Summary
Этот протокол описывает метод для photoconversion Каэдэ флуоресцентный белок в эндокарда клетки живых zebrafish эмбриона, который позволяет отслеживать эндокарда клеток во время предсердно-канал и предсердно сердца клапан развития .
Abstract
Во время эмбриогенеза клетки претерпевают динамические изменения в поведение клеток, и расшифровка сотовой логику этих изменений является основополагающей целью в области биологии развития. Открытие и разработка photoconvertible белков значительно помог наше понимание этих динамических изменений, предоставляя метод оптически highlight клеток и тканей. Однако хотя photoconversion, покадровой микроскопия и анализ изображений последующих оказались весьма успешными в раскрытии сотовой динамике в органы как мозг или глаз, этот подход обычно не используется в развивающихся сердце проблемы, связанные с быстрым движением сердца во время сердечного цикла. Этот протокол состоит из двух частей. Первая часть описывает метод для photoconverting и впоследствии отслеживания эндокарда клетки (ЭЭС) во время данио рерио предсердно-канал (AVC) и предсердно сердца клапан развития. Метод предполагает височно остановки сердца с наркотиками в целях точного photoconversion занять место. Сердца разрешается возобновить избиение после удаления препарата и эмбрионального развития обычно продолжается до тех пор, пока сердце снова остановился за разрешением изображений photoconverted ЭЭС в точке позднее развития время. Второй частью протокола описывает метод анализа изображений для количественного определения длины photoconverted или не photoconverted региона в АВК в молодых эмбрионов путем сопоставления флуоресцентного сигнала от трехмерной структуры на двумерной карте . Вместе эти две части протокола позволяет изучить происхождение и поведение клеток, которые составляют данио рерио AVC и предсердно сердечного клапана и потенциально могут быть применены для изучения мутантов, morphants или эмбрионов, которые были обработаны с Реагенты, которые нарушают AVC и/или клапан развития.
Introduction
Данио рерио в настоящее время является одним из самых важных позвоночных моделей для изучения клеточных и развития процессов в естественных условиях. Это во многом объясняется данио рерио оптической прозрачности и ограниченой к генетике, что делает его мощным модель для применения оптических методов, связанных с генетически закодированный photoresponsive белка технологий1. Специфичные для изучения развития сердца, данио рерио получать достаточно кислорода через распространение таким образом, что даже мутантов без сердцебиение может выжить через первую неделю развития, позволяя анализы последствий развития генов и возмущенных поток крови на сердце морфогенеза невозможно в большинстве позвоночных животных2.
Данио рерио трубка сердца формируется 24 часа пост оплодотворение (hpf). Вскоре после его формирования трубка сердце начинает активно биться. От 36 hpf, ясно сужение отделяет атриум из желудочка. Этот регион сужение называют предсердно канал (AVC) и ячейки в этой области изменения от плоскоклеточный морфология шестигранника морфология3. Данио рерио предсердно клапан морфогенеза начинается около 48 h пост оплодотворения. 5 дней пост оплодотворение, две листовки клапан расширения в АВК и предотвращения обратного потока крови из желудочков в зимнем саду во время сердечного цикла4. Отслеживание клетки во время формирования AVC и клапан является сложной задачей, как быстрое биение сердца делает его трудно следовать клетки через традиционными покадровой микроскопии5,6. Этот протокол, адаптированный Стид et al., 20167, описывает метод, использующий Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede)8 данио рерио трансгенные линии, в котором белка photoconvertible Каэдэ выражается в эндотелиальные клетки, включая эндокарда. Наркотиков 2,3-butanedione-2-monoxime (BDM) используется для временной остановки сердца биться, позволяя точной photoconversion ЭЭС между 36 и 55 hpf и с высоким разрешением изображений photoconverted ЭЭС в определенное время развития точках. Ранее было показано, что photoconverted ЭЭС с помощью этого метода может оставаться отличимые от их нереализованный соседей или более пяти дней после времени photoconversion7. Этот протокол также подробно метод, используемый для анализа изображений photoconverted ЭЭС в эмбрионов, моложе, чем 48 hpf, которая успешно использовалась следовать ткани движений во время развития AVC (Боселли et al., в печати)9. Мы надеемся на то, что читатели найдут этот протокол полезным для изучения AVC и клапан развития в нормальных эмбрионов, а в мутантов, morphants или наркотики лечение эмбрионов. Для более общего протокола, касающегося отслеживания ячейки с помощью photoconvertible белков во время разработки данио рерио пожалуйста, просмотрите статью, Ломбардо et al., 201210.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка пресс-формы и монтаж агарозы
- Создайте форму с размерами, показано на рисунке 1 с помощью 3D-принтер или традиционные механические инструменты.
