | Amscope | SM-1BSZ-L6W | 1.2), 2) |
| Glass capillary | Fisher Scientific | 21-171-4 | 1.1), 1.2), 2) |
| Capillary puller | Narishige International USA, Inc. | PC-10 | 1.1.3) |
| Mineral oil | Snow River Products | 1.1.4) | |
| Nanoinjector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | 1.1), 1.2), 2.2) |
| Forceps | VWR | 82027-402 | 1.1.5), 1.2), 2), 3.1.7) |
| CO2 delivery apparatus | Genesee Scientific | 59-122BC | 1.2), 2) |
| Trypan Blue | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 15250061 | 1.3) |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | 1.3) |
| 24 well plate | Greiner bio-one | 662160 | 1.4), 2.2) |
| Coxiella burnetii - mCherry | Dr. Heinzen, R. | 1.4), 2.2) | |
| Drosophila fruit juice plates | Cold Spring Harbor Protocols | 2.1) http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full | |
| Agar | Fisher Bioreagents | BP1423-500 | 2.1.1.1) |
| Methyl paraben | Amresco | 0572-500G | 2.1.1.2) |
| Absolute ethanol | Fisher Bioreagents | BP2818-500 | 2.1.1.2) |
| Welch's 100% Grape juice frozen concentrate, 340 mL | Amazon | B0025UJVGM | 2.1.1.3) |
| Petri dishes, 10 x 35 mm | Fisher Scientific | 08-757-100A | 2.1.1.4) |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-545-80 | 1.4.4), 2.2.2) |
| Yeast, Bakers Dried Active | MP Biomedicals | 0210140001 | 2.1) Add 2 parts of water to 1 part of yeast (v/v) |
| Tungsten needle | Fine Science Tools | 10130-20 | 2.1) |
| Holding forceps | VWR | HS8313 | 2.1) |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | FLO4042-500 | 3.1.3) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | 3.1.3) |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP9706-100 | 3.1.3) |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | Thermo Fisher Scientific | 62247 | 3.1.4) |
| Antifade mounting medium | Thermo Fisher Scientific | P36930 | 3.1.6) |
| Confocal microsope | Leica | TCS SP8-X White Light Confocal Laser Scanning Microscope | 3.2) |
| 3D imaging reconstruction software | Leica | LASX with 3D visualization module | 3.3) |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-552-3 | 3.1.6) |
| Invertebrate iridescent virus 6 (IIV6) | Dr. Teixeria, L. | 4) PLoS Biol, 6 (12), 2753-2763, doi: 10.1371/journal.pbio.1000002, (2008) | |
| Listeria monocytogenes | ATCC | strain: 10403S | 4) Listeria monocytogenes strain 10403S (Bishop and Hinrichs, 1987) was grown in Difco Brain-heart infusion (BHI) broth (BD Biosciences) containing 50 µg/ml streptomycin at 30 °C. |
| DNase I | Thermo Fisher Scientific(Invitrogen) | 18068015 | gDNA degradation |
| cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | cDNA synthesis |
| IIV6_193R_F | IDT | qRT-PCR, 5'- TCT TGT TTT CAG AAC CCC ATT -3' | |
| IIV6_193R_R | IDT | qRT-PCR, 5'- CAC GAA GAA TGA CCA CAA GG -3' | |
| RpII_qRTPCR_fwd | SIGMA-ALDRICH | qRT-PCR, 5'- GAA GCG TTT CTC CAA ACG -AG | |
| RpII_qRTPCR_rev | SIGMA-ALDRICH | qRT-PCR, 5'- TTG AGC GTA AGC ATC ACC -TG | |
| SYBR Green qRT-PCR reagent | Thermo Fisher Scientific | K0251, K0252, K0253 | qRT-PCR |
| Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4351107, 7500 Software v2.0 | qRT-PCR |
| Anti-Listeria monocytogenes antibody | abcam | ab35132 | Western blot |
| Anti-Actin antibody produced in rabbit | SIGMA-ALDRICH | A2066 | Western blot |
| Anti-Rabbit IgG (H+L), HRP Conjugate | Promega | W4011 | Western blot |
References
- Hoffmann, J. A. The immune response of Drosophila. Nature. 426 (6962), 33-38 (2003).
- Regan, J. C., et al. Steroid hormone signaling is essential to regulate innate immune cells and fight bacterial infection in Drosophila. PLoS Pathog. 9 (10), 1003720 (2013).
- Yano, T., et al. Autophagic control of listeria through intracellular innate immune recognition in Drosophila. Nat Immunol. 9 (8), 908-916 (2008).
- Bastos, R. G., Howard, Z. P., Hiroyasu, A., Goodman, A. G. Host and Bacterial Factors Control Susceptibility of Drosophila melanogaster to Coxiella burnetii Infection. Infect Immun. 85 (7), (2017).
- Kacsoh, B. Z., Schlenke, T. A. High hemocyte load is associated with increased resistance against parasitoids in Drosophila suzukii, a relative of D. melanogaster. PLoS One. 7 (4), 34721 (2012).
- Tsuzuki, S., et al. Switching between humoral and cellular immune responses in Drosophila. is guided by the cytokine GBP. Nat Commun. 5, 4628 (2014).
- Kurucz, E., et al. Definition of Drosophila. hemocyte subsets by cell-type specific antigens. Acta Biol Hung. 58, Suppl 95-111 (2007).
- Neyen, C., Bretscher, A. J., Binggeli, O., Lemaitre, B. Methods to study Drosophila immunity. Methods. 68 (1), 116-128 (2014).
