Um método para a medição da função da glândula salivar em ratos

Resumo

Hipofunção das glândulas salivares é uma consequência frequente da terapia de radiação e doença auto-imune. Reprodutível avaliação da função da glândula salivar em modelos do rato destas doenças é um desafio técnico. Aqui, um método simples para a medição exata e reproduzível da produção de saliva em camundongos é descrito.

Resumo

Pacientes com síndrome de Sjögren, uma doença auto-imune que afectam as glândulas exócrinas, desenvolvem a inflamação das glândulas salivares e reduziram a produção de saliva. Da mesma forma, a produção de saliva é severamente comprometida em pacientes recebendo tratamento com radiação para câncer de cabeça e pescoço. Modelos de roedores, desenvolvidos para imitar essas condições clínicas, facilitam uma compreensão da patogênese da doença e permitam o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. Portanto, a capacidade de precisão reproducibly e repetidamente medir a função da glândula salivar em modelos animais é crítica. Base em procedimentos previamente descritos na literatura, um método foi desenvolvido que atende a esses critérios e foi utilizado para avaliar a função da glândula salivar em camundongos. Uma vantagem adicional deste novo método é que ele é facilmente dominado e tem pouca variação inter operador. Função da glândula salivar é avaliada como a quantidade (volume ou peso) ou taxa (mL/min) de saliva produzida em resposta à estimulação de pilocarpina. A saliva coletada é uma boa fonte para as análises do teor de proteínas, as concentrações de imunoglobulinas e outras biomoléculas.

Introdução

As glândulas salivares produzem saliva em resposta a uma variedade de estímulos neurológicos e mecânica¹. Os estímulos são transportados através do sistema nervoso simpático e parassimpático aos receptores adrenérgicos e colinérgicos na glândula. Pilocarpina é um agente colinérgico, Pará-simpaticomimética que atua predominantemente sobre os receptores muscarínicos. Na glândula salivar, que induz a produção de saliva, agindo sobre os receptores de acetilcolina muscarínicos M3¹. Produção de saliva, após a administração de pilocarpina é um indicador da capacidade de responder à estimulação das glândulas salivares e é comume....

Protocolo

O protocolo descrito abaixo foi aprovado pelo Comitê de uso e cuidado institucional do Animal e segue as diretrizes éticas estabelecidas pelos institutos nacionais de saúde. Todos os dados apresentados neste relatório foram gerados usando ratos fêmeas que eram 10-12 semanas de idade. Foram utilizadas as seguintes cepas de ratos: C57BL/6, BALB/c, DBA1, 129S e F1 (B6XA/J). Todos os ratos foram alojados em gaiolas de barreira (5 animais por gaiola) em condições específicas isentos de organismos patogénicos e fornecidos a ração e água ad libitum.

1. preparação

1. Para preparar uma solução de cloridrato de pilocarpina, pesa 10 mg do compo....

Resultados

Nos sistemas de modelo experimental do mouse, a capacidade de produzir saliva em resposta à estimulação de pilocarpina é usada como um indicador da função das glândulas salivares. Produção de saliva era medida em ratos fêmeas de C57BL/6 de 11 semanas de idade pelo método cotonete. Na figura 1A, os resultados são expressos como a quantidade de saliva (mg) coletado após doses crescentes de pilocarpina. Com a dose de 1 mg/kg de peso corporal, alguns dos ratos co.......

Discussão

Produção de saliva é um processo complexo e é influenciada por muitos fatores. Portanto, medir a função da glândula salivar em animais de laboratório pode ser um desafio. Um desafio adicional é que medidas repetidas da função das glândulas salivares no mesmo animal são necessárias para estabelecer o início da doença ou para demonstrar a recuperação após o tratamento.

O método da zaragatoa descrito neste relatório é tecnicamente simples para realizar com várias opções para representar os dados........

