녹 농 균 감염에 취약 한 호스트 중요 한 병 적 상태를 발생합니다. P. 농 균 스트레인 PA14NR 설정으로 지정 하는 PA14의 비중복 transposon 삽입 돌연변이 라이브러리 수많은 프로세스에서 유전자 기능 분석을 촉진 한다. 여기에 제시 된 높은 품질 PA14NR 설정 돌연변이 라이브러리의 복사본을 생성 하는 프로토콜이입니다.
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방법 논문
주문, 녹 농 균 스트레인 PA14 Transposon 삽입 돌연변이의 비중복 라이브러리의 복제
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
녹 농 균 phenotypically 및 genotypically 다양 하 고 융통성 있는 그람 음성 박테리아 인간의 환경에서 유비 쿼터 스입니다. P. 녹 농 균 은 biofilms 형성, 항생제 내성, 독성 요인, 생산 및 만성 감염 동안 빠르게 진화 수 있습니다. 따라서 피 녹 농 균 하면 둘 다 급성과 만성, 감염, 치료 하기 어려운 특정 환자 인구에 있는 중요 한 병 적 결과. P. 농 균 스트레인 PA14 다양 한 포유류 및 nonvertebrate 호스트 만들기 PA14이 병원이 체를 공부에 대 한 매력적인 스트레인 감염 보존된 게놈 구조와 인간의 임상 분리 이다. 2006 년에, 4,596 예측된 PA14 유전자에 해당 하는 5,459 돌연변이 포함 하는 비중복 transposon 삽입 돌연변이 라이브러리 생성 되었습니다. 그 이후, PA14 라이브러리의 연구 커뮤니티 개별 유전자의 기능 및 복잡 한 경로 P. 녹 농 균의 더 나은 이해를 허용 했다. 복제 프로세스를 통해 도서관 무결성의 유지 관리는 적절 한 처리 및 정확한 기술을 필요합니다. 이 위해,이 원고 도서관 복제, 라이브러리 품질 관리 및 개별 돌연변이의 적절 한 저장소에 단계가 자세히 설명 하는 프로토콜을 제공 합니다.
서론
녹 농 균 phenotypically 및 genotypically 다양 하 고 융통성 있는 그람 음성 박테리아 피부 microflora 뿐만 아니라 토양, 물, 그리고 가장 인간의 환경에 이다. 많은 세균성 종에 비해, P. 농 균 는 5.5-7 Mbp 콘텐츠 높은 G + c (65-67%)의 비교적 큰 게놈. 또한, 그것의 유전자의 상당한 비율이 변화 적응성에 참여 하 고 환경 스트레스1에 응답에 큰 유연성을 허용 하는 규제 네트워크의 부분 이다. P. 녹 농 균 독성 요인의 과다를 표현, 양식 biofilms proclivity를 전시, 통해 경로 감지 하는 여러 개의 쿼럼 응답을 조정 하는 능력을 보유 하 고 및 항생제 저항을 개발 하는 주목할 만한 용량을 표시 그리고 허용 오차2,3,,45,6,7,
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프로토콜
주의: 피 녹 농 균, 인간 병원 체를 취급 하는 때 표준 BSL-2 안전 조치를 사용 합니다. 만약 당신이 immunocompromised 개인 또는 세균성 감염 민감성을 증가 시키는 어떤 건강 상태, 주의 특별 한 피 를 작업할 때 녹 농 균입니다. 해당 교육 기관에 biosafety 사무실을 상담 하 고 사용 하기 전에 의사 로부터 승인을 PA14 NR 설정 또는 세균성 병원 체의 돌연변이 라이브러리.
그림 1: 개요는 PA14NR의 프로토콜 i: 복제 설정. 제 1 일: "마스터 복사" PA14NR 설정의 파운드 한 천 매체에서 냉동된 돌연변이 문화 및 성장 37 ° c.에 하룻밤 돌연변이 주 2: 깊은 잘 블록 파운드 액체 국물 포함 된 돌연변이 성장 파운드 한 미디어에서 전송, 하룻밤 950 rpm에서 떨고와 37 ° C에서. 제 3 일: 글리세롤, 하룻밤 파운드 문화 혼합 후 장기 저장을 위한 대상 9....
