Neste artigo, vamos mostrar imagens ao vivo de vermes individuais empregando um dispositivo microfluidic personalizado. No dispositivo, vários vermes limitam-se individualmente para separar câmaras, permitindo multiplexada vigilância longitudinal de vários processos biológicos.
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Artigo de método
Uma plataforma Microfluidic para Imaging Longitudinal em Caenorhabditis elegans
Neste artigo
Resumo
Resumo
Na última década, microfluidic técnicas foram aplicadas para estudar pequenos animais, incluindo o nematódeo Caenorhabditis elegans, em provaram útil como uma plataforma de imagem ao vivo conveniente, fornecendo recursos para o controle preciso de condições experimentais em tempo real. Neste artigo, vamos mostrar imagens ao vivo de vermes individuais, empregando o WormSpa, um dispositivo microfluidic personalizado anteriormente publicada. No dispositivo, vários vermes limitam-se individualmente para separar câmaras, permitindo multiplexada vigilância longitudinal de vários processos biológicos. Para ilustrar o recurso, realizamos experimentos de prova de princípio em que minhocas foram infectadas no dispositivo com bactérias patogênicas e a dinâmica da expressão de genes de resposta imune e postura de ovos foram monitorada continuamente no indivíduo animais. O design simples e operação deste dispositivo torná-lo adequado para usuários sem experiência anterior com experimentos microfluidic-baseado. Propomos que esta abordagem será útil para muitos pesquisadores interessados nas observações longitudinais de processos biológicos, sob condições bem definidas.
Introdução
Mudanças nas condições ambientais podem levar a ativação de programas genéticos, acompanhado por indução e repressão da expressão de genes específicos1,2. Essas alterações cinéticas podem ser variável entre tecidos nos mesmos animais e entre animais diferentes. Estudos de tais programas genéticos, portanto, chamar para métodos que permitem a imagem longitudinal de animais individuais e fornecem controle dinâmico preciso das condições ambientais.
Nos últimos anos, microfabricated fluídico dispositivos têm sido usados para estudar muitos aspectos da resposta e comportamento em pequeno....
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Protocolo
O protocolo abaixo usa WormSpa5, um dispositivo microfluidic descritas anteriormente para a imagem latente longitudinal de vermes. Fabricação de WormSpa (começando com arquivos de CAD que podem ser obtidos os autores mediante solicitação) é simples, mas requer alguma experiência. Na maioria dos casos, fabricação pode prontamente ser feita por uma instalação de núcleo ou por uma empresa comercial que fornece esses serviços. Quando o dispositivo de fabricação, certifique-se de especificar que a altura das características 50 µm.
1. experimental Setup
- Monte o dispositivo microfluidic em um microscópio de fluore....
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Resultados
Idade-sincronizado em vermes de adultos jovens (46 horas pós prisão larval de L1 a 25 ° C)12 foram carregados no dispositivo, conforme descrito no protocolo. Individualmente, os vermes estavam localizados em canais separados, permitindo a medição longitudinal da resposta dos animais ao patógeno. Quando a experiência for bem sucedida, a maioria dos vermes permanecem em seus canais para a duração do experimento. Neste caso, imagens de worms individuais são tomadas si.......
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Discussão
Microfluidic ferramentas fornecem vários benefícios no estudo de vermes. Imaging em um PDMS dispositivo oferece maior qualidade de imagem em comparação com uma placa de ágar padrão NGM. Várias imagens podem ser tomadas a partir de um único verme, em contraste com os métodos tradicionais em que os animais são colhidos a partir da placa e montados sobre uma lâmina de microscópio para a imagem latente. Além disso, o microambiente no qual residem vermes pode ser mantido constante ou modulado conforme desejado, permitindo pre.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi apoiada pela National Science Foundation através de subvenções PHY-1205494 e MCB-1413134 (EL) e pela 2017R1D1A1B03035671 de concessão da Fundação de pesquisa nacional da Coreia (KSL).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| WormSpa | N/A | N/A | O arquivo CAD do WormSpa está disponível no laboratório Levine. |
| Microscópio Composto | Zeiss | AxioObserver Z1 | Um microscópio de fluorescência invertida com platina motorizada |
| Bomba de seringa | New Era | Systems NE-501 | |
| Tubing | SCI Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/5 | 0,034" (0,86 mm) ID x 0,052 " (1,32 mm) Ponta |
| Seringa | CMLsupply | 901-20-050 | 20 Gauge x 1/2" ponta romba canula de aço inoxidável |
| Filtro de seringa | PALL | 4650 | Acrodisc 32 mm com |
| seringa | Qosina | C3307 | Seringa Luer Lock Macho de 10 mL Válvula de |
| 3 vias | ColeParmer | FF-30600-23 | Grande-furo 3-vias, macho-lock, torneiras, 10/pacote, Pino de Cavilha Não Estéril |
| McMaster-Carr | 90145A317 | 18-8 Pinos de Aço Inoxidável (1/32" Dia. x 1/2" Lg.) | |
| Tubo de microcentrífuga de baixa ligação | Corning CL S3206 | 0,65 mL tubo de microcentrífuga de tampa de pressão de baixa ligação |
Referências
- Lopez-Maury, L., Marguerat, S., Bahler, J. Tuning gene expression to changing environments: from rapid responses to evolutionary adaptation. Nat Rev Genet. 9 (8), 583-593 (2008).
- de Nadal, E., Ammerer, G., Posas, F. Controlling gene expression in response to stress.
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Reimpressões e permissões