- Пипетка около 1,5 мл растопленного агарозы 1% в 35-мм пластиковые крепления блюдо. Место прессформа в жидком агарозы, заботясь, чтобы избежать захвата воздуха между плесень и агарозы. Поместите блюдо на 4 ° C, дождитесь агарозы твердеет (это занимает около 5 минут), а затем удалить пластиковые плесень.
- Чтобы сохранить монтаж блюдо для последующего использования, Обложка блюдо с крышкой, а затем обернуть блюдо и крышку плотно с парафина. Монтаж блюдо может затем храниться крышкой лицевой стороной вниз на срок до 5 дней при 4 ° C.
- Заранее подготовьте 1 мл аликвоты 0,7% низкой температурой плавления агарозы в 1,5 мл Eppendorf трубы для использования в день монтажа.
Примечание: Агарозы скважин монтаж блюдо будет деформироваться течением времени как вода испаряется, если парафина плотно не обернута вокруг блюда.
2. получение эмбрионов для Photoconversion
- Incross тг (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede) линии и расти примерно 200 эмбрионов в среде эмбриона в темноте на 28,5 ° C. Для более подробной информации о том, как крест линии данио рерио пожалуйста, обратитесь к JoVE науки образования базы данных11.
- После 5 h, но до 24 ч, лечить эмбрионы с 1-фенил-2-тиомочевины (ПТУ), чтобы предотвратить образование пигмента (0,003% ПТУ в среде эмбриона).
- Около 1 час до начала photoconversion, экрана эмбрионов под люминесцентные Стереоскоп и выберите 5 здоровых эмбрионов, которые появляются выразить яркий зеленый флуоресценции. Чтобы избежать воздействия эмбрионов окружающего света во избежание photoconverting Kaede в клетках неспецифической рекомендуется использовать низк интенсивности света при визуализации эмбрионов.
3. внедрение
- Подготовка 10 мл монтажа СМИ: 0.02% tricaine и 50 мм BDM в среде эмбриона.
- Добавить 2 мл среды монтажа Монтаж блюдо и позволяют 15-30 мин для решения диффундируют в агарозы.
- В то же время Расплавьте 1 мл Алиготе агарозы низкую температуру плавления (LMP) 0,7%, поставив трубку в блоке 70 ° C тепла для около 5 мин.
- Ждать LMP агарозы немного остыть, а затем добавить 25 мкл 8 мг/мл tricaine раствора и 40 мкл раствора 1 М BDM трубки агарозы низкой температурой плавления. Микс, закупорить вверх и вниз, затем передать трубку до 38 ° C тепла блок держать LMP агарозы в жидком состоянии.
- В Петри блюдо с эмбриона среде, тщательно dechorionate предварительный отбор эмбрионов под стереомикроскопом, с помощью щипцов, стараясь не повредить эмбрионов.
- Трансфер эмбрионов в отдельное блюдо, содержащий 2 мл монтажа СМИ.
- При останове сердца эмбрионов (занимает около 5-10 мин), переноса эмбрионов для монтажа блюдо и организовать эмбрионов в лунки с помощью щипцов, чтобы они лежат на 25 градусов, хвосты, указывая в направлении более глубокие части колодца, желток, вверх.
- Когда примерно на месте, удалите средства массовой информации, внедрить эмбрионы в ~ 200 мкл 0,7% агарозном LMP, содержащие tricaine и BDM эмбрионы и скорректировать позиции эмбрионов, наклоняя эмбрионов слева или справа при необходимости.
- Подождите, пока LMP агарозы наборы (занимает около 5 минут), затем добавить средне монтажа на блюдо. Эмбрионы теперь готовы быть photoconverted.