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결과
PA14NR 설정의 12 개의 새로운 복사본, 그리고 생성 하는 새 복사본의 품질 관리 평가 프로토콜 III를 사용 하 여 실시 하는 프로토콜을 사용 하 여 복제 했다.
PA14NR 설정 컨트롤 플레이트, 야생 형식 PA14로 구성 된 함께 돌연변이 판 주사 및 미리 설정 된 패턴 (그림 4A)에 삽입 된 웰 스 uninoculated, 복제 된 methology 프로토콜 I. 제어에 설명 된 다음 접시는 포함 에 판 복제를 수행할 때 가능한 interwell 오염 평가를 PA14NR 설정 합니다. 또한, 제어 플레이트는 transposon 삽입 돌연변이 포함 하는 접시에 액세스 하기 전에 연습 복제 기법을 사용할 수 있습니다. 컨트롤 플레이트의 성장 했다 파운드 한 천 배지 및 야간 보육 예상된 성장 패턴 (.......
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토론
P. 녹 농 균 PA14NR 설정 하는 것은 과학계에 대 한 귀중 한 자원 이다. Clarivate 분석의 중요 과학 지표 데이터베이스, Liberati 그 외 여러분 에서 3 월 2017 데이터 집합에 따라 (2006 년) 37, PA14NR 설정의 건설을 설명 하는 미생물학 간행물의 최고 1%에서 평가 된다. Google 학술 검색 보고 Liberati 그 외 여러분 의 600 인용 (2006 년) 8 월 2017로 원래 원고. 라이브러리는 elucidating P. 농 균 병 기본 메커니즘에서 중요 한 역할을 했다. 중요 한 것은, 96-잘 플레이트 형식 PA14NR 설정의 높은 처리량 유전 스크린을 P의 다양 한 연구 설계를 촉진 한다. 녹 농 균 돌연변이 고기44,,
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공개 사항
저자는 금융 충돌의 관심을 보고. 엘리 아나 Drenkard와 프레드릭 Ausubel PA14 비중복 transposon 돌연변이 라이브러리 생성에 참가. 브라이언 헐리 Lael Yonker 현재 집와 매사 추세 츠 종합 병원에서 소아과의 부의 일환으로 돌연변이 라이브러리를 배포.
감사의 글
우리 데이터베이스 검색에 그녀의 지도 대 한 MGH 트레드웰 가상 라이브러리의 리사 Philpotts를 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 낭 성 섬유 증 기초 (YONKER16G0 및 HURLEY16G0) 및 NIH NIAID에 의해 지원 되었다 (BPH와 에이드: R01 A1095338).
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
2
Nunc OmniTray를 통한 25 Fisher Scientific Rectangular Ice Pan60 케이스 케이스 Breathe-Easy 멤브레인을 통한 100개의 팩, 멸균을 통한개의 팩100 케이스 팩을 ART Barrier 저잔류 피펫 팁(10 uL, 100 uL, 1000 uL)을 통한 Thermo Scientific 1L dHO당 Sigma-Aldrich 통한 G5516 수치 via
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Materials for Library Replication | |||
| Sterile 96-well Tissue-culture treated, case of 50 | Corning Life Sciences | 353072 | via Fisher |
| Scientific Sterile 96 Well Clear V-Bottom 2000μ L 딥 웰 플레이트, | Fisher Scientific | Corning Life Sciences | 3960 |
| 케이스(직사각형 플레이트), | 을 통한 | Thermo Scientific Rochester | 242811 |
| , Midi(4L) | Corning Life Sciences | 432104 | Fisher Scientific |
| Secure-Gard Cone Mask 케이스, Fisher를 통한 300 | Cardinal Health | AT7509 | Scientific |
| AluminaSeal, | Fisher Scientific | 다양한 생명공학 | ALUM-100 |
| Sigma-Aldrich | 100 | 다양한 생명공학 | BEM-1 |
| , 개별 포장, 50mL 용액 트로프/시약 저장소, | Westnet Incorporated 플레이트 롤러를 통한 | Sorenson | S50100 |
| VWR | 60941-118 | VWR | |
| Cryo Laser Labels를 통해 - CRYOLAZRTAG 2.64" x 0.277", 16매 팩 | GA International | RCL-11T1-WH | via Labtag.com(Labtag.com 에서도 인쇄 템플릿 사용 가능) |
| 96-well replicator | V & P 사이언티픽, Inc. | 사용자 정의 407C, 3.18mm 핀 직경, V 및 를 통해 57mm 길이 | P 사이언티픽, Inc. |
| Multitron Pro, 3mm 쉐이킹 인큐베이터 | Infors HT | l10003P | via Infors HT |
