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Article de méthode

L’Assemblée et la Purification du Prototype spumavirus Intasomes

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DOI :

10.3791/57453

⸱

19 mars 2018

 ,  , 
1Department of Cancer Biology and Genetics, The Ohio State University College of Medicine

Dans cet article

Résumé

Recombinant intégrase rétrovirale et oligomères d’ADN imitant les extrémités de l’ADN virales peuvent former un complexe enzymatiquement actif connu comme un intasome. Intasomes peut être utilisé pour les études cinétiques, structurales et biochimiques. Ce protocole détaille comment assembler et purifier le prototype spumavirus intasomes.

Résumé

A définition de fonctionnalité et une étape essentielle du cycle de vie rétrovirus est l’intégration du génome viral dans le génome hôte. Tous les rétrovirus encodent une enzyme intégrase (IN) qui catalyse la jonction covalente de virus à ADN, qui est connu comme transfert de brin d’hôte. Intégration peut-être être modélisés dans vitro par recombinaison IN rétrovirale et oligomères d’ADN imitant les extrémités du génome viral. Afin de mieux récapituler la réaction d’intégration qui se produit in vivo, intégration complexes sont assemblés de recombinaison IN et oligomères synthétiques par dialyse dans un tampon de la concentration en sel réduit. L’intégration complexe, appelée un intasome, peut être purifiée par chromatographie d’exclusion. Dans le cas des virus spumeux expérimental (PFV), l’intasome est un tétramère de po et deux ADN oligomères et on sépare facilement de IN monomère et oligomères gratuit ADN. L’efficacité de l’intégration du PFV intasomes peut-être être dosée sous une variété de conditions expérimentales afin de mieux comprendre la dynamique et la mécanique d’intégration rétrovirale.

Introduction

Intégration du génome viral dans le génome de l’hôte est une étape obligatoire dans le cycle de vie de tous les rétrovirus1. L’intégrase enzyme virale (IN) catalyse covalente par le rattachement de chaque extrémité du génome ADN viral à l’hôte de l’ADN. Au cours d’une infection cellulaire, en fait partie d’un complexe d’intégration préalable qui intervient dans l’intégration. Recombinant IN complexé avec double brin oligomères d’ADN imitant les extrémités de l’ADN virales peut effectuer aussi intégration dans une cible ADN in vitro2. Une commune intégration dosage in vitro utilise un plasmide surenroulé comme l’ADN cible. Intégration des deux oligomères d’ADN virales (vDNA) pour le plasmide donne un produit linéaire et est appelée intégration concertée (Figure 2 a). L’intégration dosage in vitro peut aussi donnent des produits avec vDNA qu’une seule liaison covalente a rejoint pour le plasmide de cible, ce qui entraîne un cercle détendu. Ce produit demi-site intégration semble être un artefact de l' essai in vitro.

Recombinant IN et vDNA peuvent effectuer l’intégration in vitro, mais ils ne sont pas réactifs idéales pour l’étude de la dynamique ou la structure des complexes d’intégration lorsque IN monomère obscurciraient visualisation pertinente. Complexes d’intégration purifiée, ou « intasomes », sont nécessaires pour les études structurelles ou analyse dynamique seule molécule. PFV IN et vDNAs peuvent être assemblés par dialyse d’une mémoire tampon de concentration relativement élevée de sel à une plus faible concentration en sel3,4. Au cours de la dialyse, un précipité formes. Ce précipité est supprimé de la dialyse et la concentration en sel est augmentée. La plus forte concentration de sel solubilise le précipité contenant intasomes PFV. Les intasomes sont ensuite purifiés par chromatographie d’exclusion (s). Recombinant prototype virus spumeux (PFV) IN a démontré d’exister comme monomère en solution, à des concentrations allant jusqu'à 225 µM5. Fractionnement SEC sépare efficacement l’intasomes PFV (225,5 kDa), qui comprend un tétramère de PFV IN et deux vDNAs, de monomère PFV dans (44,4 kDa) et gratuit vDNA (24,0 kDa). La PFV intasomes peuvent être congelés et conserver l’activité d’intégration pendant au moins six mois de stockage à-80 ° c.