Примечание: Tricaine и BDM используются анестезировать эмбрионы и остановить сердце эмбриона, соответственно. Монтаж средств массовой информации может быть подготовлен за день до изображений, но убедитесь, что для защиты от света.
Примечание: Правильное позиционирование эмбрионы важно дать четкие лазерные путь к клетки, которую хочется photoconvert. Расположите голова эмбриона недалеко от начала хорошо так, что свет лазера не придется ехать далеко, чтобы достичь эмбрион, и таким образом, чтобы после photoconversion эмбрионы можно легко демонтируются.
4. Photoconversion
- На вертикальном конфокального микроскопа (как Leica SP8) оснащены 405 нм, 488 нм и 561 Нм лазерного источника, найдите эмбриона в сердце с помощью передаваемых белый свет (brightfield) и объектива (как Leica HCX IRAPO Л, 25 ×, н.а. 0,95 цель). Проверить наличие красной флуоресценции Каэдэ, используя 561 Нм лазер (то есть, DPSS 561 лазер, в ~ 5% интенсивности, детектор на 589-728 Нм). Затем Визуализируйте эндокарда, используя 488 нм лазер (то есть, 30 МВт мультилинии Аргонового лазера на ~ 5% интенсивности, детектор на 502-556 Нм).
- Режим «FRAP» на приобретение программного обеспечения микроскопа. Выбрать мощность лазера ~ 1% для обеих 488 нм и 561 Нм лазеры.
- Сосредоточиться на плоскости интерес, выберите регион интерес (ROI), затем photoconvert клетки, используя диод 405 нм лазерные лазера 25% мощности, просматривающей ROI три раза. Недостаточно Каэдэ следует photoconverted в ROI, сканировать 405 нм лазер над районом три раза снова. Повторите этот шаг для всех ROIs.
- Вернуться в режим «TCS SP8» на программное обеспечение и получить z стека, используя 561 Нм и 488 нм лазеры последовательно. Убедитесь в том выбрать опцию «двунаправленные» для увеличения скорости обработки изображений.
Примечание: Как долго он принимает для photoconvert и изображения каждого эмбриона варьируется. Сердце биться как известно иметь важное значение для развития нормальной сердца клапан, так что избежать, сохраняя сердца, остановились на более чем 30 мин, даже если это означает, что вы не успели photoconvert все 5 эмбрионов.
Примечание: Во время процесса photoconversion, использование ПЛТ детекторы, а после photoconversion, рекомендуется использовать гибридные детекторы, равным «подсчета» режим. Это потому, что гибридные детекторы более чувствительны и способны производить лучшее качество изображения, но легко повреждаются при загорании.
5. Отключение photoconverted эмбрионов
- После photoconversion используйте Пипетки стеклянные для нажимать слегка чуть выше головы эмбриона разорвать LMP агарозы, а затем нежно сосать эмбриона.
- Извлечения эмбриона из стеклянной пипетки в 35-мм Петри, содержащих среды эмбриона с ПТУ (чтобы смыть BDM, содержащие среднего).
- Переноса эмбриона в скважину на 6-ну пластины, содержащих среды эмбриона с ПТУ. Во время этого шага убедитесь, что держать сведению которой эмбрион переходит в которой хорошо, как это важно соотнести положение photoconverted клеток на позднее этапах своего развития.
- Теперь, когда эмбрионы будут удалены из содержащих среднего BDM, их сердца следует бить снова в около 5 мин возвращения эмбрионов в темноте на 28,5 ° C, чтобы позволить эмбрионов продолжать нормально развиваться.
6. imaging photoconverted клеток на позднее эмбриональных стадиях
- На стадии желаемого остановить сердце и повторно вставлять эмбрионов как в шаге 3 этого протокола, с важной разницей, что эмбрионы должны рассматриваться с БДМ в отдельных, отмеченные блюда для эмбрионов.
- Для эмбрионов до 62 hpf, приобрести z стеки эндокарда, используя 561 Нм и 488 нм для красный и зеленый люминесцентной сигналов, соответственно. Для эмбрионов на этапах старше 62 hpf, используйте multiphoton лазерные набор для 940 нм для изображения зеленый Каэдэ вместо 488 нм лазер.