| Picus 12 채널 50-1200μ L 전자 피펫 | Sartorius | 735491PR | via Sartorius |
| 필터 팁 50-1200μ L, 960 | Biohit | 14-559-512 | 통해 Fisher Scientific; 전자 다중 채널 호환 팁 사용 |
| 드라이 아이스 | 사용자 특정 공급업체< | ||
| em>개별 돌연변이 저장을 위한 재료 | |||
| Fisherbrand 프리미엄 마이크로 원심분리기 튜브: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-130 | via Fisher Scientific |
| 피펫(P1000, P200, P20, P2) | Gilson | F167370 | via Gilson |
| Materials for Quality Control PCR | |||
| Fisherbrand 프리미엄 마이크로 원심분리기 튜브: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-130 | via Fisher Scientific |
| NanoDrop | Thermo Scientific | ND-2000 | via ThermoFisher |
| PCR Thermocycler | |||
| 돔형 뚜껑이 있는 Omnistrips PCR 튜브 | Fisher | Scientific | AB0404Molecular |
| BioProducts, Inc. | Z676543(10 uL), Z676713(100 uL), Z676802(1000 uL) | via Sigma-Aldrich | |
| Pipettes (P1000, P20, P2) | Gilson | F167370 | via Fisherbrand |
| 프리미엄 마이크로 원심분리기 튜브: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-130 | via Fisher Scientific |
| MasterPure DNA Purification Kit | Epicentre | MCD85201 | via Epicentre Technologies Corp |
| GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder, ThermoFisher를 통한 즉시 사용 가능한 | Thermo Scientific | SM1333 | |
| RediLoad 로딩 버퍼 | Invitrogen | 750026 | ThermoFisher를 통한 ThermoFisher |
| Chemicals | |||
| em>Chemicals 라이브러리 및 개별 돌연변이 저장 | |||
| Glycerol MB Grade, 1L | Sigma Aldrich | ||
| LB 육수를 | : 트립톤 10g, 효모 추출물 5g, NaCl 5g, 1ml 1N NaOH(분자 생물학의 현재 프로토콜. Wiley, 1994.) | ||
| 트립톤 | 시그마 알드리치 | T7293 | 비아 시그마-알드리치 |
| 효모 추출물 | 시그마 알드리치 | Y1625 | 비아 시그마-알드리치 |
| 소듐 클로라이드 | 시그마 알드리치 | S7653 | 시그마-알드리치 |
| 산화나트륨 | 시그마 알드리 | S8045 | 비아 시그마-알드리치 |
| LB 한천 | 위의 준비를 참조하시고, 15g 바토 한천을 추가하십시오. | ||
| Bacto Agar | Sigma Aldrich | A5306 | via Sigma-Aldrich |
| Gentamicin sulfate, 10g | BioReagent | 1405-41-0 | via Sigma-Aldrich |
| Kanamycin sulfate | Gibco | 11815024 | via ThermoFisher |
| Ethanol, 190 proof | Decon | 04-355-221 | via Fisher Scientific |
| Chemicals for Quality Control PCR | |||
| 프라이머 | 사용자 선호 공급업체 | 표 3에 나열된 프라이머 참조 | |
| Corning cellgro Molecular Biology Grade Water | Corning | 46000CV | via Fisher |
| Scientific Taq 중합효소 완충액 | Invitrogen | 10342020 | via ThermoFisher |
| Taq DNA 중합효소, 재조합 | Invitrogen | 10342020 | via ThermoFisher |
| dNTPs | Invitrogen | 10297018 | via ThermoFisher |
| 아가로스 | 시그마 | A9539 | Sigma-Aldrich |
참고문헌
- Moradali, M. F., Ghods, S., Rehm, B. H. Pseudomonas aeruginosa lifestyle: A paradigm for adaptation, survival, and persistence. Front Cell Infect Microbiol. 7, 39(2017).
- Bleves, S., et al. Protein secretion sy....
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