Articolo metodologico
In questa carta, discutiamo tre preparazioni di cervello usate per la registrazione di tutta la cella patch clamp per studiare il circuito retinotectal di girini di Xenopus laevis . Ogni preparazione, con i suoi specifici vantaggi, contribuisce alla trattabilità sperimentale il girino di Xenopus come modello per studiare la funzione del circuito neurale.
Il circuito di retinotectal girino di Xenopus , comprende le cellule retiniche del ganglio (RGCs) nell'occhio che formano le sinapsi direttamente sui neuroni nel tectum ottica, è un modello popolare di studiare circuiti neurali come auto-assemblarsi. La capacità di svolgere tutta la cella le registrazioni del morsetto di patch da neuroni tectal e per registrare le risposte evocate RGC, entrambi in vivo o usando una preparazione di tutto il cervello, ha generato un grande corpo dei dati ad alta risoluzione circa i meccanismi di fondo normale e anormale, circuito formazione e funzione. Qui descriviamo come eseguire la preparazione in vivo , la preparazione originale di tutto il cervello, e più recentemente sviluppato preparazione di fetta di cervello orizzontale per ottenere le registrazioni a cellula intera patch clamp da neuroni tectal. Ogni preparazione ha vantaggi unici sperimentali. La preparazione in vivo permette di registrare la risposta diretta dei neuroni tectal agli stimoli visivi proiettato sull'occhio. Permette la preparazione di tutto il cervello per gli assoni RGC deve essere attivata in modo altamente controllato, e la preparazione di fetta di cervello orizzontale permette la registrazione da attraverso tutti gli strati del tectum.
Il circuito di retinotectal è il componente principale del sistema visivo anfibio. Si compone di RGCs nell'occhio, che proiettano i loro assoni al tectum ottica dove formano connessioni sinaptiche con neuroni postsinaptici tectal. Il circuito di retinotectal girino Xenopus è un popolare modello di sviluppo per studiare la funzione e la formazione di circuiti neurali. Ci sono molti attributi del circuito retinotectal di questo girino che lo rendono un potente modello sperimentale1,2,3. Un attributo importante e il focus di questo articolo, è la capacità di effettuare ....
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Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) dell'Università del Wyoming. Tutte le procedure, comprese le registrazioni elettrofisiologiche, sono effettuate a temperatura ambiente, circa 23 ° C. Tutti i metodi descritti qui sono ottimizzati per la registrazione di neuroni tectal da girini tra fase inerente allo sviluppo 42 e 49 (rappresentata nel secondo Neiuwkoop e Faber15).
1. preparazione in Vivo
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Per registrare le risposte evocate luce un lampo di tutto il campo di luce viene proiettato la retina, mentre la risposta risultante viene registrata da singoli neuroni tectal (Figura 4A). Questo particolare protocollo è progettato per misurare sia la risposta del neurone alla luce accensione ("On" risposta) e quindi spegnendo 15 s più tardi per misurare la "risposta fuori." Neuroni tectal esibiscono tipicamente robusto e disattivare le rispo.......
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Tutti i metodi descritti in questo lavoro sono ottimizzati per la registrazione di neuroni tectal da girini tra fase inerente allo sviluppo 42 e 49 (rappresentata nel secondo Neiuwkoop e Faber15). Dalla fase 42, i girini sono sufficientemente grandi e sufficientemente sviluppati affinché i perni degli insetti possono essere posizionati su entrambi i lati del cervello per le registrazioni in vivo e di eseguire la dissezione del cervello intero. Nelle fasi precedenti, quando i girini sono e.......