7. изображение анализ для эмбрионов до 48 hpf
Примечание: Ткани движения АВК может быть трудным для анализа из-за своей сложной трехмерной структуры. Чтобы измерить длину photoconverted региона в AVC между двумя регионами не photoconverted или длина номера photoconverted региона в AVC между двумя регионами photoconverted, это может быть желательным для сопоставления трехмерной структуры на двумерной карте. Изображения photoconverted эмбрионы, полученные до 48 hpf могут быть проанализированы с использованием следующий метод.
- Импорт изображений в Matlab или любого аналогичного программного обеспечения.
- Разграничивать вручную ROI, т.е. эндокарда и применить маску, чтобы удалить сигнал за пределами этого региона.
- Примените порога интенсивности на изображении для определения точки на эндокарда и печать их в трех измерениях. Изолируйте точек, соответствующих узкой и наиболее прямой частью АВК, путем удаления вручную точки никакого интереса по предсердия и желудочка, используя команду стереть в программном обеспечении.
- Используйте цилиндр для определяющих точек, представляющих полученные таким образом AVC.
- Определите справочной системы для сравнения нескольких образцов. Например принять центр масс AVC точек как происхождение эталонной системы и оси установлены цилиндра как оси z.
- Убедитесь, что положительный z позиции всегда соответствуют той же стороне сердца (желудочков или предсердий).
- Проект AVC точек на плоскости x-y и использовать эллипса с учетом их.
- Вращайте эндокарда точек вокруг оси z, так что главной оси эллипса и y справочной системы являются параллельными и положительный y значения соответствуют к внутренней стороне АВК в отношении эмбриона.
- Сегмент АВК, вырезать трехмерного объекта dataset с некоторые самолеты, полученные путем поворота полуплоскости {y = 0, x > 0} в z направлении.
- Проект интенсивность соседних пикселов на этих самолетах и определить эндотелия и последовательным образом. Например черту вручную от фибрилляции желудочков сторону AVC на половину толщины эндотелия.
- Интерполировать точек линий, представляющих эндотелия с трехмерной сплайна с использованием панели сплайна представляют АВК с поверхностью.
Примечание: Количество плоскостей резания определяет как точность сегментации и время потребление этого шага. Как правило 8 самолетов являются достаточно для достижения хороших результатов.
- Определите орбитальное положение каждой точки на поверхности AVC, с помощью цилиндрических координат.
- В каждом азимутальном положении определите параметрической кривой вдоль поверхности АВК, расчет длины дуги на поверхности между последовательными точками.
- Для каждой параметрической кривой определите точку на кривой ближе к центру AVC к нулю. Точки АВК таким образом полностью описаны в их азимутальном положении и их положение на параметрической кривой.
- Разворачиваться АВК в двумерное изображение, используя параметрический положение точек.
- Найти по краям региона для количественного определения как края бинарного образа Бинаризация соотношение интенсивностей photoconverted и не photoconverted каналы. При необходимости вручную измените результат.
- Рассчитайте длину дуги между краями для вычисления длины ткани как функция азимутальном положении.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Пример photoconverted эмбриона на 48 hpf и снова imaged на 80 hpf показан на рисунке 2, фильмы 1 и 2. Подвергая Каэдэ 405 нм свет необратимо преобразует из белка из его флуоресцентный зеленый формы флуоресцентные красный форму, позволяя поведение клеток, помечены зеленый или красный формы следует придерживаться в отношении их дифференциально цветные соседи при формировании клапана. Можно увидеть, что несколько photoconverted клетки 48 hpf AVC позднее распространились и позднее проживали преимущественно на одной стороне клапана листовки.
Пример результатов, которые могут быть достигнуты путем применения метода анализа изображений, описанного на 36 hpf эмбриона, после photoconverting ЭЭС в предсердия и желудочка показано на рисунке 3. Сегментация АВК позволяет параметризации трехмерную структуру, которая затем проецируется в двух измерениях для облегчения визуализации и анализа. Этот метод позволяет определить расстояние между двумя регионами photoconverted. Повторяя этот процесс в разные времена развития возможна для изучения миграции клеток к AVC (Боселли et al., в печати)9.