Recombinant PFV intasomes peut également être modifiée pour inclure dans les substitutions d’acides aminés ou des mutations de troncature ou vDNAs marquées avec des fluorophores ou biotine4,6. Les intasomes PFV purifiés facilement effectuer une intégration dans une cible de plasmide supercoiled ADN in vitro. Analyses biochimiques intégration en vrac avec intasomes peuvent tester les effets de mutations, inhibiteurs, ou autres additifs chimiques. Intasomes biotinylé peut être utilisé pour sonder les affinités avec les acides nucléiques ou des protéines. PFV intasomes fonctionnent à température ambiante permettant analyse microscopie seule molécule par pince magnétique pour mesurer le temps entre l’assemblage des deux extrémités de la vDNA ou fluorescence de réflexion interne totale de visualiser la recherche intasome sur cible ADN6. En outre, intasomes PFV ont été les premiers à être structurellement caractérisent impactant considérablement le domaine de l’intégration rétrovirale3.

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Protocole

1. recuit de vDNA

  1. Combine 1 X tampon de dix (10 X 10 stock : 100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 M NaCl, EDTA de 10 mM), 10 µM Oligo 1 (5' ATTGTCATGGAATTTTGTATATTGAGTGGCGCCCGAACAG 3', 100 µM stock) et 10 µM Oligo 2 (5' CTGTTCGGGCGCCACTCAATATACAAAATTCCATGACA 3', 100 µM stock) dans un volume final de 1,5 mL . Aliquote 25 µL dans soixante tubes de 0,2 mL polymérase chain reaction (PCR).
    Remarque : Selon l’application, oligomères peuvent être modifiées avec des fluorophores ou des balises à l’extrémité 5'-Oligo 2 ou comme un amino-T interne à base 13 par l’extrémité 5'-Oligo 1. Mis à jour l’oligomères devraient être purifiés par chromatographie liquide à haute performance (HPLC) avant recuit. Nous avons trouvé qu’extrémité 5'-Cy3 ou Cy5 fluorophore étiquetage des Oligo 2 l'réduit l’efficacité de l’Assemblée intasome 10 fois. Étiquetage du fluorophore interne ne réduit pas l’efficacité de l’Assemblée.
  2. Recuire en utilisant un thermocycleur avec les températures et les durées suivantes : 1 cycle à 94,0 ˚C 3 min, 99 cycles à (94,0 ˚C 1 min, 93.6 ° c 1 min) les deux températures décroissantes de 0,8 ° c par cycle (le dernier cycle est de 14,8 ° c 1 min, 14,4 ° c 1 min) et conserver à 4,0 ° c.
  3. Combiner les réactions recuites de tous les tubes de soixante. Charger 500 µL à deux 0,5 mL 3 kDa poids moléculaire coupure (MWCO) ultracentrifugation concentration unités de filtration. Concentrer le vDNA recuit par centrifugation dans un microcentrifuge à 14 000 x g pendant 10 min à température ambiante (RT).
    Remarque : Le volume du compartiment de rétention doit être ~ 50 µL dans chaque unité de concentration.
  4. Jeter le débit à travers. Ajouter 250 µL de le vDNA recuit restant à chaque unité de filtration. Répéter le spin et jeter le débit à travers. Laver trois fois avec 450 µL T’un tampon change en tampon TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, EDTA 1 mM).
  5. Inverser l’unité de filtration et un essorage à 1 000 x g pendant 2 min à température ambiante. Le volume de rétentat final pour chaque unité de filtration doit être ~ 50 µL. combiner le retentates et le transfert dans un tube à bouchon à vis 1,5 mL.
  6. Mesurer l’absorbance de 260 nm rayons ultraviolets (UV) de le vDNA. Utilisez cette valeur pour calculer la concentration molaire finale en ADN. Le coefficient d’extinction (ε260) de cette vDNA est 622 803 cm-1 M-1 , et son poids moléculaire est de 23 972 da. conserver à-20 ° c.