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Produtos químicos para coleta de saliva
pilocarpina	Alfa Aesar, Tewksbury, MA, EUA	B21410	Diluir em solução salina isotônica estéril. Armazene alíquotas de uso único de estoque 100X em -80oC
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução de mistura de anestesia			Misture 1 mL de cloridrato de cetamina + 0,5 mL de xilazina + 8,5 mL de solução salina isotônica estéril em um frasco estéril. Pode ser usado por 3 meses.
Vetamina (cloridrato de cetamina)	Vet One, Boise, Idaho, EUA	C3N VT1	O estoque é de 100 mg / mL
Anased (xilazina)	Med-Vet International, Mettawa, IL, EUA	RXANASED-20	O estoque é de 20 mg / mL
Solução salina estéril isotônica	Vet One, Boise, Idaho, EUA	501032	Usado como diluente
Lágrimas artificiais (pomada oftálmica lubrificante)	Henry Schien, Dublin, OH, EUA	48272	Usado para evitar que os olhos sequem durante o procedimento
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Materiais para coleta de saliva
SalivaBio Cotonete infantil	Salimetrics, LLC Carlsbad, CA, EUA	N/A	Cotonetes embalados individualmente
Tubos de polipropileno de 50 mL	VWR, Radnor, PA, USA	89004-364	Corte a parte inferior de 1 cm do tubo. Certifique-se de que a borda cortada esteja lisa.
Tubos de microcentrífuga de 0,6 mL	VWR, Radnor, PA, USA	87003-290	Faça furos no fundo do tubo com agulhas aquecidas de calibre 18
Tubos de microcentrífuga de 2 mL	VWR, Radnor, PA, USA	87003-298
Seringas de insulina com agulhas permanentemente fixadas	Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA	324702
agulhas chanfradas regulares de calibre 18	Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, EUA	305195
Lâmina de bisturi estéril #11	Integra York Inc PA, EUA	4-311
Pinça de microdissecação	Roboz, Gaithersburg, MD, USA	RS-5139	Ponta angular serrilhada de 0,8 mm, comprimento de 4"
Fita adesiva	Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EUA	sc-224487
Temporizador de 3 canais	Amazon.com, Seattle, WA, EUA	B06W2KCYVN
Balança Analítica	Mettler Toledo, Columbus OH, EUA
strong>Nome	Empresa	Número de Catálogo<	strong>Comentários
Chemicals/ reagentes para induzir disfunção salivar
LPS	Invivogen, San Deigo, CA, EUA	tlrl-b5lps	Dissolva em água livre de endotoxinas e armazene a solução de estoque a 5 mg / mL. diluir em HBSS estéril 100 ug / mL - injetar 100 uL / moue ip
Imject Alum adjuvante	Thermo Scientific	77161	Diluir 1: 1 em solução salina estéril. Injetar intraperitonealmente 0,1 mL / camundongo
Coelho anti-soro anti-Ro52	Gerado em laboratório		Imunização de coelhos com camundongo recombinante Ro52
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Chemicals/ Kits para análises de saliva
Estimativa de lisozima salivar
EnzChek Kit de Ensaio de Lisozima	Sondas Moleculares, Eugene, OR, EUA	E-22013	Usado conforme as instruções do fabricante
Nome	Empresa	Número de Catálogo	Comentários
Estimativa de IgA salivar por sanduíche ELISA
Camundongo IgA	Southern Biotech, Birmingham, AL, EUA	0106-01	Padrões para sanduíche ELISA - faixa de 30 ng/mL a 0,5 ng/mL
IgA anti-camundongo de cabra não rotulada	Southern Biotech, Birmingham, AL, EUA	1040-01	Revestimento a 1 ug/mL em tampão de bicarbonato
Cabra anti-camundongo IgA HRP	Southern Biotech, Birmingham, AL, EUA	1040-05	Anticorpo de detecção usado em substrato TMB de diluição 1:4000
	Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, EUA	555214	Usado de acordo com as instruções do fabricante
Immulon 4HBX Microtiter 96 placas de poços	Thermo Scientific, Rochester, NY, EUA	3855
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Estimativa de proteína salivar
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate	BioRad, Hercules, CA, USA		5000006 Para estimativa de proteína de acordo com as instruções do fabricante

cloridrato de <