Рисунок 1 : Форма используется для создания агарозы скважин. A) передний вид. B) вид сзади. C-D) Вид. E-F) Косые взгляды. Размеры указаны в миллиметрах. С. STL-файл для шаблона формы приводится в дополнительных материалах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Представитель результаты Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede) сердце эмбриональных photoconverted. A) эмбриональных сердце сразу после photoconversion на 48 hpf. Цитоплазматическая Kaede в нескольких ячейках Улучшенный стороны АВК был преобразован из своей зеленой форме его красной форме. B) же эмбриона на 80 hpf. Видно, что ранее photoconverted клетки расширились и стали проживать на внутренней стороне Улучшенный предсердно клапан. Масштаб бары: 20 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Представитель результаты процесса анализа изображений на 36 hpf эмбриона. A) в результате трехмерной сегментации AVC в системе координат, которая является общей среди эмбрионов; сигнал от photoconverted (пурпурный) и не photoconverted (зеленый) Каэдэ проецируется на ее поверхность и помечает в регионах photoconverted и не photoconverted. B) AVC разворачивались согласно параметрический положение его точки и сигнал прогнозируется в двух измерениях для легче визуализации. Края не photoconverted региона помечены в белом. C) длина номера photoconverted региона строится как функция угловое положение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Фильм 1: эмбриональных сердце сразу после photoconversion на 48 hpf. Связанные с рисунок 2A. Фильм идет через стек приобретенных z 48 hpf эмбриона, показано на рисунке 2A фрагмент z z срез. Только один z самолет был выбран во время процесса photoconversion, но здесь можно увидеть, что клетки на различных глубинах были photoconverted. Z-фрагменты являются интервалом 2 мкм друг от друга. Щелкните правой кнопкой мыши, чтобы скачать этот фильм.
Фильм 2: photoconverted эмбриональных сердце 80 hpf. Связанные с Рисунок 2B. Фильм идет через стек приобретенных z 80 hpf эмбриона, показано на рисунке 2B фрагмент z z срез. Z-фрагменты являются интервалом 2 мкм друг от друга. Щелкните правой кнопкой мыши, чтобы скачать этот фильм.
Дополнительный файл: Связанные с рис. С. STL-файл для шаблона формы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Сроки photoconversion: Хотя Каэдэ остается ярко выраженный в ЭЭС, даже на 96 hpf, следует отметить, что по мере развития эмбриона, лазерный свет рассеивает больше прежде чем он достигнет AVC, затрудняя замкнутых photoconversion Каэдэ. В эмбриональных стадий позднее 55 hpf, воздухоплавание предсердия и желудочка также означает, что фиолетовый лазерный луч используется для photoconversion не может достичь AVC клетки без первого прохождения через Атриум или желудочка. Это означает, что помимо 55 hpf, чтобы photoconvert ЭЭС АВК, один должен также photoconvert дополнительные ЭЭС в предсердие и желудочек.
BDM и tricaine: Точная photoconversion ЭЭС требует временно остановить сердце от побоев. BDM (2,3-butanedione monoxime) является электро сократительная uncoupler, которая хорошо известна подавить сердечной мышцы сжатия12. Мы не наблюдаем различия между морфологией эмбрионов, которые были предметом настоящего Протокола, и эмбрионов, которые росли нормально и не имели их сердца, остановился для воображения. Однако риск остается, что медикаментозное лечение изменяет нормальное развитие13. Концентрированные tricaine может также использоваться временно остановить сердце14. Мы находим, что мы можем эффективно остановить сердце, поместив эмбрионов в среде эмбриона с 0,32% tricaine за 1 мин и поддержания сердца в остановленное состояние путем переноса эмбрионов эмбриона средний с 0,16% tricaine. Подобно BDM лечения, сердце может быть остановлен таким образом 30 мин и вернуться в течение 5 мин после возвращения эмбрионов в среду нормального эмбриона можно увидеть сердцебиение. Следует избегать более высокие концентрации tricaine; низкие концентрации tricaine для длительных периодов (h/дней) было показано, влияют на нормальное эмбриональное развитие15,16. Tricaine решение, используемое для остановки сердца лучше всего свеже. Если используются замороженные аликвоты, убедитесь, чтобы сохранить решение, хорошо защищенное от света и разморозить tricaine без нагрева решение выше 30 ° C. Наконец чтобы остановить сердце без тяжелых побочных эффектов13поступили blebbistatin. Мы не испытали этот последний метод в нашей лаборатории.