- Arefin, B., et al. Apoptosis in Hemocytes Induces a Shift in Effector Mechanisms in the Drosophila. Immune System and Leads to a Pro-Inflammatory State. PLoS One. 10 (8), 0136593 (2015).
- Rus, F., et al. Expression pattern of Filamin-240 in Drosophila blood cells. Gene Expr Patterns. 6 (8), 928-934 (2006).
- Kurucz, E., et al. Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila. P Natl Acad Sci USA. 100 (5), 2622-2627 (2003).
- Markus, R., et al. Sessile hemocytes as a hematopoietic compartment in Drosophila melanogaster. P Natl Acad Sci USA. 106 (12), 4805-4809 (2009).
- Bretscher, A. J., et al. The Nimrod transmembrane receptor Eater is required for hemocyte attachment to the sessile compartment in Drosophila melanogaster. Biol Open. 4 (3), 355-363 (2015).
- Zettervall, C. J., et al. A directed screen for genes involved in Drosophila blood cell activation. P Natl Acad Sci USA. 101 (39), 14192-14197 (2004).
- Flynt, A., Liu, N., Martin, R., Lai, E. C. Dicing of viral replication intermediates during silencing of latent Drosophila viruses. P Natl Acad Sci USA. 106 (13), 5270-5275 (2009).
- Jovel, J., Schneemann, A. Molecular characterization of Drosophila cells persistently infected with Flock House virus. Virology. 419 (1), 43-53 (2011).
- Stoepler, T. M., Castillo, J. C., Lill, J. T., Eleftherianos, I. A simple protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars. J Vis Exp. (69), e4173 (2012).
- Sampson, C. J., Williams, M. J. Protocol for ex vivo incubation of Drosophila primary post-embryonic haemocytes for real-time analyses. Methods Mol Biol. 827, 359-367 (2012).
- Nehme, N. T., et al. A model of bacterial intestinal infections in Drosophila melanogaster. PLoS Pathog. 3 (11), 173 (2007).
- Drosophila fruit juice egg plates. Cold Spring Harbor Protocols. (9), pdb.rec11113 (2007).
- Ahlers, L. R., Bastos, R. G., Hiroyasu, A., Goodman, A. G. Invertebrate Iridescent Virus 6, a DNA Virus, Stimulates a Mammalian Innate Immune Response through RIG-I-Like Receptors. PLoS One. 11 (11), 0166088 (2016).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
- Petraki, S., Alexander, B., Bruckner, K. Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva. J Vis Exp. (105), (2015).
- Figliozzi, R. W., Chen, F., Chi, A., Hsia, S. C. Using the inverse Poisson distribution to calculate multiplicity of infection and viral replication by a high-throughput fluorescent imaging system. Virol Sin. 31 (2), 180-183 (2016).
- Rizki, T. M., Rizki, R. M. Lamellocyte differentiation in Drosophila. larvae parasitized by Leptopilina. Dev Comp Immunol. 16 (2-3), 103-110 (1992).
- Markus, R., Kurucz, E., Rus, F., Ando, I. Sterile wounding is a minimal and sufficient trigger for a cellular immune response in Drosophila melanogaster. Immunol Lett. 101 (1), 108-111 (2005).
- McCormack, R., et al. Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen. Infect Immun. 84 (4), 1083-1091 (2016).
- Ozgen, A., et al. Construction and characterization of a recombinant invertebrate iridovirus. Virus Res. 189, 286-292 (2014).
- Jakob, N. J., Muller, K., Bahr, U., Darai, G. Analysis of the first complete DNA sequence of an invertebrate iridovirus: coding strategy of the genome of Chilo iridescent virus. Virology. 286 (1), 182-196 (2001).
- Ghigo, E., Colombo, M. I., Heinzen, R. A. The Coxiella burnetii parasitophorous vacuole. Adv Exp Med Biol. 984, 141-169 (2012).
- Liu, F., et al. Drosophila melanogaster prophenoloxidases respond inconsistently to Cu2+ and have different activity in vitro. Dev Comp Immunol. 36 (3), 619-628 (2012).
- De Gregorio, E., et al. An immune-responsive Serpin regulates the melanization cascade in Drosophila. Dev Cell. 3 (4), 581-592 (2002).
- Kari, B., et al. The raspberry Gene Is Involved in the Regulation of the Cellular Immune Response in Drosophila melanogaster. PLoS One. 11 (3), 0150910 (2016).
- Wu, A. R., et al. Quantitative assessment of single-cell RNA-sequencing methods. Nat Methods. 11 (1), 41-46 (2014).
- Buettner, F., et al. Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single-cell RNA-sequencing data reveals hidden subpopulations of cells. Nat Biotechnol. 33 (2), 155-160 (2015).
- Nevil, M., Bondra, E. R., Schulz, K. N., Kaplan, T., Harrison, M. M. Stable Binding of the Conserved Transcription Factor Grainy Head to its Target Genes Throughout Drosophila melanogaster Development. Genetics. 205 (2), 605-620 (2017).
- Yang, C. P., et al. Transcriptomes of lineage-specific Drosophila neuroblasts profiled by genetic targeting and robotic sorting. Development. 143 (3), 411-421 (2016).
- Jaitin, D. A., et al. Dissecting Immune Circuits by Linking CRISPR-Pooled Screens with Single-Cell RNA-Seq. Cell. 167 (7), 1883-1896 (2016).
- Karaiskos, N., et al. The Drosophila embryo at single-cell transcriptome resolution. Science. 358 (6360), 194-199 (2017).