2. Intasome l’Assemblée

  1. Si possible, effectuer l’assemblage intasome dans une petite pièce avec un thermostat réglable. Réglez le thermostat à environ 18-22 ° c.
    Nota : Dans notre expérience, assemblage d’intasome à 4 ° c est inefficace.
  2. Préparer 1 L de tampon de dialyse (20 mM au propane Bis-tris, pH 7.5, 200 mM NaCl, 2 mM le dithiothréitol (DTT), 25 µM ZnCl2) dans un bécher de 2 L avec une barre de remuer sur une plaque de remuer. Equilibrer la mémoire tampon dans la salle des 18-22 ° c pendant au moins 6 h.
  3. Pour assembler l’intasomes, combiner propane 50 mM Bis-tris, pH 7.5, 500 mM NaCl, 120 µM en PVF et 50 vDNA µM dans un volume total de 150 µL.
    Remarque : La PFV IN devraient être libre de contaminer la nucléase activité7,8. Si la concentration de PFV IN est trop diluée pour accueillir 120 µM IN 150 volume µL, alors il est possible d’augmenter le volume final de 200 µL. Les facteurs critiques de cette étape sont de maintenir le rapport molaire de po à vDNA (2.4:1) et d’avoir suffisamment complexe pour visualiser pendant la chromatographie.
  4. Nettoyer un long morceau de ~ 10 cm de tube à dialyse MWCO 10 mm 6-8 kDa et de clips avec eau bidistillée (ddH2O), ou l’eau de pureté le plus élevée disponible. Fixez une extrémité de la tubulure.
    Remarque : Le tube à dialyse doit être manipulé avec soin afin d’éviter toute contamination possible de l’espace de laboratoire.
  5. Faire 15 mL de tampon de rinçage tubes dialyse (propane 50 mM Bis-tris, pH 7.5, 500 mM NaCl). Rincez l’intérieur de la tuyauterie de dialyse trois fois avec 1-2 mL de tampon de rinçage. Enlevez autant de la mémoire tampon de rinçage possible avec une pipette et mince gel de chargement de pointe.
  6. Si nécessaire, utilisez une lame de rasoir propre ou un scalpel pour couper le tube de dialyse afin qu’une pointe de gel mince chargement peut atteindre l’extrémité de la tubulure.
  7. Transférer l’Assemblée intasome d’étape 2.3 à la tuyauterie de dialyse avec une pipette et un gel mince pointe de chargement. Fixez l’extrémité ouverte du tube dialyse, réduisant au minimum la quantité d’air introduite dans le tube. Placer le tube dans le tampon de la dialyse.
  8. Dialyser pendant la nuit (16-20 h) avec doux, en remuant pour que le tube tourne mais n’est pas dans un tourbillon. Assurez-vous que le tube à dialyse est submergée et mobiles. Après environ une heure, observer un précipité visible à l’intérieur de la tuyauterie.
    Remarque : Avec Cy3 et Cy5 fluorescent étiqueté vDNA, le précipité est plus évident. Cela est vrai pour fin étiquetée et vDNA fluorescent étiqueté en interne.