Монтаж и размонтирования: правильное позиционирование эмбрионов важно во время photoconversion. Пресс-формы для изготовления агарозы скважин облегчает монтаж эмбрионов, таким образом, чтобы передняя задней оси эмбриона неизменно лежит в 25° по отношению к поверхности посуды. Мы нашли плесень применяться для photoconversion на всех стадии между 36 и 55 hpf. В монтажа, наклон эмбриона в направлении слева направо должна корректироваться с учетом стадии развития эмбриона и область, которую хочется photoconvert. Например, для photoconvert АВК в 36 hpf, эмбрион должен сталкиваться примерно 15° влево, на 55 hpf, эмбрион должен сталкиваться примерно 10° слева. Под стереомикроскопом вы должны иметь возможность видеть AVC, unobscured желудочка или атриум. Если, к примеру, Атриум лежит над АВК, не представляется возможным для photoconvert просто AVC или просто атриум. Для визуализации целей, же форма используется для расположения эмбрионов между 36 и 96 hpf. Плесень может производиться с использованием различных материалов с использованием 3D-принтер или традиционные механические инструменты. Нержавеющая сталь или химического и теплового пластика являются оба подходящих материалов. Бы для создания плесени, с помощью 3D-принтер, пожалуйста, смотрите дополнительную информацию для читателя. STL-файл шаблона формы.
Добавление достаточно LMP агарозы для покрытия всего эмбриона рекомендуется обеспечить эмбрионы не выбили между монтажа и photoconversion/изображений, особенно если микроскоп не находится непосредственно рядом со станцией монтажа. В целом при том условии, что должным образом установлены эмбрионы, LMP агарозы не придерживаться эмбрионов после размонтирования. Однако, некоторые LMP агарозы остаются застрял на эмбрион, LMP агарозы могут быть удалены путем мягко теребят эмбриона от агарозы, используя пинцет.
Эмбрионов, особенно эмбрионов менее чем 48 hpf, могут быть легко повреждены во время монтирования и размонтирования. Для эмбрионов менее чем 48 hpf, мы рекомендуем огонь полировки к концу пипетки стеклянные для предотвращения повреждения эмбрионов во время закупорить.
Микроскоп: этот протокол была выполнена с помощью микроскопа Leica SP8. Однако, photoconversion устоявшиеся процесс и этот протокол должен быть легко конвертируемые в других вертикально Микроскопы оснащены лазеры способны производить 405 нм, 488 нм и 561 Нм свет. Для эмбрионов до 62 hpf, изображения были приобретены с помощью Аргонового лазера возбуждения и DPSS 561 лазер для Каэдэ красный и зеленый, соответственно. Для эмбрионов на этапах старше 62 hpf, зеленый Каэдэ может быть возбужден multiphoton лазером, равным 940 нм, который имеет большую глубину проникновения чем 488 нм свет. В теории красный Каэдэ должны иметь двух Фотон возбуждения спектров похож на DsRed и может отражаться на 950 Нм17.
С высокая числовая апертура объектива необходимо эффективно photoconvert ЭЭС и получить изображения с высоким разрешением. Так как эмбрионы находятся в СМИ, важно выбрать микроскоп с объективом цель воды.
Photoconverting региона интерес: желательно, чтобы быть консервативным, при выборе ROI для photoconvert - 405 нм лазер проникает, как она проходит через ткани и может photoconvert клетки в области больше, чем выбрано. Если, например, вы хотите пометить ячейку красный, но хотели бы ячейку непосредственно прилегающих к остаются зелеными, это может быть целесообразно выделить только часть клетки, лежал далее от смежную ячейку как ваш ROI. Так как Каэдэ выражается в цитоплазме ЭЭС, photoconverted белка будет диффузного в части ячейки по ROI не выбран.
Фотообесцвечивание и Фототоксичность: Каэдэ белка, его зеленые и красные формы, чрезвычайно яркие и Фотообесцвечивание как правило не является ограничивающим фактором в ячейке, Отслеживание экспериментов. Однако лазерный свет может повлиять на развитие эмбриона и должно быть сведено к минимуму, особенно на ранних стадиях развития. Признаки Фототоксичность включают задержки развития и, в более серьезных случаях, неправильное сердце циклов и искаженной клапанов.
