Descreveremos um protocolo simples e fácil para medição de reforço dependente de anticorpo da infecção por Zika vírus soro convalescente usando partículas virais da Dengue vírus repórter.
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Artigo de método
A citometria de fluxo simples com base em ensaio para determinar In Vitro anticorpo dependente do realce do vírus da Dengue, usando soro convalescente vírus Zika
Neste artigo
Resumo
Resumo
Realce dependente de anticorpo da infecção foi mostrado para jogar um papel importante na patogênese viral de Dengue. Os ensaios tradicionais que medem a capacidade dos anticorpos ou soro para aumentar a infecção em linhas celulares impermissible têm invocado usando saída viral na mídia seguida de ensaios de placa para quantificar a infecção. Mais recentemente, estes ensaios examinaram a infecção por vírus (DENV) Dengue em linhas celulares usando anticorpos fluorescente etiquetados. Ambas as abordagens têm limitações que restringem o uso generalizado destas técnicas. Aqui, descrevemos um ensaio simples em vitro usando Dengue vírus repórter partículas virais (RVPs) que expressam a proteína verde fluorescente e células K562 para examinar o anticorpo dependente do realce (ADE) de infecção DENV usando soro que foi obtido a partir do rhesus macacos de 16 semanas após a infecção com vírus Zika (ZIKV). Esta técnica é confiável, envolve manipulação mínima das células, não envolve a utilização de vírus competente de replicação ao vivo e pode ser executada em um formato de alta taxa de transferência para obter uma leitura quantitativa usando citometria de fluxo. Além disso, este ensaio pode ser facilmente adaptado para examinar o anticorpo dependente do realce (ADE) de outros flavivirus infecções tais como o vírus da febre amarela (YFV), vírus da encefalite equina japonesa (LILICA), vírus do Nilo Ocidental (WNV) etc onde RVPs estão disponíveis. A facilidade de criação de ensaio, analisando os dados e interpretação de resultados tornam altamente receptivos a maioria das configurações de laboratório.
Introdução
Reforço de dependente de anticorpos (ADE) da infecção é um processo pelo qual respostas parcialmente cross-reactive anticorpos induzidas por um sorotipo de vírus aumenta a absorção de outro sorotipo do vírus, levando a virémia e aumento de replicação viral. ADE tem sido extensivamente documentada em infecções por vírus (DENV) Dengue onde quatro sorotipos principais são predominantes. Em um subconjunto de pacientes, ADE está associada com febre hemorrágica da Dengue (FHD). Recentemente mostramos que infecção por vírus (ZIKV) Zika induzido níveis significativamente elevados de respostas de anticorpos cross-reactive DENV que causou ADE de DENV em vitro e provave....
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Protocolo
As amostras de soro usadas para demonstrar o protocolo descrito aqui foram obtidas de macacos rhesus que estavam alojadas e cuidadas de acordo com o local, estado e federais condições em uma associação para avaliação e acreditação do cuidado de Animal de laboratório Internacional (AAALAC)-credenciado com facilidade. Todos os experimentos com animais foram revistos e aprovados pela Comissão de uso e cuidado institucional do Animal e as amostras foram adquiridas através de um protocolo de compartilhamento de tecido.
1. dia-1
Nota: Execute todos os passos descritos abaixo em uma fluxo de laminar estéril biossegurança ....
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Resultados
Os soros de 4 do rhesus macaques foram coletadas 16 semanas após a infecção com ZIKV e testaram por seu potencial melhorar o DENV-1, 2, 3 e 4 infecção em células K562. Os animais tiveram virémia pico de ~ 1 x 105 cópias de RNA/mL ZIKV de plasma por dia 3 após infecção que recusou-se a níveis que estavam abaixo do limite de detecção por 7 dias após a infecção. Não virémia foi detectada no plasma a pós-infecção 16 semanas. Em seguida, realizou-se o ensaio da RVP e os dados coleta.......
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Discussão
Flavivírus como DENV e ZIKV compartilham significativa evidência de homologia em ambas as suas proteínas estruturais e não estruturais que geram anticorpos que reagem de forma cruzada com os outros13,14. Estas respostas de anticorpos cross-reactive têm sido mostradas para melhorar da infecção in vivo e em vitro com um sorotipo heterólogo ou outros relacionados flavivírus1,2. O potencial .......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
O projeto descrito foi apoiado por fundos da Universidade de Ciências da saúde serviços fardado a JJM. As opiniões ou declarações contidas neste documento são os privados dos autores e não são ser interpretado como oficiais ou refletindo as opiniões do departamento de defesa, a Universidade de serviços fardado de Ciências da saúde ou qualquer outra agência dos Estados Unidos Governo.
WGV executadas todas as experiências e analisa os dados; JJM projetou e supervisionou o estudo; WGW e JJM escreveram o jornal.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| DENV 1-4 RVP | Integral Molecular | RVP-501 | |
| K562 células | ATCC | CCL-243 | |
| RPMI | Corning | 10-040-CV | |
| FBS | GE lifesceinces | SH 30910.03 | 10% FBS em RPMI-10 |
| Penicilina-Estreptomicina | MP biomédicos | 1670049 | 100 UI Pen/mL, 100 ug Strep/mL em RPMI-10 |
| HEPES | Cellegro | 25-060-Cl | 0.025M em solução de aminoácidos não essenciais RPMI-10 |
| MEM (100 vezes;) | Sigma | M7145 | 1x em RPMI-10 |
| Pyruvate | Cellegro | 25-000-Cl | 1mM em RPMI-10 |
| L-glutamina | Fisher Scientific | MT25005CI | |
| Placas estéreis com fundo em V | Thomas Scientific | 333-8001-01V | |
| BD Falcon Polipropileno 5 ml Tubos FACS | VWR | 60819-728 | |
| Placas não estéreis com fundo em U | Falcon | Ref 353910 | Uma alternativa de alto rendimento aos tubos FACS |
| 5mL, estéreis, pipeta serológica | Denville | P7127 | |
| 200uL pontas | de pipeta estéreisPonteiras | P3020 CPS | |
| 20uL | Denville | P1121 | |
| 50-200uL pipeta multicanal | Denville | P3975-8-B | |
| 5-50uL pipeta multicanal | Denville | P3975-9-B | |
| 20% formadeído | Tousimis | #1008B | |
| Banho-maria | ThermoFisher | TSCOL35 | |
| termomixer | Eppendorf | 2231000387 | Uma alternativa a um banho-maria para inativação de calor |
| Incubadora de CO2 | ThermoFisher | 13-998-213 | |
| Etanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Alvejante | Fisher Scientific | NC9724348 | |
| Flowjo 9.8 | TreeStar, Inc. | Software de análise por citometria de fluxo | |
| BD FACSDiva 6.1.2 | Citômetro de fluxo Becton Dikinson | ||
| BD LSR II | Becton Dikinson | ||
| Liquid Bleach | Fisher | Scientific NC9724348 |
Referências
- George, J., et al. Prior exposure to zika virus significantly enhances peak dengue-2 viremia in rhesus macaques. Sci Rep. 7 (1), 10498(2017).
- Stettler, K., et al. Specificity, cross-reactivity, and function of antibodies el....
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Reimpressões e permissões