3. solubilisation de Intasome

  1. Préparer deux grand alésage pointes de pipette en enlevant les 2-4 mm de l’extrémité d’une pointe 200 µL avec une lame de rasoir ou un scalpel Neuve sur une surface propre.
    Remarque : Les conseils serviront à l’étape 3.3 et 3.5.
  2. Retirez la tubulure de dialyse de la mémoire tampon de dialyse. Afin d’éviter la dilution de l’échantillon d’intasome avec le tampon de dialyse qui peut-être demeurer à l’extrémité du tuyau près de l’attache, utiliser une micropipette avec un petit bout de pipette pour enlever tout excès de dialyse de tampon. Retirer le clip d’une extrémité de la tubulure de la dialyse.
  3. Utiliser une échelle ennuyée de pipette d’étape 3.1 pour transférer l’échantillon, y compris le précipité à l’intérieur de la tuyauterie de dialyse dans un tube de 1,5 mL sur la glace. Noter le volume total des matières récupérées ; le volume total est généralement ~ 140 µL.
  4. L’échantillon avec le précipité est à 200 mM NaCl ; augmenter le sel à une concentration finale de 320 mM NaCl en ajoutant le volume approprié d’une solution de NaCl 5 M mère. Par exemple, pour un échantillon de 150 µL, ajouter 3,9 µL 5 M NaCl et 1,1 µL ddH2O pour un volume final de 155 µL. transfert seau à glace avec l’échantillon dans une chambre froide de 4 ° c.
  5. Utiliser une échelle ennuyée de pipette d’étape 3.1 à resuspendre et solubiliser le précipité de pipetage. Répétez toutes les 20 min pour au moins 1 h. Observe que la plupart du précipité aille dans la solution.
    NOTE : Pipetage pour remettre en suspension le précipité peut être arrêté lorsqu’il apparaît que le précipité est n’est plus nettement réduit entre points dans le temps. Lorsque vDNA n’est pas étiquetée ou est étiqueté à l’interne, le précipité est réduit de ~ 90 % pour une inspection visuelle. Dans le cas de fin de Cy5 étiqueté vDNA, le précipité est réduit de seulement environ 20 % ; la plupart du précipité avec un fluorophore fin étiquetée vDNA ne sera pas solubiliser. La quantité de précipité qui est effectivement solubilisée est variable et il convient de déterminer empiriquement.

4. Intasome Purification

  1. Préparer 250 mL de chromatographie d’exclusion (s) tampon (propane de 20 mM Bis-tris, pH 7.5, 320 mM NaCl, 10 % de glycérol). Filtre stérile le tampon avec un 0,2 µm filtre unité et conserver à 4 ° c.
    Remarque : Toutes les étapes de purification sont effectuées dans une chambre froide de 4 ° c.
  2. Equilibrer une colonne d’agarose réticulée SEC (diamètre = 10 mm ; longueur = 300 mm ; lit volume = 24 mL ; volume de l’échantillon = 25-500 µL ; pression maximale = 1,5 MPa ; limite d’exclusion = 4 x 107 Da ; sépare les poids moléculaires entre 5 et 5 000 kDa, voir le tableau de Mat erials) avec un tampon SEC en cours d’exécution à un débit de 0,4 mL/min.
    Remarque : Cette purification peut-être être adaptée aux colonnes d’exclusion de taille différente si ils sont capables de séparer efficacement 300 kDa de 44 kDa, tels que Superose 12 10/300 GL ou Superose 6 augmenter. Superose 12 10/300 GL a une résolution inférieure, conduisant à plus de chevauchement des pics. À l’inverse, augmenter de 6 Superose a une résolution plus élevée et offre la meilleure séparation.
  3. Centrifuger l’échantillon d’intasome dans un microtube à 14 000 x g pendant 10 min à 4 ° c à n’importe quel précipité restante à pellets. Retirer délicatement le surnageant. Charger le surnageant à une boucle d’injection de 200 µL (tube pouvant accueillir environ 200 μL). Déposer l’échantillon à la colonne de la SEC.
    NOTE : Petits volumes de charge permettent une plus grande résolution par SEC.
  4. Éluer avec 25 mL SEC en cours d’exécution de la mémoire tampon et recueillir 95 fractions de 270 µL. Observez que le chromatogramme SEC affiche trois A280/a260 pics (Figure 1).
    Remarque : Le premier devrait être un agrégat (~9.0 - élution 11,5 mL), suivi de la PFV tétramère intasome peak (~12.0 - élution de 14,75 mL) et le monomère PFV en libre vDNA PIC (~15.0 - 18,0 mL).