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Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Supportato dalla concessione NIH SBC COBRE 1P20GM121310-01.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Stemi Stereo 508 | Zeiss | 495009-0006-000 | Microscopio da dissezione |
| MS-222 "Tricane" | Finquel | ARF5G | Anestetico generale anfibio |
| Cloruro di sodio (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | Utilizzato per preparare la soluzione di Stienberg e la soluzione esterna |
| Cloruro di potassio (KCl) | Fisher Scientific | P217-500 | Utilizzato per preparare la soluzione di Stienberg e la soluzione esterna |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-1KG | Utilizzato per preparare la soluzione di Stienberg e la soluzione esterna |
| Tetrairato di nitrato di calcio (Ca(NO3)&toro; 4H2O) | Sigma-Aldrich | 237124-500G | Utilizzato per preparare la soluzione di Stienberg |
| Solfato di magnesio (MgSO4) | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Utilizzato per preparare la soluzione di Steinberg |
| Cloruro di calcio (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | Utilizzato per preparare la soluzione di registrazione esterna |
| Cloruro di magnesio (MgCl2) | J.T. Baker | 2444-01 | Utilizzato per preparare la soluzione di registrazione esterna |
| D-glucosio anidro | Mallinckrodt Sostanze chimiche | 6066-04 | Utilizzato per preparare la soluzione di registrazione esterna |
| Tubocurarina cloridrato pentaidrato | Sigma | T2379 | Antagonista nicotinico del recettore dell'acetilcolina |
| Perni per insetti Strumenti di | scienza fine 26002-10 | Perni in acciaio inossidabile di diametro 0,1 mm Kit | |
| elastomero siliconico Sylgard 184 | Dow Corning | 761028 | Kit monomero e agente indurente prepesato |
| Piastra di Petri sterile in polistirene - 60x15mm | Fisher Scientific | AS4052 | Piccole piastre di Petri |
| Ago PrecisionGlide 25Gx5/8 (0,5 mm X 16 mm) | BD | 305122 | Aghi per siringhe |
| 1mL Slip Tip Siringa di tubercolina | BD | 309659 | Siringhe sterili monouso Pipetta in |
| vetro borosilicato | Strumento Sutter | BF150-86-10HP | Tirato secondo le specifiche desiderate utilizzando la macchina per l'estrazione delle pipette |
| Estrattore per micropipette fiammeggiante/marrone | Sutter Instruments | P-97 | Fabbrica micropipette per la registrazione elettrofisiologica |
| Kimwipes Salviette | Kimtech Kimberly-Clark | 34120 | Delicate |
| Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7B | Molecular Devices | 1-CV-7B | Pinza amperometrica e pinza di tensione |
| Headstage MP-285 Manipolatore motorizzato con controller da tavolo | Sutter Instrument | MP-285/T | Controllo per headstage su impianto di elettrofisiologia |
| LED accoppiato a fibra (verde) | Thorlabs | M530F2 | Cavo in fibra ottica abbinato a LED verde |
| Elettrodo bipolare a grappolo (25µ FHC | 30207 | Elettrodo stimolante bipolare | |
| Stimolatore ISO-Flex | A.M.P.I. (Israele) | Contatta il produttore | Isolatore di stimolo flessibile |
| Axon Instruments 700B Amplificatore Multipatch | Molecular Devices | 2500-0157 | Amplificatore per la registrazione di voltage- e current-clamp |
| Digidata 1322A digitalizzatore | Molecular Devices | 2500-135 | Sistema di acquisizione dati per la registrazione elettrofisiologica |
| Axio Examiner.A1 | Zeiss | 491404-0001-000 | Microscopio per elettrofisiologia |
| Tavolo da laboratorio Micro-g | TMC | 63-533 | Tavolo ad aria per microscopio per elettrofisiologia |
| Inspiron 620 Personal Desktop Computer con Windows 7 64-bit | Dell | D06D001 | Computer con software di elettrofisiologia |
| c2400 Telecamera CCD | Hamamatsu | 70826-5 | Telecamera per dispositivo ad accoppiamento di carica per imaging elettrofisiologico |
| Lame da barba in acciaio inossidabile Super Platinum a ore 7 | Gillette | CMM01049 | Lame di rasoio in acciaio inossidabile rivestite di platino |
| Pipette di trasferimento | Fisher Scientific | 13-711-7M | Pipette di trasferimento monouso in polietilene |
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