Фиолетовый лазер (25%) и количество итераций, фиолетовый лазер сканирует над ROI (3 - 6 раз), используемые в настоящем протоколе были определены эмпирически. В эти параметры мы видели почти полное преобразование Каэдэ от ее зеленые красные формы без заметное отставание. Количество мощности лазера, необходимых в других микроскопии установок будет зависеть от интенсивности лазера. Следует отметить, что красный форме Каэдэ можно отбеленная интенсивным освещением 405 нм, поэтому больше photoconversion не обязательно дают более красной флуоресценцией.
Анализ изображений: предлагаемый метод для анализа изображений является недавно разработанный процесс описания трехмерной геометрии АВК и сравнить его среди эмбрионов. Он предназначен для быть применены к монослоя трубчатых структур, таких как AVC до 48 hpf и потенциально сердце трубки, спинной аорты и др. Это главным образом автоматически, даже несмотря на то, что сегментация на плоскости резания выполняется вручную пользователем, и другие шаги могут потенциально требуют ручной коррекции. Ручная сегментация представляет наиболее важной частью этого процесса, поскольку знание структуры геометрии и профессиональной подготовки необходимы для достижения хороших результатов. После занятий, время потребление этот шаг значительно снижается.
Протокол, описанные здесь обеспечивает эффективный способ для отслеживания движений эндокарда ткани во время AVC и предсердно сердца клапан разработки с использованием трансгенные линии данио рерио Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede) .
В настоящее время один из ключевых недостатков этого метода является, что фиолетовый лазерный луч не ограничивается в измерении осевой. Это делает на отдельные ячейки для photoconversion и следовательно Клональный анализ и одноклеточного слежения, трудно. Два года назад, было обнаружено, что photoconvertible белков, которые могут быть инициированы Dendra2 преобразован - белка может быть преобразован из своей зеленой форме его красной форме, первый облучающих белка с синим светом, а затем с ближнего инфракрасного света18. Микроскоп установок, которые используют это свойство можно photoconvert Dendra2 выражая клетки образом пространственно замкнутых в сложных 3D тканевых структур избегая многих Фототоксичность проблем, связанных с интенсивным вблизи УФ-облучения18 , 19 , 20. с недавним открытием молекулярный механизм за это явление, вариантов много зелено красные photoconvertible флуоресцентных белков, включая Каэдэ, были спроектированы таким образом, способны также ввод загрунтовать промежуточного 21государство. К нашему знанию данио рерио трансгенных линий где промоутер например fli1a или kdrl диски выражения протеина Dendra2 или другие загрунтовать конвертируемых флуоресцентных белков в эндотелиальных клетках не доступны. Однако линии, которые выражают Dendra2 повсеместно доступны и могут оказаться полезными в некоторых приложений 22,23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Конфликта интересов не объявлен.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Энн-Laure Duchemin, Дениз Duchemin, Натали Faggianelli и Basile ГУРЧЕНКОВ за помощь дизайн и сделать плесень, указанных в настоящем Протоколе. Эта работа была поддержана FRM (DEQ20140329553), НРУ (АНР-15-CE13-0015-01, АНР-12-ISV2-0001-01), программа следователя ЭМБО молодых, Европейское сообщество, КЧП CoG N ° 682938 компьютерные и Грантом АНР-10-LABX-0030-INRT, французский государственный фонд управляется Agence Nationale de la Recherche под рамки программы Investissements будущее меткой НРА-10-IDEX-0002-02.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Necessary equipment for raising fish and collecting eggs (see the Zebrafish Book22 for details). | |||
| Stereomicroscope | |||
| Upright confocal microscope (Equipped with lasers operating at 488 nm, 561 nm, and 405 nm, a tunable multiphoton laser, and a Leica HCX IRAPO L, 25 ×, N.A. 0.95 objective) | Leica | Leica SP8 | |
| Heat block | ThermoScientific | 88870001 | |
| 35 mm x 10 mm tissue culture dish | Falcon | 353001 | |
| 6 well plate | Falcon | 353046 | |
| Petri dish | |||
| Forceps | |||
| Glass pipette | |||
| Mold | |||
| Reagents | |||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| PTU (1-phenyl-2-thiourea) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| Software | |||
| Matlab equipped with the Image Analysis, Curve Fitting, Bio-Formats Toolboxes | MathWorks | ||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 200 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 25 mL Danieau | |||
| Adjust to pH 7, aliquot and store at -20 °C | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| 1 g BDM | Sigma-Aldrich | 112135 | |
| 10 mL ddH2O | |||
| Aliquot and store at -20 °C | |||
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| 50.7 g NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| 0.78 g KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| 1.47 g Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| 2.1 g Calcium nitrite tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 13477-34-4 | |
| 19.52 g HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| Adjust to pH 7.2 and store at room temperature | |||
| Mold | |||
| PlasCLEAR resin | Asiga | ||
| Plus 39 Freeform Pico 3D printer | Asiga |
References
- Chow, R. W., Vermot, J. The rise of photoresponsive protein technologies applications in vivo: a spotlight on zebrafish developmental and cell biology. F1000Res. 6, (2017).