5. intégration Strand transfert Assay, Fraction sélection et stockage

  1. Combiner 2 µL de chaque fraction de pointe intasome et 50 ng 3KO supercoiled l’ADN plasmidique (concentration en stock est de 50 ng/µL) dans un tampon de réaction (10 mM tris-Bis propane, pH 7.5, 110 mM NaCl, 5 mM MgSO4, 4 µM ZnCl2, 10 mM TNT) dans un volume de réaction finale de 15 µL. Incuber à 37 ° c pendant 5 min.
  2. Inclure un contrôle négatif avec aucun intasome PFV ajouté. Arrêter la réaction avec 0,75 protéinase µL K (20 mg/mL de solution) et 0,75 µL SDS (solution mère à 10 %). Incuber à 55 ° c pour les échantillons de magasin 1 h. au besoin à-20 ° c pour les analyses ultérieures.
    Remarque : Ce test est une évaluation qualitative de l’activité d’intégration. La concentration molaire d’intasome de chaque fraction n’est pas déterminée avant cet essai. Inclus dans l’essai de transfert de brin intégration de fractions peuvent être stockées sur la glace (y compris le stockage pendant la nuit) jusqu'à l’intégration, l’activité est confirmée et fractions sélectionnées sont aliquotées. Ici, nous utilisons pMP2, un dérivé de pUC199. Nous avons utilisé aussi avec succès la 5,4 Ko plasmide pcDNA 3.1. Un plasmide qui peut être résolu en détendue cercle, linéaire, et formes surenroulés peuvent être utilisés comme une cible pour l’intégration.
  3. Préparer un poids de 1 % de 120 mL par gel d’agarose volume (p/v) dans un tampon TAE X 1 (40 mM Tris-acétate, EDTA 1 mM) avec 0,1 μg/mL d’éthidium bromure (bromure d’éthidium, 10 mg/mL de solution)10. Faire fondre la solution d’agarose et versez-la dans un bac de coulage de gel 15 x 10 cm. Insérer un peigne 15 puits avec 5 mm larges, 0,75 mm épais wells.
    NOTE : Puits étroits rendement meilleure résolution de bande par rapport aux puits épaisseur 1,5 mm.
  4. Laisser le gel à se solidifier à température ambiante. Immerger le gel en 1 X TAE avec 0,1 μg/mL de bromure d’éthidium.
  5. Ajouter 3 µL 50 % de glycérol à chaque réaction d’intégration de l’étape 5.2. Charger la totalité du réactionnel au gel. Charge 1 µL de marqueur de taille d’ADN 10Ko (concentration stock de 150 ng/µL) aux voies de chaque côté des échantillons ; en d’autres termes, le marqueur de taille d’ADN devrait flanquent les voies de l’échantillon.
  6. Dans un couloir extérieur, charger 6 µL Orange G de colorant (0,25 % G Orange, 30 % de glycérol). Exécutez le gel à tension constante, 10 V/cm (100 V) à température ambiante pendant 1 heure ou jusqu'à ce que le front de colorant Orange G arrive à la fin du gel.
  7. L’image immédiatement le gel d’agarose avec un scanner fluorescent défini pour détecter le bromure d’éthidium (532 nm excitation, 610 nm-filtre d’émission). Si fluorophore étiqueté vDNAs ont été utilisé, aussi image avec les paramètres appropriés de fluorophore.
    NOTE : par exemple, pour détecter les Cy5 intitulée ADN, image à l’aide d’une excitation 633 nm et filtres de d’émission 670 nm. Produits d’intégration concertée (CI, ADN linéaire) doivent tourner fidèle à taille ~ 3 Ko, n’ayant pas réagi surenroulé plasmide (SC) doit s’exécuter plus rapidement (~ 2 Ko) et produits d’intégration de moitié-site (HSI, détendue cercle ADN) doivent s’exécuter plus lentement (~3.5 Ko). VDNA n’a pas réagi doit tourner fidèle à taille ~ 40 bp.
  8. Quantifier les bandes sur chaque voie avec imagerie logiciel7. Calculer la fraction d’ADN dans chaque couloir qui est CI, HSI ou SC ; vDNA n’est pas inclus dans ce calcul.
    NOTE : L’efficacité de l’intégration ou la fraction du SC converti à un produit linéaire, a été calculée en divisant le volume de pixel de produits d’intégration concertée (CI) par le volume total de pixel de trois bandes (HSI + CI + SC). Si intasomes sont fluorophore étiqueté, les produits HSI et CI peuvent également être dosés par fluorescence.
  9. Sélectionnez les fractions qui ont l’activité d’intégration plus concertée.
    NOTE : D’après notre expérience, l’activité d’intégration de pointe concertée coïncide avec le pic de protéines identifié comme tétramère PFV intasomes. Mesurer l’A280 de chacune de ces fractions et calculer la concentration finale intasome. Le ε280 pour un tétramère de type sauvage PFV IN avec deux vDNAs décrite ici est 908 339 cm-1M-1 et le poids moléculaire est 225,5 kDa. Les concentrations devraient suivre le même modèle que le pic du chromatogramme SEC et dans l’analyse de transfert de brin.
  10. Distribuer à chaque fraction de 5 µL d’extraits et d’enclencher congélation dans l’azote liquide. Stocker les aliquotes à-80 ° c. Sélectionné pour le stockage de fractions sont généralement entre 200-600 nM.

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Résultats

PFV intasomes sont assemblés à partir de recombinaison IN et vDNA. Après le montage, les intasomes sont purifiés par SEC (Figure 1). Activité d’intégration de chaque fraction est analysée avec une supercoiled l’ADN cible et agarose électrophorèse sur gel (Figure 2). Ce gel est photographié avec un scanner fluorescent défini pour détecter le bromure d’éthidium (et un fluorophore, si vDNA marqués au fluorophore est utilisé). À l’ai...

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Discussion

INs retroviral forment un complexe avec l’ADN génomique viral pour effectuer une intégration et continuer le cycle de vie viral multimère. Le nombre de monomères par intasome peut être tétramères, octamères ou éventuellement plus élevés ordre multimères11,12,13,14. PFV intasomes sont un tétramère de recombinaison avec des oligomères d’ADN double brin qui imitent l’ADN génomique viral termine

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par les NIH AI099854 et AI126742 à clé.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Oligomères d’ADNIDTN/AOligos d’ADN personnalisés
Tris Ultra PureGojira Produits chimiques finsUTS1003
NaClP212121RP-S23020
UltraPure EDTAInvitrogen/Gibco15575
Amicon Ultra 0,5 mL Filtres centrifugesSigma-AldrichZ677094-24EA3 kDa MWCO
DTTP212121SV-DTT
BIS-TRIS propane,>=99,0 % (titrage)Sigma-AldrichB6755-500G
ZnCl2Sigma-Aldrich208086
MgSO4Amresco0662
GlycérolThermo Fisher ScientificG37-20
Embouts de chargement, 1 - 200 &mu ; LCorningCLS4853-400EA
Lame de rasoir ; Tranchant unique ; 100/pqt. ; Paquet de 100Fisher Scientific12-640
Unités de filtration stériles jetables avec membrane PES > 250mLThermo Fisher Scientific568-0020
Pinces de dialyseSpectrum Labs132734
6-8 kDa 10 mm Tube de dialyseSpectrum Medical132645
Superose 6 10/300 GLGE Healthcare Life Sciences17517201
Hi-Res Standard AgaroseAGTC BioproductsAG500D1
Bromure d’éthidiumThermo Fisher ScientificBP1302
Orange GFisher Scientific0-267
Hyladder 10kb, 500 voiesDenville ScientificCB4225-4

Références

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