- Sehnert, A. J. Cardiac troponin T is essential in sarcomere assembly and cardiac contractility. Nat Genet. 31, 106-110 (2002).
- Peal, D. S., Lynch, S. N., Milan, D. J. Patterning and development of the atrioventricular canal in zebrafish. J Cardiovasc Transl Res. 4, 720-726 (2011).
- Boselli, F., Freund, J. B., Vermot, J. Blood flow mechanics in cardiovascular development. Cell Mol Life Sci. 72 (13), 2545-2559 (2015).
- Steed, E., Boselli, F., Vermot, J. Hemodynamics driven cardiac valve morphogenesis. Biochim Biophys Acta. , (2015).
- Boselli, F., Vermot, J. Live imaging and modeling for shear stress quantification in the embryonic zebrafish heart. Methods. , (2015).
- Steed, E. klf2a couples mechanotransduction and zebrafish valve morphogenesis through fibronectin synthesis. Nat Commun. 7, 11646 (2016).
- Herwig, L. Distinct cellular mechanisms of blood vessel fusion in the zebrafish embryo. Curr Biol. 21 (22), 1942-1948 (2011).
- Boselli, F., Steed, E., Freund, J., Vermot, J. Anisotropic shear stress patterns predict the orientation of convergent tissue movements in the embryonic heart. Development. , (2017).
- Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development. J. Vis. Exp. (67), (2012).
- JoVE Science Education Database. Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Breeding and Embryo Handling. , JoVE. Cambridge, MA. (2017).
- Watanabe, Y. Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes. Br J Pharmacol. 132 (6), 1317-1325 (2001).
- Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cell Physiol Biochem. 25 (4-5), 419-424 (2010).
- Pestel, J. Real-time 3D visualization of cellular rearrangements during cardiac valve formation. Development. 143 (12), 2217-2227 (2016).
- Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin. PLoS One. 10 (8), e0134005 (2015).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
- Marchant, J. S., Stutzmann, G. E., Leissring, M. A., LaFerla, F. M., Parker, I. Multiphoton-evoked color change of DsRed as an optical highlighter for cellular and subcellular labeling. Nat Biotechnol. 19 (7), 645-649 (2001).
- Dempsey, W. P. In vivo single-cell labeling by confined primed conversion. Nat Methods. 12 (7), 645-648 (2015).
- Mohr, M. A., Pantazis, P. Single neuron morphology in vivo with confined primed conversion. Methods Cell Biol. 133, 125-138 (2016).
- Mohr, M. A., Argast, P., Pantazis, P. Labeling cellular structures in vivo using confined primed conversion of photoconvertible fluorescent proteins. Nat Protoc. 11 (12), 2419-2431 (2016).
- Mohr, M. A. Rational Engineering of Photoconvertible Fluorescent Proteins for Dual-Color Fluorescence Nanoscopy Enabled by a Triplet-State Mechanism of Primed Conversion. Angew Chem Int Ed Engl. 56 (38), 11628-11633 (2017).
- Dempsey, W. P., Fraser, S. E., Pantazis, P. PhOTO zebrafish: a transgenic resource for in vivo lineage tracing during development and regeneration. PLoS One. 7 (3), e32888 (2012).
- Dempsey, W. P., Qin, H., Pantazis, P. In vivo cell tracking using PhOTO zebrafish. Methods Mol Biol. 1148, 217-228 (2014).
